廣西芒果細菌性壞死病病原菌鑒定

陳小林 孫秋玲 黃穗萍 唐利華 郭堂勛 莫賤友 任惠 李其利

摘要

芒果Mangifera?indica?L.是我國著名的熱帶水果，近年來細菌性病害發生嚴重。2020年－2021年對廣西百色地區的芒果病害進行調查發現，一種細菌性壞死病與細菌性黑斑病混合發生，一般發病率30%～60%，嚴重可達90%以上。本研究先后從該地區不同芒果壞死病組織中分離得到泛菌屬的21株細菌。根據形態、生理生化特性、16S?rDNA、fusA、gyrB、leuS、pyrG、rlpB和rpoB的多基因系統發育分析、致病性測定等方法將21個菌株分別鑒定為Pantoea?vagans、P.anthophila、P.?dispersa?和P.?cypripedii。其中P.anthophila、P.?dispersa?和P.?cypripedii引起芒果細菌性壞死病是中國首次報道。

關鍵詞

芒果;?細菌性壞死病;?泛菌屬

中圖分類號：

S?432.1

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022772

Identification?of?the?pathogen?causing?mango?bacterial?necrotic?disease?in?Guangxi

CHEN?Xiaolin1，?SUN?Qiuling1，?HUANG?Suiping1，?TANG?Lihua1，?GUO?Tangxun1，MO?Jianyou1，?REN?Hui2*，?LI?Qili1*

（1.?Institute?of?Plant?Protection，?Guangxi?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Key?Laboratory?of?Green?Prevention?

and?Control?on?Fruits?and?Vegetables?in?South?China，?Ministry?of?Agriculture?and?Rural?Affairs，?Guangxi?Key?

Laboratory?of?Biology?for?Crop?Diseases?and?Insect?Pests，?Nanning?530007，?China;?2.?Institute?of?Horticulture，?

Guangxi?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Nanning?530007，?China）

Abstract

Mangifera?indica?L.?is?one?of?the?wellknown?fruits?in?China.?Bacterial?diseases?have?been?occurring?seriously?in?recent?years.?A?bacterial?necrotic?disease?mixed?with?bacterial?black?spot?disease?on?mango?was?observed，?with?an?incidence?rate?of?30%-60%，?even?up?to?90%，?in?our?investigation?of?mango?diseases?in?Baise，?Guangxi?from?2020?to?2021.?Twentyone?isolates?belonging?to?the?genus?Pantoea?were?successively?isolated?from?the?mango?necrotic?tissues?in?investigation?region?in?this?study.?The?isolates?were?identified?as?four?species：?Pantoea?vagans，?P.anthophila，?P.?dispersa?and?P.?cypripedii?based?on?the?morphological，?physiobiochemical?characteristics，?16S?rDNA?sequence，?phylogenetic?analysis?of?fusAgyrBleuSpyrGrlpBrpoB?concatenated?sequences?and?pathogenicity?test.?This?is?the?first?report?of?necrotic?disease?caused?by?P.anthophila，?P.?dispersa?and?P.?cypripedii?in?mango?in?China.

Key?words

Mangifera?indica;?bacterial?necrotic?disease;?Pantoea

芒果Mangifera?indica?L.是著名的熱帶果樹，主要種植于印度、中國和泰國等熱帶和亞熱帶國家［12］。2020年廣西芒果種植面積11.2萬hm2，產量近95萬t，為我國第一大芒果產區［3］。隨著品種結構改變和氣候變化，芒果細菌性病害發生日益增多，近年呈加重趨勢，嚴重影響芒果產量和品質，制約廣西芒果產業健康發展［4］。

