西番蓮中夜來香花葉病毒實時熒光定量PCR檢測方法的建立及應用

顧佩佩 王瑩 楊之巽 韓俊娜 黃愛軍

摘要

夜來香花葉病毒（telosma?mosaic?virus，?TeMV）是對西番蓮危害較大的一種病毒病原。根據病毒末端結合蛋白（VPg）序列設計引物，建立了以Vpg334F/506R為特異性引物，退火溫度54℃，引物濃度0.6?μmol/L的SYBR?Green?Ⅰ實時熒光定量PCR檢測方法。該方法可特異性擴增TeMV基因組6?483～6?675?nt區域，所得標準曲線擴增效率為102.77%，決定系數為0.996?1，最低檢測濃度為2.370×102?拷貝/μL，靈敏度是普通PCR的1?000倍。應用該方法對接種TeMV的西番蓮進行檢測，發現接種3?d后可在葉片中檢測到TeMV，定量分析不同溫度下TeMV在葉片中的積累，發現26～28℃下病毒積累速度最快，且植株癥狀表現與病毒積累量密切相關。對贛南地區采集的76份西番蓮田間樣品進行檢測，共檢出71份陽性樣品，檢出率為93.4%。綜上，本研究建立的實時熒光定量PCR方法特異性強，靈敏度高，適于TeMV的快速檢測。

關鍵詞

夜來香花葉病毒;?西番蓮;?實時熒光定量PCR

中圖分類號：

S?436.67

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022713

Establishment?and?application?of?a?realtime?fluorescence?quantitative?PCR?method?for?detection?of?telosma?mosaic?virus?in?Passiflora?edulis

GU?Peipei，?WANG?Ying，?YANG?Zhixun，?HAN?Junna，?HUANG?Aijun*

（College?of?Life?Sciences，?Gannan?Normal?University，?Ganzhou?341000，?China）

Abstract

Telosma?mosaic?virus?（TeMV）?is?a?devastating?virus?infecting?Passiflora?edulis?populations.?In?this?study，?the?specific?primer?pair，?Vpg334F/506R，?was?designed?based?on?the?conserved?region?of?the?viral?protein?genomelinked?（VPg）?gene?of?TeMV，?and?a?method?of?the?SYBR?Green?Ⅰbased?realtime?fluorescent?quantitative?PCR?（qPCR）?assay?was?established?with?optimal?annealing?temperature?of?54℃?and?primer?concentration?of?0.6?μmol/L，?respectively.?This?method?specifically?amplified?the?nucleotide?sequence?region?of?6?483-6?675?nt?in?the?genome?of?TeMV.?The?cycle?threshold?of?the?qPCR?standard?curve?exhibited?a?positive?linear?relationship?with?template?concentrations，?and?the?amplification?efficiency?and?R2?value?were?102.77%?and?0.996?1，?respectively.?This?method?could?detect?a?minimum?concentration?of?2.370×102?copies/μL?DNA，?which?was?1?000?folds?of?conventional?PCR?detection.?Monitoring?the?virus?accumulation?at?different?temperatures?after?inoculation?revealed?that?TeMV?could?be?detected?at?day?3?after?inoculation，?and?that?accumulated?in?leaves?could?be?more?readily?detected?at?26-28℃?than?at?other?temperatures.?The?symptoms?were?highly?correlated?with?the?content?of?virus?accumulation.?Finally，?the?developed?assay?was?used?to?detect?TeMV?in?76?passion?fruit?samples，?showing?that?the?detection?rate?of?TeMV?was?93.4%.?Thus，?this?assay?can?be?served?as?a?powerful?tool?for?detecting?TeMV?and?is?valuable?for?further?research?on?TeMV.

Key?words

telosma?mosaic?virus;?Passiflora?edulis;?qPCR

西番蓮Passiflora?edulis?Sims又名百香果，屬于西番蓮科Passifloraceae、西番蓮屬Passiflora，為多年生藤本植物，其果實營養豐富，具有較高的經濟價值，在我國主要種植于臺灣、廣東、廣西、福建、海南、云南、貴州等省區［13］。據農業農村部2018年統計，我國西番蓮種植面積已達到44?466?hm2，年產量為59.03萬t，全年總產值達到30億元［45］。病毒病害是為害西番蓮產業發展的重要因素之一。20世紀80年代，臺灣省西番蓮產業因遭到病毒病大范圍肆虐，最終導致全省西番蓮種植面積由1?392?hm2降至540?hm2，年總產量由16?020?t降至8?045?t［6］。病毒病的發生已嚴重影響西番蓮產業的發展，目前西番蓮上已報道的病毒病種類超過40種［78］。

