基于網絡藥理學和分子對接探究莪術-三棱藥對治療前列腺癌的作用機制

張 蝶，劉曾晶，蒙秋霞，王慧豐，胡艷玲，4，5

1. 廣西醫科大學再生醫學與醫用生物資源開發應用省部共建協同創新中心（南寧 530022）

2. 廣西醫科大學信息與管理學院（南寧 530022）

3. 廣西醫科大學基礎醫學院人體解剖學教研室（南寧 530022）

4. 廣西醫科大學生命科學研究院（南寧 530022）

5. 廣西醫科大學基因組與個性化醫學研究中心（南寧 530022）

前列腺癌（prostate cancer, PCa）是一種嚴重威脅男性健康和生命的癌癥，其發病率逐年上升且在男性生殖系統疾病中居首位，死亡率排第二[1-2]。臨床上PCa 的治療以雄激素阻斷為主，同時輔以放療和化療。在過去的70 年間，雄激素剝奪治療（androgen deprivation therapy,ADT）一直被認為是治療PCa 最有效和最廣泛的方法[3]。近幾年，雖然在藥物治療、放射性核素治療和免疫治療等方面取得了一些新進展，但PCa 的治療仍存在巨大挑戰，尋找PCa 的高效治療方法已成為當前的趨勢。研究發現，傳統中藥由多種成分組成，具有多功能、多靶點和協同作用的優點，能夠有效防止腫瘤細胞的增殖和轉移，且副作用較小，能夠調節身體的陰陽平衡，對于PCa 的治療具有獨特優勢[4]。

古代中醫書籍對于PCa 并無其病名的記載，根據PCa 具有血尿、尿不盡等臨床特點和表現，可將其納入中醫學“癃閉”“淋證”“血尿”等范疇[5]。古代中醫學認為，PCa 病機關鍵在于正氣虧虛，陰陽失調，外感毒邪乘虛侵入下焦，致使腎與膀胱氣化失司，臟腑功能紊亂，氣血津液運化失常，濕熱、瘀血、癌毒內生，從而誘發PCa[6]。

莪術、三棱為破血除淤的代表性中藥，兩種藥物的配伍關系在中醫中屬于“相須”關系。莪術-三棱藥對具有氣血兼顧、活血祛瘀、行氣止痛和化積消癥的功效，莪術行氣之力優于三棱，三棱活血之力優于莪術，兩者相須配伍使用可活一身之氣血[7]。莪術目前被公認具有抗腫瘤活性的有效成分β－欖香烯和莪術醇等，三棱也已被證實可以分離出具有抗癌活性的多個化合物，具有顯著的抗癌活性[8-9]。莪術和三棱治療癌癥的機制具有共同之處，如誘導腫瘤細胞凋亡、干擾腫瘤細胞周期等[10]。目前莪術-三棱藥對治療PCa 的機制尚不明確，本研究采用網絡藥理學和分子對接技術初步探究莪術-三棱藥對抗PCa 的有效活性成分和作用機制。

1 資料與方法

1.1 莪術-三棱藥對活性成分靶點收集

通過HERB 數據庫（http://herb.ac.cn/），以“莪術”“三棱”為關鍵詞進行檢索，獲取兩種藥物的活性成分。利用PubChem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取各活性成分的SMILES 結構式，并導入SwissADME 數據庫（http://www.swissadme.ch/）進行藥物結構的預測。根據Lipinski 類藥五原則（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge），篩選出具有兩個或兩個以上“Yes”以及GI absorption 為“high”的化合物，并導入SwissTargetPrediction 數據庫（http://www.swisstargetprediction.ch/），以預測靶點Probability ＞0 作為篩選原則，得到所選成分對應靶標蛋白的UniProt ID。通過Uniport 數據庫（https://www.uniprot.org/）的IDmapping 工具將UniProt ID 轉換成Gene Symbol，并在去除重復項后得到有效活性成分靶點。

1.2 PCa相關靶點獲取

以“Prostate Cancer”“Prostatic Cancer”“Prostatic Carcinoma”為關鍵詞，分別在Genecards 數據庫（https://www.genecards.org/）、OMIM 數據庫（https://www.omim.org/）、PhamGkb 數據庫（https://www.pharmgkb.org/）、TTD 數據庫（http://bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp）、DrugBank 數據庫（https://www.drugbank.ca）中進行檢索和篩選，下載相關疾病靶點。將篩選結果整合并刪除重復項，得到PCa 相關靶點。將莪術-三棱活性成分靶點與PCa 相關靶點進行交集運算，選取重疊靶點作為莪術-三棱治療PCa 的相關靶點。采用R 4.2.3 軟件繪制Venn 圖，以展示莪術-三棱抗PCa 的相關靶點。

