香蕉枯萎和細菌性軟腐病菌的多重PCR檢測

蒲小明 張景欣 沈會芳 孫大元 劉平平 林壁潤 楊祁云

摘要

香蕉枯萎病菌Fusarium?oxysporum?f.sp.?cubense和細菌性軟腐病菌Dickeya?zeae的復合侵染為害給香蕉產業發展帶來嚴重挑戰，有必要建立相關病害的多重聚合酶鏈式反應（multiplex?polymerase?chain?reaction，multiplex?PCR）檢測技術。本文基于尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種（F.oxysporum?f.sp.?cubense?race?1，FOC1）基因組contig?438區間（35?631-37?693?bp）（GenBank：?AMGP01000438.1）和4號生理小種（F.oxysporum?f.sp.?cubense?race?4，FOC4）基因組contig?195區間（4?028-6?126?bp）（GenBank：?AMGQ01000195.1）存在160?bp插入序列差異設計特異擴增引物FOCF/R，同時以香蕉細菌性軟腐病菌D.zeae的促旋酶B?亞單位基因（the?subunit?B?of?gyrase?gene）（GenBank：?JQ284039）序列設計特異擴增引物gyrBF/R。多重PCR檢測結果顯示：本技術可在一次PCR擴增反應內同時檢測香蕉枯萎病菌1號、4號生理小種和細菌性軟腐病菌;?多重PCR的靈敏度結果表明：檢測香蕉枯萎病菌的DNA濃度最低限為0.1?ng/μL，細菌性軟腐病菌的靈敏度為103cfu/mL;檢測結果穩定可靠。因此，本研究建立的多重PCR檢測方法可有效應用于檢測香蕉發病組織中的香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌，也可用于香蕉種苗和田間土壤帶病菌的監測，為香蕉種植保駕護航。

關鍵詞

香蕉;?尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種;?尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種;?玉米迪基氏菌;多重PCR;?促旋酶B?亞單位基因

中圖分類號：

S?436.681

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022799

Detection?of?banana?Fusarium?wilt?and?bacterial?soft?rot?by?multiplex?PCR?amplification

PU?Xiaoming，?ZHANG?Jingxin，?SHEN?Huifang，?SUN?Dayuan，?LIU?Pingping，?LIN?Birun，?YANG?Qiyun*

（Institute?of?Plant?Protection，?Guangdong?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Key?Laboratory?of?Green?Prevention?and?

Control?on?Fruits?and?Vegetables?in?South?China，?Ministry?of?Agriculture?and?Rural?Affairs，?Guangdong?Provincial?

Key?Laboratory?of?High?Technology?for?Plant?Protection，?Guangzhou?510640，?China）

Abstract

The?diseases?caused?by?Fusarium?oxysporum?f.sp.?cubense?and?Dickeya?zeae?have?brought?serious?challenges?to?the?development?of?banana?industry，?and?it?is?necessary?to?develop?a?detection?method?by?multiplex?polymerase?chain?reaction?（multiplex?PCR）?technology?for?them.?The?specific?amplification?primers?for?the?molecular?multiplex?PCR?system?were?designed?as?followed：?FOCF/R?targeted?the?sequences?of?the?contig?438?（35?631-37?693?bp）?（GenBank：?AMGP01000438.1）?in?the?DNA?of?F.oxysporum?f.sp.?cubense?race?1（FOC1）?and?the?contig?195（4?028-6?126?bp）?（GenBank：?AMGQ01000195.1）?in?the?DNA?of?F.oxysporum?f.sp.?cubense?race?4?（FOC4），?and?there?was?a?difference?of?160?bp?between?FOC1?and?FOC4.?The?primers?gyrBF/R?were?designed?based?on?the?gene?sequence?（GenBank：?JQ284039）?in?D.zeae.?The?results?of?multiplex?PCR?showed?that?this?technology?could?simultaneously?detect?FOC1，?FOC4?and?D.zeae?in?one?PCR?amplification?reaction.?Moreover，?the?minimum?limit?of?DNA?concentration?for?detection?of?F.oxysporum?f.sp.?cubense?was?0.1?ng/μL，?and?the?sensitivity?for?detecting?D.zeae?was?103cfu/mL.?The?detection?results?were?stable?and?reliable.?Therefore，?the?multiplex?PCR?detection?method?can?be?effectively?used?to?detect?F.oxysporum?f.sp.?cubense?and?D.zeae?in?infected?banana?plant?tissues，?and?can?also?be?used?to?monitor?banana?seedling?and?soilborne?pathogens?in?the?field，?which?provides?a?useful?tool?for?safe?planting?of?banana.

