玉米白斑病的癥狀識別與診斷

何鵬搏 何鵬飛 吳毅歆 陳倩 趙正龍 亢波 唐萍 譚萬忠 何月秋 王云月

摘要

由寬頸附球孢菌Epicoccum?latusicollum?Qian?Chen，Crous?&?L.?Cai引起的玉米白斑病正在我國局部地區流行，導致重大損失，并有擴大流行范圍的趨勢。為了增加植保及玉米抗病育種工作者對玉米白斑病的了解，本文描述了該病害的癥狀特點、病原菌特征，總結了發生規律、病害循環及分離鑒定和診斷技術。玉米白斑病菌能在病殘體上越冬，種子帶菌是其遠距離傳播的主要途徑，風夾雨、昆蟲及農事操作人員活動是近距離傳播途徑。7月中下旬至9月中下旬是白斑病流行高峰期，病菌與玉米適宜生長溫度基本一致，具有擴散傳播的風險。

關鍵詞

玉米白斑病;?寬頸附球孢菌;?病害癥狀;?發生規律;?診斷

中圖分類號：

S?435.131.49

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022727

Symptom?recognition?and?diagnosis?of?maize?white?spot

HE?Pengbo1，?HE?Pengfei1，?WU?Yixin1，?CHEN?Qian2，?ZHAO?Zhenglong1，?KANG?Bo1，MUNIR?Shahzai1，?TANG?Ping1，?TAN?Wanzhong1，?HE?Yueqiu1*，?WANG?Yunyue1*

（1.?Yunnan?Agricultural?University，?Kunming?650201，?China;?2.?State?Key?Laboratory?of?Mycology，?

Institute?of?Microbiology，?Chinese?Academy?of?Sciences，?Beijing?100101，China）

Abstract

Maize?white?spot?（MWS），?caused?by?Epicoccum?latusicollum?Qian?Chen，?Crous?&?L.?Cai，?is?endemic?in?local?areas?of?China，?resulting?in?significant?losses?and?exhibiting?a?tendency?to?expand?endemic?area.?In?order?to?deepen?understanding?of?MWS?among?plant?protection?workers，?maize?resistance?breeders?and?related?parties，?the?characteristics?of?symptoms?and?the?MWS?pathogen?were?described，?and?the?occurrence?regularity，?disease?cycle，?isolation?and?identification?of?the?pathogen?and?diagnosis?techniques?were?summarized?in?this?paper.?E.latusicollum?can?overwinter?on?the?diseased?bodies，?and?the?carriage?by?maize?seeds?is?the?main?way?of?its?longdistance?transmission，?wind?and?rain?splash，?insects?and?farm?operators?are?the?way?of?closedistance?transmission.?The?MWS?epidemic?peak?occurred?from?midlate?July?to?midlate?September，?and?the?optimum?growth?temperature?of?the?pathogen?was?basically?the?same?as?that?of?maize，?implying?that?the?disease?has?the?risk?of?spreading?nationwide.

Key?words

maize?white?spot;?Epicoccum?latusicollum;?disease?symptom;?occurrence?regularity;?diagnosis

玉米白斑?。╩aize?white?spot，?MWS）在我國于20世紀90年代在廣西、云南南部山區偶有所見，但近年來在我國西南玉米產區來勢洶洶，目前在云南、廣西、貴州、四川、湖北、重慶山區均有發生［1］，其中云南省最為嚴重，我們的調查結果表明，該病可導致玉米感病品種產量損失20%～40%。國外學者把與本病癥狀相似的玉米病害歸于玉米暗球腔菌Phaeosphaeria?maydis引起的葉斑?。≒haeosphaeria?leaf?spot，PLS），Casela等［2］與Flett等［3］報道PLS在巴西和南非已成為玉米重要病害之一。由于病菌對實驗室常規分離中消毒劑較敏感，分離不易成功，致使不同研究者對病原菌的歸屬看法不一致［2，?45］。為了給植物保護工作者、玉米抗病育種者及其他人員提高對玉米白斑病的認識和鑒定能力，本文依據我們的研究結果，就病害癥狀、病原菌、發生規律、病害循環、分離與鑒定技術進行了簡單的歸納總結。

1?玉米白斑病癥狀

玉米白斑病為葉部病害。在玉米葉片上首先出現針尖大小的暗綠色圓形病斑，后逐漸擴大成白色圓形、長圓形、長形、不規則形，邊緣整齊，內側有寬約1?mm褐色環形壞死線。葉片上病斑正反兩面大小和顏色完全一致，或者幾近一致。病斑因失水而出現突然下陷、干癟的癥狀。病斑變白、變干（圖1a、1c）。病斑初期單生，直徑為0.3～2.0?cm，后期常多個病斑愈合成不規則的大病斑，直徑3～5?cm。病斑增多時，整個葉片變白、枯草色，枯死（圖1b），少數病斑因中間脫落而出現穿孔現象（圖1c）。中后期的病斑長出褐色或黑褐色小顆粒（分生孢子器噴吐出膠質狀的分生孢子堆），分生孢子器埋生于葉片表皮之下，在病斑中排列不規則（圖1cf）。但發病初期或者遇不適宜天氣條件時，病斑上無黑色小顆粒。