1.3 藥物有效成分與疾病靶點網絡構建

采用Cytoscape 3.9.0 軟件對莪術-三棱的活性成分和PCa 靶點網絡進行構建，以直觀地展示藥物活性成分與疾病靶點之間的關系。通過Network Analyzer Apps 軟件對網絡的拓撲特征進行分析，包括度中心性（degree centrality,DC）、緊密中心性（closeness centrality, CC）和介數中心性（betweenness centrality, BC）。設定介數中心性值和緊密中心性值的中位數為閾值，并以節點度值的大小順序排列，篩選出關鍵活性成分。

1.4 蛋白-蛋白相互作用網絡構建及核心靶點篩選

為構建莪術-三棱抗PCa 的相關靶點蛋白-蛋白相互作用網絡（protein-protein interaction network, PPI）， 利用STRING 數據庫（https://string-db.org/）揭示蛋白質之間的關系。首先，將相關靶點導入STRING 數據庫，獲取TSV 格式的數據文件，然后導入Cytoscape 進行可視化。采用節點度值大于中位數的標準，并通過拓撲分析篩選核心靶點[11]。利用Cytoscape 的MCODE 和cytohubba 插件對網絡進行分析，輸出度值得分排名前10名的靶點為莪術-三棱抗PCa的核心靶點。

1.5 GO和KEGG富集分析

采用基因本體（gene gontology, GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析對莪術-三棱藥對與PCa 的共同靶點進行分析，進一步挖掘藥物-疾病信號通路。將Gene Symbol 轉化為Entrez ID，利用R 4.2.3 軟件中的RGUI、DOSE 和Cluster Profiler 等工具進行GO 功能富集和KEGG 通路分析，設定p-value Cutoff=0.05 和q-value Cutoff=0.05，以確保結果的可靠性。分別選擇GO 富集結果中富集程度最高的前10 項，包括生物過程（biological process,BP）、細胞成分（cellular component, CC）、分子功能（molecular function, MF），通過R 4.2.3軟件制作柱狀圖進行結果可視化。最后，通過KEGG 數據庫及R 4.2.3 軟件的pathview 包進行通路富集分析和氣泡圖繪制，獲得富集程度最高的前30 項通路。

1.6 莪術-三棱活性成分與關鍵靶點分子對接

在Uniprot 數 據 庫（https://www.uniprot.org/）中檢索候選靶點的條目標識符，然后將其導入RCSB PDB 數據庫（https://www.rcsb.org/），獲取蛋白受體3D 結構并導入PyMOL 軟件，去除水分子和小分子配體。然后在PubChem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中獲取配體的3D 晶體結構，并導入Chem3D 軟件進行結構優化處理，提高分子對接結果的可靠性。將經過處理的受體和配體文件導入AutoDockTools 1.5.7 軟件，進行加氫處理并確定活性口袋。最后，使用AutoDock Vina 軟件進行受體與配體的分子對接，計算最小自由能，并使用PyMOL 軟件進行對接結果的優化和可視化。

2 結果

2.1 莪術-三棱治療PCa的有效成分篩選

初步篩選出72 個化合物，其中莪術44 個、三棱28 個。通過刪除重復項，并基于Uniport 數據庫進行確認和轉換，最終得到760 個有效活性成分靶點，見圖1-A。

圖1 藥物有效活性成分靶點與PCa基因靶點Venn圖Figure 1. Venn diagram of the intersection of targets between active ingredients of the drug and gene targets of PCa

2.2 有效活性成分庫和疾病靶標集構建

共獲取13 001 個PCa 基因靶點，將760 個莪術-三棱藥對有效活性成分靶點與13 001 個PCa基因靶點取交集，作為莪術-三棱藥對治療PCa的共同靶點，得到659 個共同靶點，見圖1-B。