Key?words

banana;?Fusarium?oxysporum?f.sp.?cubense?race?1;?Fusarium?oxysporum?f.sp.?cubense?race?4;?Dickeya?zeae;?multiplex?PCR;?gyrB?gene

香蕉是我國熱帶地區重要的經濟作物，在農業鄉村振興方面發揮重要作用。香蕉枯萎病在20世紀60-70年代在廣東和廣西已局部發生，王碧青等報道1985年-1987年采集的42個香蕉植株發病樣本均分離出鐮刀菌，形態特征鑒定確定其均為尖孢鐮刀菌古巴?；虵usarium?oxysporum?f.sp.?cubense［1］。Zhang等首次報道在廣州市番禺區細菌性軟腐病發病香蕉植株中分離鑒定出病原菌為玉米迪基氏菌Dickeya?zea［2］，同時發現香蕉枯萎病菌和香蕉細菌性軟腐病菌存在復合侵染現象。玉米迪基氏菌被證明是一種重要的病原細菌，侵染水稻［3］、菠蘿［4］、玉米［5］、蕉芋?Canna?edulis［6］、甘蔗［7］等多種植物引起軟腐病害。香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌都具有一定的潛伏期，常在生長半年以上的香蕉植株或在果穗期表現出明顯發病癥狀，造成整株軟腐枯死，導致香蕉嚴重減產甚至絕收。

建立有效的香蕉病害預警監測技術并及時進行防控，是控制和降低香蕉枯萎病和軟腐病為害率的關鍵手段。這兩種病害均為系統性侵染病害，一般從根部和蟲傷口侵染為害，潛伏期間植株無發病癥狀，一般采用分子生物學方法檢測病菌，如DNA?指紋圖譜［8］、常規PCR［910］、實時熒光定量PCR［1112］、loopmediated?isothermal?amplification（LAMP）［1314］等。PCR是目前采用最普遍的病原菌鑒定方法，靈敏度高，可靠性強。目前國內外尚未有關于同時檢測香蕉枯萎病和細菌性軟腐病的多重PCR檢測技術的報道。本文基于尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種（F.oxysporum?f.sp.?cubense?race?1，FOC1）基因組contig?438區間（35?631-37?693?bp）（GenBank：?AMGP01000438.1）［15］和4號生理小種（F.oxysporum?f.sp.?cubense?race?4，FOC4）基因組contig?195區間（4?028-6?126?bp）（GenBank：?AMGQ01000195.1）［15］存在160?bp插入序列差異以及玉米迪基氏菌基因組［16］中的促旋酶B?亞單位基因（gyrB，?GenBank：?JQ284039）［17］等設計特異引物擴增特異基因片段，依據擴增片段大小區分病原菌種類，從而實現在一個PCR體系中同時檢測香蕉病害的多個病原菌，提高檢測效率，為香蕉病害預警預防提供技術支撐。

1?材料與方法

1.1?供試菌株

供試的尖孢鐮刀菌Fusarium?oxysporum不同?；秃偷匣暇鷮貲ickeya?sp.不同種分離自不同寄主植物，其他屬菌株為分離自發病植物或為常規試驗菌株，具體見表1。

1.2?特異性引物設計

尖孢鐮刀菌古巴?；?號和4號生理小種基因組的種間存在插入序列大小差異，即F.oxysporum?f.sp.?cubense?race?1（FOC1）?contig438?（GenBank：?AMGP01000438.1）［15］和?F.oxysporum?f.sp.?cubense?race?4（FOC4）?contig195?（GenBank：?AMGQ01000195.1）［15］序列比較，FOC4比FOC1多160?bp左右的插入片段，在該片段兩側延伸序列設計合適引物，獲得引物FOCF/R。

根據Dickeya?zeae?MS1的gyrB?基因序列（GenBank：?JQ284039）［17］，比較近似屬細菌的gyrB?基因序列，在Dickeya保守序列區域設計通用引物，最終獲得引物gyrBF/R。引物序列如表2所示。