已報道引起芒果細菌性病害的病原菌，主要包括引起芒果細菌性黑斑?。ㄓ址Q芒果細菌性角斑?。┑母涕冱S單胞菌芒果致病變種Xanthomonas?citri?pv.?mangiferaeindicae［56］，引起芒果細菌性頂端壞死病的丁香假單胞菌Pseudomonas?syringae?pv.?syringae［7］，引起芒果葉斑病的樹生黃單胞菌X.arboricola［8］，引起芒果細菌性干枯病的血紅鞘氨醇單胞菌Sphingomonas?sanguinis［910］和引起芒果細菌性壞死病的泛菌屬細菌Pantoea?ananatis［11］、P.agglomerans［12］?和P.vagans［13］等種類。

2020年－2021年對廣西芒果主產地百色田東縣、田陽縣、右江區和田林縣不同果園的病害進行調查，發現芒果上發生一種類似于細菌性黑斑病的壞死病，兩者?；旌习l生，一般株發病率30%～60%，嚴重時可達90%以上。為明確該病害的病原菌，本研究對田間采集的病害樣品進行病原菌的分離、純化、培養，并采用形態學觀察和生理生化特性、致病性測定、多基因系統發育分析等方法對分離物進行鑒定，旨在明確廣西細菌性壞死病的病原菌種類和優勢種群，為深入研究其發生規律和防治技術提供參考。

1?材料與方法

1.1?病害調查及病樣采集

2020年－2021年在廣西芒果主產地百色地區不同種植區（田東縣、田林縣、田陽縣和右江區）采集不同品種芒果上類似細菌性黑斑病的壞死病樣品。

1.2?病原菌的分離與純化

選取葉片或果實病樣，切取病健交界處組織（5?mm×5?mm），75%乙醇浸泡10?s，2%次氯酸鈉浸泡1?min，滅菌水沖洗3次，置于研缽中，加入少量石英砂和1?mL滅菌水進行充分研磨，吸取100?μL上清液至分裝有900?μL滅菌水的1.5?mL離心管進行系列梯度稀釋，吸取10-3～10-6梯度各100?μL涂布于LB固體平板上，28℃恒溫培養箱中培養，每份樣品選擇不同菌落形態的代表性菌株1株進行保存。

1.3?病原菌鑒定

1.3.1?菌株的分子生物學鑒定

將分離菌株在LB液體培養基中培養24?h，采用細菌基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取菌株總DNA。利用細菌16S?rDNA的通用引物27F（5′GAGTTTGATCCTGGCTCAG3′）和1492R（5′CGGCTACCTTGTTACGACTT3′）對36株供試菌株基因組DNA進行PCR擴增［14］。20?μL?PCR反應體系：2×PCR?buffer?（plus?Mg2+）10?μL，dNTPs（2.5?mmol/L）0.5?μL，DNA模板1?μL，上、下游引物（10?μmol/L）各1?μL，Taq?酶（5?U/μL）0.1?μL，ddH2O?6.4?μL。PCR反應條件為94℃預變性3?min;94℃變性45?s，57℃退火45?s，72℃延伸1?min，35個循環;72℃延伸5?min。泛菌多位點序列包括延伸因子EFG基因（fusA）、DNA促旋酶基因（gyrB）、亮氨酰tRNA合成酶基因（leuS）、CTP合成酶基因（pyrG）、脂蛋白基因（rlpB）和RNA聚合酶β亞基基因（rpoB）的擴增引物信息、退火溫度及擴增產物大小見表1［15］。PCR擴增產物用1.2%瓊脂糖凝膠檢測條帶后，產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結果提交NCBI在線網站進行相似性比對，使用MEGA?X的最大似然法構建系統發育樹，確定近緣細菌菌株的分類地位。

1.3.2?形態與生理生化特性鑒定

將分離菌株接種于LB固體培養基上，28℃培養2?d，觀察菌落形態、大小、顏色、表面及邊緣形態、透明度等特征;對細菌進行革蘭氏染色，觀察染色結果。參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》（第8版）進行生理生化特性測定：3%耐鹽性、氧化酶和過氧化氫酶活性、硝酸鹽還原試驗、淀粉水解、明膠液化、硫化氫的產生以及碳源（蔗糖、D果糖、葡萄糖、α半乳糖、麥芽糖和甘露醇）利用等。