2.3 藥物成分-靶點網絡構建

本研究構建了一個涵蓋727 個節點和3 148 條邊的莪術-三棱活性成分與PCa 靶點網絡，展示了72 個藥物有效成分與659 個潛在靶點間的相互作用，藥物成分和疾病靶點分別以不同顏色和形狀展示。如圖2 所示，不同藥物活性成分可與多個基因靶點相連，且一個基因靶點可與多個藥物活性成分相連。根據度值大小進行排序，共篩選出10 種關鍵活性成分，分別為莪術雙環烯酮、無患子皂苷B、花椒麻素、（2s）-3',4'- 亞甲二氧基-5,7-二甲氧基黃酮、芹菜素、天人菊內酯、山奈酚、三棱酸、脫甲氧姜黃素以及5,7,2',3'-四羥基黃酮。

2.4 PPI網絡構建與核心靶點篩選

圖3 為莪術-三棱抗PCa 相關靶點的PPI 網絡圖，包含497 個節點和2 912 條邊。

按照度值由高到低的順序，共獲取10 種關鍵蛋白，分別為SRC、TP53、MAPK3、MAPK1、STAT3、HSP90AA1、AKT1、PIK3R1、RHOA、GRB2，見圖4。排名前10 名的關鍵蛋白在PPI網絡中發揮著重要作用，由于SRC、TP53 和MAPK3 評分最高，可能在莪術-三棱藥對治療PCa 中起關鍵作用。

2.5 GO和KEGG通路富集分析

對莪術-三棱與PCa 的659 個共同靶點進行GO 功能富集，得到3 667 個GO 條目，篩選出3 188 個BP、148 個CC、331 個MF，見圖5。在BP 方面，主要富集于肽?；野彼崃姿峄?、異物質刺激反應、肽?；野彼嵝揎?、蛋白質自磷酸化以及肽?；z氨酸磷酸化等過程；在CC方面，富集顯著發生在膜微區域、蛋白激酶復合物、神經元細胞體、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復合物以及突觸前膜的整體組分等結構；在MF 方面，主要涉及蛋白質絲/蘇氨酸激酶活性、蛋白質酪氨酸激酶活性、蛋白質絲氨酸激酶活性、核受體活性以及配體激活的轉錄因子活性等分子功能。

圖5 GO富集分析Figure 5. GO enrichment analysis

為深入研究莪術-三棱對PCa 的信號通路機制，本研究進行了KEGG 通路分析，圖6 展示了前30 條信號通路，包括神經活性配體-受體相互作用通路、PI3K-AKT 信號通路以及鈣信號通路等。

圖6 莪術-三棱藥對治療PCa作用靶點的KEGG通路富集分析Figure 6. KEGG pathway enrichment analysis of the targets of Ezhu-Sanleng in the treatment of PCa

以PI3K-AKT 信號通路為例，如圖7 所示，莪術-三棱治療PCa 的作用靶點主要包括PI3K、AMPK、JAK 以及AKT 等40 個。

圖7 莪術-三棱藥對治療PCa作用靶點在PI3K-AKT信號通路上的富集圖Figure 7. Enrichment diagram of the targets of Ezhu-Sanleng in the treatment of PCa on the PI3KAKT signaling pathway

2.6 核心靶點與藥物活性成分的分子對接驗證

在莪術-三棱活性成分與PCa 靶點網絡中，將核心靶點和與之相互作用的藥物關鍵活性成分進行分子對接，具體對接信息見表1。圖8 為利用PyMOL 軟件可視化后受體與配體的最佳對接圖像。研究表明，配體與受體結合的構象穩定時能量越低，結合的可能性越大，當結合能小于-5.0 kcal·mol-1時，配體與受體的結合活性較好[12-15]。由分子對接結果可知，結合能均小于-5.0 kcal·mol-1，表明這些核心靶點與對應的藥物活性成分均具有較高的親和力。

表1 核心靶點與藥物活性成分的分子對接信息Table 1. Molecular docking information between core targets and active ingredients of the drug

圖8 核心靶點與莪術-三棱藥物活性成分的分子對接模式Figure 8. Molecular docking patterns between core targets and active ingredients of Ezhu-Sanleng