1.3?真菌DNA提取

供試真菌菌株接種于PDA液體培養基中，26～28℃培養72?h，過濾取菌絲體，加液氮磨成粉末，采用CTAB法［18］提取真菌基因組DNA，?-20℃保存備用。

1.4?多重PCR擴增

1.4.1?特異性分析

采用引物FOCF/R和gyrBF/R復合擴增不同供試真菌DNA和細菌菌液，分析引物擴增特異性。多重PCR擴增體系為：TaKaRa?2×Premix?TaqTM?10?μL，引物FOCF/R和gyrBF/R各0.4?μL，模板（DNA或菌液）1?μL，DNaseFree?water?（無DNA酶水）?補足至20?μL。儀器BIORAD?T100TM?Thermal?Cycler的PCR反應條件：?94℃預變性5?min;94℃變性30?s，56℃退火30?s，72℃延伸60?s，35個循環;72℃延伸10?min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。

1.4.2?靈敏度檢測

香蕉枯萎病菌DNA按10倍梯度稀釋得到102～10-7ng/μL系列濃度，香蕉細菌性軟腐病菌菌液按10倍梯度稀釋得到108～10-1cfu/mL系列濃度。采用多重PCR擴增體系進行靈敏度分析，PCR擴增反應同1.4.1。

1.5?含菌土壤的檢測

將菌株FOC1或FOC4的分生孢子制成104?cfu/mL孢子懸浮液，將菌株MS1菌液制成104?cfu/mL菌懸液。稱取10份滅菌土，每份100?g，其中2份分別加入2?mL菌株FOC1孢子懸浮液、2份分別加入?2?mL?菌株FOC4孢子懸浮液、2份分別加入2?mL菌株MS1菌懸液、1份加入2?mL菌株FOC1孢子懸浮液+2?mL菌株MS1菌懸液、1份加入2?mL菌株FOC4孢子懸浮液+2?mL菌株MS1菌懸液、1份加入2?mL菌株FOC1孢子懸浮液+2?mL菌株FOC4孢子懸浮液、1份無菌土加入2?mL無菌水，充分攪拌均勻。用E.Z.N.A?Soil?DNA?kit（OMEGA）提取土壤總DNA，?-20℃保存備用。采用引物FOCF/R和gyrBF/R?擴增上述樣品DNA。PCR?擴增反應同1.4.1。

1.6?田間發病植株分析

在廣州市東涌、萬頃沙、新墾、朱村、欖核、大崗等鎮采集樣品，每個鎮取3～5株發病植株的假莖組織，切碎后用液氮磨成粉末，采用CTAB法［18］提取總DNA，?-20℃保存備用。采用引物FOCF/R和gyrBF/R?擴增樣品DNA。PCR?擴增反應同1.4.1。

選取香蕉假莖的病健交界處組織進行病原菌分離，提取病原菌DNA。以該DNA為模板，使用真菌ITS保守引物ITS4和ITS5，細菌16S?rDNA通用引物27f和1492r，擴增相應的保守基因序列，測序并進行BLAST比對。

2?結果與分析

2.1?引物特異性分析

多重PCR檢測不同真菌基因組的特異性結果如圖1所示。多重PCR體系僅特異性

擴增出尖孢鐮刀菌古巴?；?號和4號生理小種基因組中的特異片段，而其他19種不同真菌基因組DNA均未擴增出條帶（圖a）;圖1b顯示多重PCR體系在尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種基因組中擴增出796?bp的條帶，而在尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種和其他尖孢鐮刀菌菌株基因組中擴增出636?bp條帶，說明多重PCR體系在尖孢鐮刀菌菌株中能特異性擴增出尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種，由于香蕉尖孢鐮刀菌古巴?；?號和4號生理小種僅侵染香蕉植株，因此該多重PCR擴增體系適用于香蕉發病組織中檢測香蕉枯萎病菌。

多重PCR檢測不同細菌的特異性結果如圖2所示。在迪基氏菌屬細菌內不同菌株中均能擴增出218?bp條帶，但在其他15個不同屬菌株中均不能擴增出條帶，說明此多重PCR檢測能在迪基氏菌屬內特異擴增，也能有效實現香蕉細菌性軟腐病菌的檢測。

香蕉枯萎病菌和香蕉細菌性軟腐病菌的多重PCR檢測結果如圖3所示。尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種、尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種和香蕉細菌性軟腐病菌的單獨擴增和兩兩混合擴增，所得到的特異條帶清晰，無雜帶，說明基于引物FOCF/R和gyrBF/R復合的多重PCR檢測體系可靠。