夜來香花葉病毒（telosma?mosaic?virus，TeMV）是一種正義單鏈RNA病毒，隸屬于馬鈴薯Y病毒屬，該病毒侵染西番蓮后可引起葉片花葉、皺縮、畸形，植株矮化、衰弱，果實果皮木質化等癥狀，其可通過扦插、嫁接以及機械接種等多種途徑傳播［9］。自然條件下除西番蓮外，TeMV還可侵染夜來香Telosma?cordata［10］、翅莢決明Senna?alata［11］、廣藿香Pogostemon?cablin［12］;實驗室條件下可侵染多種豆科及莧科植物［9］。

我國于2017年在福建西番蓮上首次報道了TeMV的發生［13］。目前我國西番蓮產區TeMV發生越來越普遍，在福建、廣西和貴州等地區該病毒田間檢出率高達80%以上，對該產業的危害愈發嚴重［1415］。因此建立TeMV快速、準確的檢測方法，對該病毒的防控具有重要意義。目前已基于多種技術建立了TeMV的檢測方法，其中包括：常規?RTPCR［13］、逆轉錄環介導等溫擴增（reversetranscription?loopmediated?isothermal?amplification，RTLAMP）［16］、血清學檢測［9］等。

實時熒光定量PCR（realtime?fluorescence?quantitativ?PCR，qPCR）作為一種靈敏度高、特異性強、穩定性好的檢測技術，已廣泛應用于多種植物病毒檢測中。該方法能夠定量監測病毒在植物體內的分布情況，對于病毒生物學特性研究具有重要意義。本研究旨在建立TeMV實時熒光定量?PCR檢測方法，為?TeMV的快速檢測和病毒研究提供技術支撐。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?供試植物

以實驗室保存的單獨感染TeMV的西番蓮樣品作為qPCR引物篩選的測試樣品。試驗中所用攜帶西番蓮潛隱病毒（passiflora?latent?carlavirus，?PLV）、西番蓮嚴重花葉病毒（passion?fruit?severe?mottle?virus，?PFV）、東亞西番蓮病毒（East?Asian?passiflora?virus，?EAPV）、黃瓜花葉病毒（cucumber?mosaic?virus，?CMV）和柑橘相關彈狀病毒（citrusassociated?rhabdovirus，?CiaRV）的西番蓮樣品均保存于實驗室。田間檢測樣品于2020年分別采自江西省贛州市尋烏縣、瑞金市、于都縣及贛縣西番蓮種植園，共獲得76份表現為花葉、皺縮及畸形等疑似病毒病癥狀的西番蓮葉片，葉片樣品提取總RNA后于-80℃冰箱保存備用。

1.1.2?主要試劑與儀器

RNAeasy?Isolation?Reagent、HiScript?Ⅱ?One?Step?RTPCR?Kit購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;PrimeScriptTM?Ⅱ?1st?Strand?cDNA?Synthesis?Kit、TaKaRa?MiniBEST?Plasmid?Purification?Kit?Ver.4.0、DL?2000/5000?DNA?Marker、TaKaRa?MiniBEST?Agarose?Gel?DNA?Extraction?Kit?Ver.4.0、pMDTM19T?Vector?Cloning?Kit、DH5α?感受態細胞，購自寶生物工程（大連）有限公司;FastStart?Essential?DNA?Green?Master，購自Roche公司。

Nanodrop?2000c超微量核酸蛋白測定儀，美國Thermo?Scientific公司;?S1000TM?Thermal?Cycler，美國BioRad公司;DYY6C型電泳儀，北京六一儀器廠;JS2012型凝膠成像系統，上海培清科技有限公司;LightCycler?96?System，瑞士Roche公司;GPX250C光照培養箱，上海南榮實驗室設備有限公司。

1.2?方法

1.2.1?RNA提取及反轉錄

參照試劑盒RNAeasy?Isolation?Reagent說明書提取西番蓮葉片樣品總RNA，并于-80℃保存備用。采用反轉錄試劑盒PrimeScriptTM?Ⅱ?1st?Strand?cDNA?Synthesis?Kit合成病毒的cDNA模板。