2?玉米白斑病的病原菌

玉米白斑病是由子囊菌門Ascomycota座囊菌綱Dothideomycetes格孢腔菌目Pleosporales亞隔孢殼科Didymellaceae寬頸附球孢菌Epicoccum?latusicollum?Qian?Chen，Crous?&?L.?Cai所引起。在馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA）上接種1個直徑5～6?mm菌絲塊，于28℃下暗培養7?d后，菌絲可布滿直徑9?cm的培養皿。菌絲初期為白色密絨毛狀，中后期分泌淺紅色色素，菌落邊緣整齊規則，菌落正面中央粉白至淺棕色，邊緣為白色，背面淡棕色或淺粉紅色，但因培養基不同，菌落的顏色有變化。分生孢子器球形，上端有孔口，但有時不明顯，埋生于病斑之下，遇雨水時，其內噴出分生孢子，后期孢子溢出物變淺褐色、褐色、黑色。分生孢子器在PDA上易形成，半埋生或者表生。在培養3～5?d后，用滅菌的玻片輕刮菌落上的表生菌絲，24?h后，便可以看到分子孢子器上噴出大量膿樣的孢子溢出物。孢子溢出物淺泥土色。分生孢子器褐色、黑褐色，直徑90～110?μm。分生孢器在顯微鏡下，遇水噴出柱狀、蛇曲狀的分生孢子束。單個分生孢子透明、薄壁且光滑，呈卵圓形至長卵形，無隔，單胞，大小為：（5.4～6.5）?μm×（2.5～3.5）?μm［1］（圖2）。

圖2?玉米白斑病菌形態

Fig.2?Morphology?of?the?pathogen?of?maize?white?spot，?Epicoccum?latusicollum

玉米白斑病菌菌絲在5～35℃下均能生長，最適生長溫度為?28～30℃;pH?3.0～10.0范圍內均可生長，最適pH為7.0?左右。分生孢子在13～44℃溫度范圍內均能萌發，最適宜萌發的溫度在25～30℃，最適宜萌發濕度在90%以上。它在玉米汁蔗糖培養基（玉米200?g，煮沸20?min后過濾，取濾液加瓊脂粉15?g、蔗糖15?g，加水定容至1?000?mL;MSA）上生長速度最快，在PDA、燕麥瓊脂培養基?（OA）上生長速度居中，在玉米汁培養基（玉米200?g，高壓煮沸20?min后過濾，取濾液加瓊脂粉15?g，加水定容至1?000?mL;MA）上生長較慢［1］。

3?玉米白斑病發生規律

玉米白斑病發生規律還不完全清楚。從作者近3年調查的結果來看，玉米品種對白斑病的抗病性差別大，從近乎免疫到高度感病。中抗以上的品種約占50%。田間主要在大喇叭口期后開始出現病斑，越往后，病情越重。在乳熟期，高感品種的葉片慢慢枯死，至成熟期，葉片全部枯死。山區病害比平原嚴重，田間肥料多少與病害嚴重度關系不密切。在周年種植玉米的區域，病菌沒有越冬期，可以周而復始地輾轉傳播，引起發病。但一年內病情發生最為嚴重時間在7月中旬至9月中下旬。

4?病害循環

玉米白斑病菌可以分生孢子器和菌絲體在玉米病葉片、苞葉上越冬，亦可隨著這些病殘體在土壤表面越冬，病菌可以分生孢子或者分生孢子器粘附到種子表面越冬和遠距離傳播。在田間適合發病的條件下，風夾雨是傳播的主要途徑，爬行的昆蟲及田間農事操作者也可近距離傳播。

5?分離鑒定技術

5.1?分離技術

5.1.1?組織分離法

用常規組織分離法從發病植株葉片的典型病斑上分離白斑病病原物。將新鮮病葉沖洗干凈，取病健交界處大小5?mm×5?mm的組織，用75%乙醇消毒5?s，2.5%次氯酸鈉浸泡2?min，無菌水漂洗3次，置于無菌吸水紙上吸干水分后轉移至含有10?μg/mL氯霉素的PDA平板上，置于28℃恒溫培養箱中，待病葉組織邊緣長出菌絲后，挑取菌絲尖端，轉入新的PDA平板進一步純化培養。

5.1.2?涂板分離法

鑒于白斑病菌對常用的乙醇、升汞和漂白粉很敏感，不易分離成功的特點，病菌的分離可以采用涂板法。病組織按上述方法表面消毒后，放入滅菌的研缽中，加入少量滅菌水，用碾槌碾磨至糊狀體，再加入適量的滅菌水充分稀釋，取稀釋液涂布于加有10?μg/mL氯霉素的PDA平板上，置于28℃恒溫培養箱中，待培養皿上長出圓形小菌落后，挑取菌絲灰白色，背面有淺棕色或淺粉紅色、淡褐色雜糅的菌落邊緣轉入新的PDA平板進一步純化培養。注意務必挑取類型占比多的菌落，如果挑取比例較少的菌落，可能分離不易成功。