3 討論

中醫藥不僅在傳統醫學中占據重要地位，也在腫瘤防治中發揮著重要作用，深入研究和充分發揮中醫藥在PCa 治療中的潛力，對于改善患者治療效果和提高生存率有著重要意義[16-18]?，F代藥理研究表明，莪術-三棱藥對含有多種抗腫瘤成分，可通過多種途徑和靶點發揮抗腫瘤作用。既往研究顯示，莪術-三棱藥對在不同癌癥中均表現出抗癌活性，其可以通過雙去甲氧基姜黃素調節人子宮內膜癌細胞的代謝、增殖與凋亡來發揮抗子宮內膜癌的作用，也可通過減少TGF-β1誘導的Smad3 磷酸化水平的上調，并降低多種轉錄因子（Snail1、Snail2 和Twist1）的表達來影響三陰性乳腺癌上皮間質轉化[19-20]。雖然近年來研究發現莪術-三棱藥對在抗腫瘤方面具有積極作用，但莪術-三棱藥對抗PCa 的機制并不明確，本研究通過網絡藥理學和分子對接技術探究莪術-三棱抗PCa 的有效活性成分及其與潛在靶點的相互作用。

本研究獲取了莪術-三棱藥對的活性成分，包括莪術雙環烯酮、無患子皂苷B、花椒麻素、（2s）-3',4'-亞甲二氧基-5,7-二甲氧基黃酮、芹菜素、天人菊內酯、山奈酚、三棱酸、脫甲氧姜黃素等。山奈酚在腫瘤治療方面具有潛在作用，其在人結腸癌HCT-116 細胞體外實驗中通過參與調節腫瘤細胞氧化應激和誘導凋亡展現出抗癌潛力[21]；在雄激素受體表達細胞和非雄激素受體表達細胞中均可抑制腫瘤增殖標志物Ki67 mRNA的表達[22-23]；此外，山奈酚還可以通過調節雄激素受體信號通路來抑制人前列腺癌LNCaP 細胞的增殖[24]；人宮頸癌體外細胞實驗結果表明，山奈酚可通過阻斷JAK2/STAT3 通路信號轉導，從而抑制人宮頸癌HeLa 細胞的增殖、黏附及糖酵解等[25]。天人菊內酯通過上調p53 和增加Bax/Bcl-2比值觸發線粒體介導的細胞凋亡途徑，導致線粒體膜電位喪失，從而抑制人乳腺癌的發展[26]；研究發現，天人菊內酯能夠通過抑制NF-κB 顯著降低COX-2、MMP-9、TWIST-1、Bcl-2等基因的表達水平，從而抑制腫瘤進展[27]。研究表明，無患子皂苷B 對肺癌細胞和肝癌細胞的增殖均有抑制作用，其通過阻滯細胞周期、上調Caspase-3 并下調NF-κB 的表達，抑制HepG2 人肝癌細胞的增殖并誘導其凋亡[28]。脫甲氧姜黃素也被發現可以抑制腫瘤增殖標志物Ki67 的表達，顯著降低原位膠質瘤組織中p-AKT 和p-mTOR 的表達，展現出強大的抗腫瘤特性[29]。體外細胞實驗發現芹菜素能夠通過調節PI3K/AKT 信號通路抑制子宮內膜癌細胞HEC-1-B 細胞增殖、侵襲、遷移并促進其凋亡[30]；裸鼠體內實驗結果表明，芹菜素還可通過與CBP/PTX 療法（卵巢癌臨床一線化療法）聯合使用，降低上皮性卵巢癌細胞Caov-3細胞的遷移能力，限制其惡性發展[31]。這些成分可能是莪術-三棱抗PCa 的關鍵成分，為深入探究其療效機制提供了線索。

SRC、TP53、MAPK3、MAPK1、STAT3 是度值最高的前5 種關鍵蛋白，是PPI 網絡圖中發揮關鍵作用的核心靶點。這些蛋白在應激和炎癥反應中被誘導，參與調控細胞的增殖、分化、凋亡等細胞生物學行為。SRC 是一種原癌基因酪氨酸蛋白激酶，作為治療PCa 的關鍵靶點之一，Saad等研究表明SRC 在推動細胞增殖、存活、遷移并促使向雄激素非依賴性生長的過程中發揮著重要作用[32]。TP53 在維護細胞基因組穩定性和抑制腫瘤發展中起著重要作用，在PCa 等多種癌癥中TP53基因的突變或功能異?？赡軐е聀53 蛋白的失活，從而使細胞失去對異常狀況的監測和調控[33]。在細胞內信號通路中，MAPK（絲裂原活化蛋白激酶）在細胞增殖、分化、凋亡、血管生成和腫瘤轉移方面發揮關鍵作用，可通過調節細胞周期相關蛋白的表達和激活細胞凋亡途徑，抑制腫瘤細胞的無限增殖能力，使其進入細胞周期停滯或死亡[34]。STAT3 也是雄激素抵抗性PCa 治療的重要靶點，與癌細胞存活、免疫抑制和腫瘤微環境中的持續炎癥有關，異常激活的STAT3 與PCa 的惡性進展和轉移有關，可能促進PCa 細胞的增殖，并影響腫瘤的侵襲和轉移能力[35-36]。