1.2.2?引物設計與合成

根據本實驗室獲得的TeMV江西分離物TeMVXW、TeMVRJ、TeMVYD（GenBank登錄號分別為ON932194、ON932195、ON932196）以及GenBank中已報道的TeMV分離物（MK340754、MK340755、MT557572等）的病毒末端結合蛋白?（viral?protein?genomelinked，VPg）保守序列，使用引物設計軟件Oligo?7設計一對用于TeMV實時熒光定量PCR檢測的特異性引物VPg334（5′GAATTGGATAGACAAGCCAT3′）/VPg506R

（5′GAAGTGTTTGTGGCATACC3′）。本研究所得引物VPg334F/506R以及試驗中所用西番蓮內參引物C21209F（5′AGCTCTTCTACATCTGCGCT3′）/C21209R（5′TTCTTGTGCATCTTCCCCCG3′）［17］均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2.3?TeMV質粒標準品制備

以RNA為模板，利用引物VPg334F/506R通過一步法RTPCR擴增TeMV基因組的6?483～6?675?nt區域，PCR擴增產物采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。反應總體積50.0?μL：RNA模板?2.0?μL，10?μmol/L上、下游引物各1?μL，2×One?Step?Buffer?25?μL，One?Step?Enzyme?Mix?2?μL，ddH2O?19?μL。反應條件：50℃反轉錄30?min;94℃預變性4?min;94℃變性20?s，56℃退火20?s，72℃延伸20?s，共35個循環。

PCR產物用TaKaRa?MiniBEST?Agarose?Gel?DNA?Extraction?Kit回收，回收產物與pMD19T載體連接后轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑選經菌液PCR鑒定后的陽性克隆子送至蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序。選擇測序結果中序列完全正確的陽性克隆樣品，參照TaKaRa?MiniBEST?Plasmid?Purification?Kit說明書提取質粒，所得質粒命名為VPg192。利用Nanodrop?2000c超微量核酸蛋白測定儀檢測質粒純度與濃度，

并將獲得的質粒作為后續試驗的標準品。

質?？截悢涤嬎愎剑嚎截悢担截?μL）=［質粒濃度（g/μL）×10-9×6.02×1023（拷貝/mol）］/［660（g/mol）×（載體長度+片段長度）］［18］。

1.2.4?實時熒光定量PCR檢測體系的優化

以質粒VPg192為模板，進行PCR擴增，反應總體積20.0?μL：Master?mix?（SYBR?Green）10.0?μL、10?μmol/L上、下游引物（分別設置0.4、0.6、0.8?μL和1.0?μL共4個引物用量）、質粒模板1.0?μL，?ddH2O補足體系至20.0?μL。反應程序：95℃預變性10?min;95℃變性10?s;以引物的退火溫度Tm值為基礎，分別以52、52.4、53.2、54、55.1、56.2、57.3、58.2、59.1、60℃為溫度梯度，退火10?s，72℃延伸10?s，共40個循環。對擴增效率和熔解曲線進行分析，選擇合適的引物用量和退火溫度。

1.2.5?實時熒光定量PCR標準曲線的建立

用ddH2O按10倍梯度稀釋質粒標準品，濃度分別為2.370×100、2.370×101、2.370×102、2.370×103、2.370×104、2.370×105、2.370×106、2.370×107、2.370×108拷貝/μL和2.370×109?拷貝/μL。分別以這10個質粒樣品為模板，在優化后的反應條件下進行實時熒光定量PCR檢測，反應中以健康西番蓮樣品的cDNA作為陰性對照，以無酶水作為空白對照，每個樣本設置3個技術重復。反應結束后，以擴增得到的Ct值和模板質?？截悢档膶抵禈嫿藴是€。

1.2.6?實時熒光定量PCR檢測體系靈敏度和特異性檢測

以10倍梯度稀釋的質粒標準品為模板，分別進行普通PCR和實時熒光定量PCR檢測，比較兩種方法的靈敏度，質粒初始濃度為2.370×109?拷貝/μL。用經檢測后確定含有PLV、PFV、EAPV、CMV和CiaRV，但不含TeMV的cDNA樣品進行TeMV的實時熒光定量PCR特異性檢測。