1.4?菌株的致病性測定

每個種選取代表性菌株1株進行致病性測定。將菌株接種于LB液體培養基28℃培養過夜，收集菌體，無菌水重懸并調節OD600=0.1。選取‘玉文’芒果新梢上的健康葉片，用無菌注射器針頭對葉片進行輕微刺傷后，將滅菌脫脂棉蘸取菌液接種于葉片背面，28℃保濕培養48?h。以接種本研究分離的芒果細菌性黑斑病菌為對照，無菌水為空白對照。定時觀察記錄發病情況。采用相同的方法對‘玉文’芒果果實進行離體接種，測定菌株致病性。果實接種前依次用75%乙醇清洗10?s，2%次氯酸鈉1?min，無菌水清洗3次，晾干，然后采用無菌注射器針頭對4個位置進行刺傷，每個位置刺傷8個傷口，將滅菌脫脂棉蘸取菌液接種于刺傷位置，28℃保濕培養48?h。對接種后發病的芒果組織進行病原菌再分離、純化與鑒定，完成柯赫氏法則驗證?？瞻讓φ詹捎猛瑯拥姆椒ㄟM行處理。

2?結果與分析

2.1?病害調查與病原菌分離

2020年－2021年間田間調查發現，廣西百色田東縣、田陽縣、右江區和田林縣不同果園的芒果上發生一種類似于細菌性黑斑病的壞死病。葉片感病初期產生水漬狀小點，后期逐漸擴展成多角形或不規則形狀的黑褐色病斑，周圍伴有黃暈圈（圖1a～e）;果實感病初期主要表現為褐色小點，后期擴展成表面隆起的黑褐色病斑，嚴重時病斑潰瘍開裂且有汁液溢出（圖1f～j）。先后從不同果園采集病害樣本28份，經組織表面消毒、研磨和稀釋分離，每份樣品選擇不同菌落形態的代表性菌株1株進行保存，共獲得36株細菌（表2，圖1k～o）。

2.2?菌株的分子生物學鑒定

利用細菌通用引物27F/1492R對菌株的16S?rDNA序列進行擴增、測序，將獲得的序列在NCBI進行BLASTn同源性比對。對36個供試菌株16S?rDNA序列進行系統發育分析，結果表明，36個菌株中，15個菌株的16S?rDNA序列與芒果細菌性黑斑病菌的相應序列一致性最高，達99.5%以上，與黃單胞菌屬不同種聚在一個大分支，另外21個菌株的16S?rDNA序列與泛菌屬Pantoea的相應序列一致性最高，達99%以上，與泛菌屬不同種聚在另一個大分支（圖2）。進一步克隆、測序泛菌屬21個菌株的6個基因片段（fusA、gyrB、leuS、pyrG、rlpB和rpoB），并進行BLASTn同源性比對。利用MEGAX軟件的最大似然法（maximum?likelihood，ML）構建6個基因串聯序列的系統發育樹（圖3）。

結果表明，以Tatumella?terrea為外群，21個菌株分別聚在4個不同的分支，被鑒定為4個種：P.vagans、P.anthophila、P.dispersa和P.cypripedii。其中，?8個菌株為P.vagans，占比38%，是優勢種。菌株的分離和鑒定結果表明，同一樣品存在泛菌屬不同種或泛菌屬與細菌性黑斑病菌混合發生的情況（表2）。

2.3?菌株的形態和生理生化特性

泛菌屬4個種的供試菌株具有以下共同的特征：菌落黃色，均為革蘭氏陰性菌，能在3%鹽濃度下生長，氧化酶陰性，過氧化氫酶陽性，不能還原硝酸鹽，可以降解淀粉，能利用蔗糖、D果糖、葡萄糖、α半乳糖、甘露醇作為碳源。此外，4個種供試菌株均不具有明膠液化能力，但可以產生硫化氫;除P.?vagans，泛菌屬其他3個種均可以利用麥芽糖作為碳源;除P.cypripedii外，其他3個種甲基紅反應均為陽性（表3）。