GO 富集分析結果顯示，莪術-三棱抗PCa的659 個潛在靶點主要通過影響蛋白質絲/蘇氨酸激酶活性、蛋白質酪氨酸激酶活性、蛋白質絲氨酸激酶活性等分子功能，在膜微區域、蛋白激酶復合物、神經元細胞體等結構中調控腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移和信號轉導。KEGG 對潛在靶點的分析顯示，莪術-三棱可能通過神經活性配體-受體相互作用通路、PI3K-AKT 信號通路、鈣信號通路等多種途徑對PCa 產生治療作用。據報道，神經活性配體-受體相互作用通路與結腸癌的預后與免疫治療反應相關[37]。PI3K-AKT 信號通路在腫瘤細胞的存活、增殖、分化、遷移和代謝中起著關鍵作用[38]。在PCa 中，鈣信號通路通過調節多種蛋白受體，促進LNCaP 細胞的凋亡。局部鈣信號具有傳遞信息的能力，能夠影響細胞內鈣穩態產生并建立網絡，用于整合腫瘤微環境條件，破壞PCa 網絡中的關鍵節點[39]。

分子對接通過一種理論模擬的方法，模擬藥物成分與靶點之間的相互作用，并預測其結合模式和親和力，能夠更好地理解藥物的結合方式和結合強度[40]?；诰W絡藥理學研究結果，本研究對莪術-三棱活性成分與PCa 靶點網絡中的分子相互作用進行分子對接驗證。核心靶點與莪術-三棱藥對關鍵活性成分的分子對接模式圖展示了SRC 與芹菜素、SRC 與山奈酚、TP53 與無患子皂苷B、MAPK1 與天人菊內酯、AKT1 與芹菜素、AKT1 與山奈酚、PIK3R1 與芹菜素、PIK3R1 與山奈酚的結合模式，所有結合能均小于-5.0 kcal·mol-1，進一步印證了這些核心靶點與藥物活性成分之間的牢固結合，AKT1 與芹菜素的對接結果具有最低的結合能，表明結合最為穩定。

本研究使用生物信息學方法探討莪術-三棱藥對在治療PCa 中的作用，存在一些局限性，如數據庫數據的準確性和及時性需要科學驗證，以及某些未經確認和未記錄的藥物成分或靶點可能未被納入本研究。盡管本研究顯示莪術雙環烯酮、無患子皂苷B、花椒麻素、（2s）-3',4'-亞甲二氧基-5,7-二甲氧基黃酮、芹菜素、天人菊內酯、山奈酚、三棱酸以及脫甲氧姜黃素為莪術-三棱藥對在治療PCa 中最關鍵的藥物活性成分，但它們并不能完全代表莪術-三棱藥對，且莪術-三棱藥對在治療中存在配伍關系。因此，后續需進行藥效學實驗和分子生物學實驗進一步驗證本研究結果。

本研究通過網絡藥理學和分子對接的方法初步闡明了莪術-三棱抗PCa 的藥物活性成分、關鍵靶點及作用機制，揭示了莪術-三棱通過莪術雙環烯酮、無患子皂苷B、花椒麻素、（2s）-3',4'-亞甲二氧基-5,7-二甲氧基黃酮、芹菜素、天人菊內酯、山奈酚、三棱酸以及脫甲氧姜黃素等藥物關鍵活性成分，調節細胞的增殖、凋亡、遷移和信號轉導等相關通路中的SRC、TP53、MAPK3、MAPK1、STAT3、HSP90AA1、AKT1、PIK3R1、RHOA、GRB2 等核心靶點，呈現了多成分、多靶點相互作用的特性，為莪術-三棱治療PCa 的深入研究提供了參考。