1.2.7?西番蓮中TeMV的定量檢測

采用汁液摩擦接種的方法接種西番蓮實生幼苗，并以0.1?mol/L?PBS接種作為陰性對照。接種后將植株置于恒溫光照培養箱中培養，定期觀察植株發病情況。培養箱設置光周期L∥D=16?h∥8?h，分組設置3個不同溫度條件：低溫組夜間最低溫為17℃，白天最高溫為19℃;中溫組夜間最低溫26℃，白天最高溫28℃;高溫組夜間最低溫35℃，白天最高溫37℃。在接種后的第0、3、6、9、12?天，采用實時熒光定量PCR對樣品進行病毒的定量檢測，以對照植株cDNA作為陰性對照，以無酶水作為空白對照，每個樣本設置3個技術重復。

提取感病西番蓮植株不同組織（花、嫩葉、老葉、嫩莖、老莖、根）RNA，利用上述建立的方法定量測定不同組織內TeMV含量，共設3次重復。

1.2.8?田間樣品檢測

從贛南地區不同縣區共采集76份疑似感染TeMV的西番蓮樣品，采用qPCR技術檢測田間樣品感染TeMV的情況。

2?結果與分析

2.1?TeMV實時熒光定量PCR檢測體系的優化

將TeMV質粒標準品作為模板，通過對引物用量和退火溫度進行篩選，最終確定當引物VPg334F和VPg506R用量均為0.6?μL，退火溫度為54℃時，擴增曲線良好且熔解曲線峰單一。優化后的反應總體積20.0?μL：Master?mix?（SYBR?Green）?10.0?μL，10?μmol/L上、下游引物各0.6?μL，質粒模板1.0?μL，ddH2O補足體系至20.0?μL。反應程序：95℃預變性10?min;95℃變性10?s;54℃退火10?s，72℃延伸10?s，?40個循環。后續試驗均使用優化后的反應體系進行擴增。

2.2?標準曲線的建立

采用優化后的qPCR反應體系進行檢測，結果顯示，濃度在2.370×102～2.370×109?拷貝/μL范圍內的質粒模板經擴增后，所得Ct值與模板濃度呈良好的線性關系。標準曲線斜率為-3.257?2，決定系數R2為0.996?1，擴增效率為102.77%，直線方程為y=-3.257?2x+43.345，y為Ct值，x為質粒濃度的對數值（圖1）。

2.3?實時熒光定量PCR體系特異性檢測

采用qPCR方法分別檢測攜帶TeMV、PLV、PFV、EAPV、CMV和CiaRV的西番蓮樣品。結果顯示僅攜帶TeMV的樣品出現正常的擴增曲線，3次重復所得Ct值分別為15.68、15.44、15.72（圖2a），且熔解曲線峰值相同（圖2b）。其他感病樣品均無明顯擴增曲線，且熔解曲線無峰，結果表明該方法可用于特異性檢測TeMV。

2.4?實時熒光定量PCR和普通PCR靈敏度比較

將初始濃度為2.370×109?拷貝/μL的TeMV質粒標準品按10倍梯度稀釋，分別以稀釋后的質粒作為模板。結果顯示，普通PCR最低可檢測到濃度為2.370×105?拷貝/μL的TeMV質粒標準品（圖3a），qPCR可檢測到濃度為2.370×102?拷貝/μL的TeMV質粒標準品（圖3b）。上述結果表明本研究建立的TeMV實時熒光定量PCR檢測體系是普通PCR檢測靈敏度1?000倍。

2.5?西番蓮接種TeMV后的癥狀觀察及葉片病毒含量的定量檢測

從接種TeMV的第0天起，定期觀察不同溫度條件下培養的西番蓮葉片癥狀發展情況（圖4）。在17～19℃范圍內，第9天接種葉上部嫩葉出現卷葉癥狀，第12天時癥狀加重，頂部新葉表現為卷葉以及輕微花葉癥狀;?26～28℃下，第6天便出現較明顯的卷葉癥狀;?35～37℃下，癥狀出現緩慢，觀察期間內未出現明顯卷葉及花葉癥狀。

接種后第0、3、6、9、12天采集接種植株的上部葉片，采用引物VPg334F/506R以及西番蓮內參基因引物C21209F/R對樣品進行定量檢測（圖5）。結果顯示，接種3?d時就可在接種植株上部未接種葉中檢測到TeMV，且12?d內，不同溫度條件下西番蓮葉片中TeMV的相對表達量變化總體呈上升趨勢;在26～28℃條件下，TeMV的含量快速上升，遠高于其余2組;17～19℃以及35～37℃條件下，上升趨勢在9?d后趨于平緩，2組間病毒相對表達量無顯著差異。