2.4?致病性測定

分別選取4個種的代表性菌株各1株進行致病性測定。對‘玉文’芒果新梢上的健康葉片采用刺傷接種供試菌懸液，28℃保濕培養48?h。結果顯示，接種5?d后，葉片開始出現針狀褐色小點，接種15?d后，不同種菌株接種葉片的發病程度不同，但發病癥狀與田間自然發病的癥狀基本一致（圖4a～f）。采用相同的方法對‘玉文’果實離體接種進行菌株致病性測定。結果顯示，接種果實7?d后，發病癥狀與田間自然發病的癥狀相似（圖4g～l）。從發病組織中重新分離病原菌，經純化和分子鑒定，分離到與供試菌株同種細菌，驗證了科赫氏法則。

3?結論與討論

本研究通過形態學、生理生化特性、分子鑒定與致病性測定的方法明確了廣西百色芒果細菌性壞死病的4種病原菌屬于泛菌屬，其中優勢種為Pantoea?vagans，占比38%。其次為P.anthophila、P.cypripedii和P.dispersa。目前芒果上已相繼報道泛菌屬P.ananatis、P.agglomerans和?P.vagans為芒果細菌性壞死病的病原菌［1113］。本研究為國內外首次報道泛菌屬P.anthophila、P.dispersa和P.cypripedii引起芒果細菌性壞死病。2020年和2021年的調查發現，該病害在廣西百色發生普遍，且常與芒果細菌性黑斑病混合發生，容易被忽略或混淆，值得進一步關注。

植物病原細菌傳統的分類依據主要是表型特征和生理生化特性，前者包括菌落形態、細菌革蘭氏染色觀察、致病性等。由于有些重要分類特征的重疊和環境的影響，遺傳關系較近的小種、亞種及致病變種等往往難以區分，給病原菌的快速準確鑒定帶來諸多困難［16］。本研究中生理生化特性結果也證實其無法有效區分泛菌屬4個不同種。隨著分子生物學的快速發展，現代細菌分類已進入多相分類（polyphasic?taxonomy）階段［17］。16S?rRNA的基因序列是細菌分類鑒定的強有力工具，幾乎可以對所有的細菌進行屬水平上的鑒定［1819］，但由于其保守性高，不太適合種或某些近緣種的鑒定。本研究中基于16S?rDNA序列能將36株菌株進行屬水平的區分，但無法在種水平上進行有效鑒定。目前，基于fusA、gyrB、leuS、pyrG、rlpB和rpoB多位點序列分析被廣泛應用于泛菌屬細菌的分類鑒定研究中，其快速準確、重復性好，在細菌的分類鑒定中具有獨特優勢［15］。本研究結果也表明，基于fusA、gyrB、leuS、pyrG、rlpB和rpoB多基因序列能有效區分泛菌的不同種。

泛菌屬是一類基因組高度可塑的革蘭氏陰性腸桿菌科細菌，廣泛存在于水體、土壤及動植物等多種環境，目前至少包括25個種和2個亞種［20］。很多泛菌屬菌株是植物病原菌，可引起植物結瘤、萎蔫、軟腐或壞死等癥狀［12，?2122］。植物病原細菌主要是通過自然孔口或傷口入侵植物組織［23］。本研究在進行菌株致病性測定時采用刺傷接種，發現不同菌株致病性強弱存在差異，這些病原菌能否從自然孔口侵入有待進一步的研究。本研究明確P.anthophila、P.dispersa和P.cypripedii引起芒果細菌性壞死病，為后續研究該病害的發生流行學奠定基礎，為制定有效的防控策略提供理論依據。

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