5.2?鑒定技術

5.2.1?顯微切片法

玉米白斑病發生早期或者天氣原因，時常只是看到白色病斑癥狀，無菌絲、無子實體等病征，有時直接刮取病組織表面，在顯微鏡下也看不到真正的病菌，而時常會看到少量鐮刀菌Fusarium?spp.、鏈格孢Alternaria?spp.等腐生性強的真菌。遇到這種情況時，采用常規組織切片法是可行的。即切好病組織薄片后，直接在顯微鏡下檢查，看是否有分生孢子器埋生于病組織中，如果見到了典型分生孢子器，那就可能獲得了一個初步證據，該病可能由寬頸附球孢菌引起。

5.2.2?形態學鑒定法

1）觀察菌落形態、顏色;2）觀察菌落中的分生孢子器和分生孢子形態，測量它們的大小。如果符合前述形態特征，就可以進一步確認所分離到的病菌可能為寬頸附球孢菌。

5.2.3?分子鑒定法

如有需要，則按文獻［1，6］方法進行。采用CTAB法［7］提取可能菌株的基因組DNA。分別用ITS1（5′TCCGTAGGTGAACCTGCGC3′）/ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′），Btub2Fd（5′GTBCACCTYCARACCGGYCARTG3′）/Btub4Rd

（5′CCRGAYTGRCCRAARACRAAGTTGTC3′），

RPB25F2（5′GGGGWGAYCAGAAGAAGGC3′）/

fRPB27cR（5′CCCATRGCTTGYTTRCCCAT3′），

LR0R（5′AGATGAAAAGAACTTTGAAAAGA

GAG3′）/LR7（5′TACTACCACCAAGATCT3′）引物對ITS、tub2、rpb2和LSU基因片段進行PCR擴增。PCR擴增體系（20?μL）：5?U/μL?Taq?DNA?polymerase?0.2?μL，10×Taq?Buffer?2.0?μL，0.2?mmol/L?dNTPs?1.6?μL，DNA?1.0?μL，10?μmol/L上下游引物各1.0?μL，用超純水補足體積至20.0?μL。ITS擴增程序：95℃預變性5?min;95℃變性30?s，48℃退火30?s，72℃延伸80?s，35個循環;72℃再延伸10?min。tub2擴增程序：95℃預變性5?min;95℃變性30?s，52℃退火30?s，72℃延伸80?s，35個循環;72℃再延伸10?min。rpb2擴增程序：94℃預變性5?min;94℃變性45?s，60℃退火45?s，72℃延伸2?min，5個循環;94℃變性45?s，58℃退火45?s，72℃延伸2?min，5個循環;94℃變性45?s，54℃退火45?s，72℃延伸2?min，30個循環;72℃再延伸8?min。LSU擴增程序：95℃預變性5?min;95℃變性45?s，48℃退火45?s，72℃延伸2?min，35個循環;72℃再延伸10?min。對擴增片段進行測序，從GenBank網站下載其他近似菌株及WS1?（OM131567）和WS191?（OM131595）序列和外組菌株對應序列，使用MEGAX軟件剪切各序列，使相同基因片段序列的長度一致，按照rpb2tub2ITSLSU的順序首尾拼接，分析系統發育關系，構建系統發育樹，采用鄰接法進行聚類分析，自展值設為1?000，確定種的分類地位。當新分析的未知菌株與已知菌株序列同源性達99%以上，與已知菌株WS1和WS191聚為一支時，且切片法所用的葉片癥狀與白斑病基本一致，病菌形態學與Epicoccum?latusicollum基本一致，所分離的病害屬于玉米白斑病。

參考文獻

［1］?張珊，?朱自萍，?何鵬搏，等.?云南省玉米白斑病的病菌鑒定與品種田間抗病性調查分析［J］.?植物保護學報，?2022，?49（3）：?840847.

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［3］?FLETT?B?C，?BENSCH?M?J，?SMIT?E，?et?al.?A?;field?guide?for?identification?of?maize?diseases?in?south?Africa?［Z］.?ARCLNR，?Potchefstroom，?South?Africa，?1996.

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［5］?CARSON?M?L.?Vulnerability?of?U.S.?maize?germ?plasm?to?Phaeosphaeria?leaf?spot?［J］.?Plant?Disease，?1999，?83（5）：?462464.

［6］?陳倩.?亞隔孢殼科的系統演化及分類學研究［D］.?北京：?中國農業大學，?2015.

［7］?HE?Yueqiu.?An?improved?protocol?for?fungal?DNA?preparation?［J］.?Mycosystema，?2000，?19（3）：?434.

（責任編輯：田?喆）