以上結果表明，溫度能夠影響TeMV在西番蓮內的增殖速率以及植株的癥狀表達情況。26～28℃下病毒在植株內快速增殖，癥狀發展快，且該條件下TeMV增殖速率高于35～37℃與17～19℃;35～37℃條件不僅會降低病毒的積累速率，對植株的癥狀表達亦有影響。

2.6?西番蓮各組織部位TeMV相對表達量

針對病毒含量高的組織進行檢測可提高病毒檢出率。本試驗通過優化后的體系定量檢測感病西番蓮植株花、嫩葉、老葉、嫩莖、老莖、根等組織樣本中TeMV含量，?3次重復所得平均Ct值分別為19.47、20.5、20.74、19.03、34.04和32.54，依據標準曲線方程計算出樣品中病毒含量分別為1.297×107、6.38×106、5.41×106、1.75×107、5.92×102拷貝/μL和1.66×103拷貝/μL（圖6）?？梢娭仓贻^老的莖稈以及根部組織中病毒含量相對較低，在花、嫩莖、嫩葉等新生組織中病毒含量相對較高。因此，在檢測西番蓮感染TeMV情況時，以葉片作為檢測樣本可有效保障病毒檢測的準確性。

2.7?田間西番蓮樣品的TeMV檢測

應用本試驗所建立的熒光定量PCR檢測體系對采自贛南地區不同縣區的76份田間樣品進行分析，結果顯示（表1），76份樣品中，TeMV感病樣本共71份，不同地區所采集樣本中該病毒檢出率達到71.4%～100.0%，表明TeMV在所調查地區田間檢出率較高，推測該地區TeMV田間發生較為普遍。

3?結論與討論

近年來，TeMV在中國不同?。▍^）西番蓮產區蔓延，嚴重威脅了西番蓮產業的健康發展，因此對田間病毒發生情況進行早期的定性定量檢測與監控十分有必要。本研究建立了該病毒的實時熒光定量PCR檢測方法。該方法特異性好，靈敏度高，靈敏度是常規PCR檢測的1?000倍，可用于檢測低豐度病毒樣本。田間樣品檢測結果也表明該方法可用于TeMV的田間檢測。由于植物不同組織中所含的次生代謝產物存在差異，可能會影響RNA的提取及PCR檢測結果［19］，且病毒在植株不同部位積累量亦有較大差異，本研究所建立的實時熒光定量PCR檢測方法，對于感病西番蓮植株的不同組織部位均有良好的檢測效果。

有研究表明病毒侵染寄主植物過程中受溫度等外界環境因子影響，較高的環境溫度可能抑制病毒的快速積累，減弱植株的癥狀表現［2021］。類似結果已經在多種病毒上報道，如Tu研究發現，豆類作物感染菜豆黃花葉病毒（bean?yellow?mosaic?virus，BYMV）后，其癥狀發展受溫度影響較大，16～24℃下病毒滴度較高且癥狀發展迅速，當溫度高于28℃時，植株尖端壞死癥狀的發展受到抑制［22］。Chung等發現33℃高溫條件下，蕪菁花葉病毒（turnip?mosaic?virus，TuMV）侵染白菜時的癥狀發展較18～28℃緩慢［23］。同樣，高溫也可降低馬鈴薯Y病毒（potato?virus?Y，PVY）在本生煙中的積累速率并只引起輕微的癥狀［24］。本研究中所得結果表明TeMV侵染西番蓮過程中，病毒在葉片中的增殖和植株癥狀表現情況也會受到溫度影響，適宜溫度能夠加速TeMV的增殖以及植株的癥狀表現，而35～37℃高溫條件將抑制病毒在植株內的增殖速率并延緩癥狀的出現，且病毒的積累量與植株癥狀表現之間存在一定聯系。

目前西番蓮廣泛種植于熱帶與亞熱帶地區，以上結果表明夏季高溫條件下，植株感病初期可能不易出現明顯病害癥狀。本研究中將實時熒光定量PCR技術應用于TeMV的快速檢測，在分子水平上為TeMV的檢測提供了一種快速、靈敏的方法。在此基礎上結合田間不同溫度條件以及寄主感病程度等因素監測TeMV的發生情況，對該病毒的田間防控具有實際應用價值。

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（責任編輯：田?喆）