2.2?多重PCR靈敏度分析

多重PCR靈敏度檢測結果表明（圖4）：10-1～102等4個濃度的DNA模板均有相應的擴增帶，10-7～10-2?ng/μL濃度的模板及陰性對照等均沒有擴增，表明該多重檢測體系可檢測到香蕉枯萎病菌DNA的含量下限為0.1?ng/μL。

多重PCR檢測體系檢測玉米迪基氏菌D.zeae的靈敏度結果表明（圖5）：103～108?cfu/mL?6個濃度DNA模板均有相應的擴增帶，10-1～102?cfu/mL濃度菌液的模板及陰性對照等均沒有擴增，表明該多重檢測體系可檢測到的細菌含量下限為103?cfu/mL。

2.3?含菌土壤檢測

以土壤總DNA為模板進行多重PCR擴增反應（圖6）。結果表明：在拌菌土壤檢測中，土壤拌尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種、尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種和香蕉細菌性軟腐病菌處理的PCR產物分別呈現636、796?bp和218?bp條帶，均符合相應菌株的目的條帶;土壤拌兩種菌處理的PCR產物則分別呈現636?bp和218?bp復合條帶、796?bp和218?bp復合條帶、636?bp和796?bp復合條帶，同樣符合土壤所拌菌株的目的條帶，表明此多重PCR檢測體系可有效檢測出土壤中含香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌。

2.4?田間樣品檢測

采集廣州市主要香蕉種植區的田間香蕉患病組織，嚴重發病香蕉假莖橫截面見圖7，截面大部分呈現紫色或褐色，其中部分假莖中心點出現褐色軟腐。采用本文的多重PCR檢測體系對發病組織進行病原菌的檢測，結果表明（圖8）：廣州市主要鎮地區采集的香蕉植株發病組織均能檢測出玉米迪基氏菌D.zeae相應的特異條帶（218?bp）;在東涌、萬頃沙、新墾、朱村等地采集的香蕉病樣均能擴增出FOC4對應的特異條帶（796?bp），在欖核、大崗、萬頃沙、新墾、朱村等鎮粉蕉病樣均能擴增出FOC1對應的特異條帶（636?bp）;表明這些地區的病株受到香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌復合侵染。

香蕉發病植株分離的病原菌保守序列分析結果表明，所有引起植株發病的病原菌均與多重PCR檢測的結果一致。

3?結論與討論

本研究建立的多重PCR檢測體系是在一個PCR?反應體系中加入2對特異引物FOCF/R和gyrBF/R，可以同時擴增出尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種、4號生理小種和玉米迪基氏菌的特異片段，具有節省時間、降低成本、提高效率等優點［19］。尖孢鐮刀菌對不同作物品種具有專性寄生而致病的特點，所以尖孢鐮刀菌被進一步分為不同?；蜕硇》N，傳統的形態鑒定和保守基因片段很難區分［20］。本研究基于尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種、4號生理小種基因組種間存在區域片段的插入序列差異，從而設計出1對特異引物，通過擴增片段長度不同來區別香蕉枯萎病菌的2個生理小種，具有應用價值。香蕉細菌性軟腐病病原菌為玉米迪基氏菌Dickeya?zeae，?gyrB基因在迪基氏屬內具有保守性，而侵染香蕉導致發病的只有玉米迪基氏菌，即在香蕉發病組織中gyrB基因可以作為檢測香蕉細菌性軟腐病病菌的靶標基因。本研究也是基于田間種植過程中，發現香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌可復合侵染，目前國內外報道僅限于尖孢鐮刀菌古巴?；停?124］和迪基氏細菌［2528］?的單獨檢測技術，但僅檢測其中一種病原菌無法提供精準的香蕉病害預警防控技術指導，本文建立的檢測技術彌補了相關技術空白。

本文建立的香蕉枯萎病菌和細菌性軟腐病菌的多重PCR檢測技術可有效用于檢測香蕉患病組織中病菌種類，進而應用于香蕉種苗檢疫、田間香蕉病害的早期診斷以及田間土壤帶病菌的監測和鑒定，有效防止香蕉枯萎病和細菌性軟腐病的擴散與蔓延，保障香蕉安全生產。

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