SMRACAD1通過上皮-間充質轉化促進胃癌細胞生長和遷移的機制研究

田小容，劉嘉璽，占 婷，陳夢閣，田 霞，黃曉東

1. 武漢大學中南醫院消化內科（武漢 430071）

2. 武漢市第三醫院（武漢大學附屬同仁醫院）消化內科（武漢 430060）

胃癌是一種常見的起源于胃上皮細胞的惡性腫瘤，居全球癌癥死亡相關原因第三位，僅次于肺癌和結直腸癌[1]。由于胃癌早期癥狀缺乏特異性，確診主要依靠內鏡檢查，因此大多數患者診斷為進展期和晚期[2]。確定新的生物標志物有助于進一步提高對胃癌的理解，有助于開發新的靶向治療方法，以提高胃癌患者的生存率。SMRACAD1是SNF2 螺旋酶亞家族和含DEAD/H盒螺旋酶結構域蛋白的ATP 酶SWI/SNF 家族成員，其參與DNA 復制、轉錄調節、異染色質建立和維持，以及DNA 損傷修復[3-4]。起初，人類Hel1 基因（現在被命名為SMRACAD1）被發現在e1a 表達細胞系中過表達，并通過基因組重排增加基因再激活的能力，這表明人類Hel1 基因可能在遺傳不穩定發展中發揮作用，并將該基因定位到4q22-23 染色體上[5]。目前越來越多的研究表明，SMRACAD1與腫瘤細胞的增殖、上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）和化療藥物敏感性有關，如肝細胞癌、胰腺癌、乳腺癌和惡性周圍神經鞘腫瘤[6-10]，然而關于SMRACAD1在胃癌中的表達及其發病機制的報道較少。本研究旨在探討SMRACAD1對人胃癌細胞增殖和侵襲能力的影響及相關分子機制。

1 資料與方法

1.1 主要試劑和儀器

高糖 DMEM 培養基、F-12K 培養基、RIPA1640 培養基、胎牛血清、胰酶、凍存液均購自美國Gibco 公司；HiTrnace A、HiTrance B、shCON 和shSMRACAD1購自上海吉凱基因公司；熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction,PCR）試劑盒購自北京康為世紀公司；EDU 細胞增殖檢測試劑盒購自上海碧云天生物公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自上海三箭生物公司；Trizol裂解液購自美國Invitrogen 公司；BCA 蛋白測定試劑盒和ECL 化學發光試劑盒購自美國Thermo Fisher 公司；SAMARCAD1抗體、E-鈣黏蛋白抗體（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白抗體（E-cadherin）、波形蛋白抗體（Vimentin）、Snail 抗體、磷脂酰肌醇-3 激酶抗體（phosphatidylinosital-3 kinase，PI3K）、 蛋白激酶B 抗體（protein kinase B，AKT）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白抗體（mamalian target of repamycin，mTOR）、磷酸化PI3K 抗體（phosphorylated PI3K，p-PI3K）、 磷酸化AKT 抗體（phosphorylated AKT，p-AKT）、磷酸化mTOR抗體（phosphorylated mTOR，p-mTOR）、β-actin 抗 體、GAPDH 抗 體HRP 標記的山羊抗兔二抗購自英國Abcam 公司；CO2恒溫細胞培養箱購自美國Thermo Fisher 公司；熒光定量PCR 儀、凝膠成像分析器、流式細胞分析儀購自美國Bio-Rad 公司；熒光倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS 公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析

胃腺癌（stomach adenocarcinoma, STAD）組織和正常組織數據集來自癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫（https://portal.gdc.cancer.gov/），TCGA-STAD 數據集包括407 個組織，其中373 個胃癌組織、2 個癌旁組織、32 個正常組織。利用胃癌組織和正常組織數據分析SMRACAD1的差異表達。來自373 個胃癌組織的SMRACAD1數據用于京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析。

1.2.2 細胞培養

人胃黏膜細胞系GES-1 和人胃腺癌細胞系AGS 均購自中國科學院細胞培養庫（中國上海），其中GES-1 細胞生長于高糖DMEM 培養基，HGC-27 細胞生長于RIPA1640 培養基，AGS 細胞生長于Ham's F-12K 培養基，置入37℃、含5%CO2培養箱中恒溫培養。高糖DMEM 和Ham's F-12K培養基均加入10%的胎牛血清和1%的青-鏈霉素制成完全培養基。RIPA1640 培養基加入20%的胎牛血清和1%的青-鏈霉素制成完全培養基。

1.2.3 細胞轉染

從上海吉凱基因公司獲得表達SMRACAD1shRNA和陰性對照的慢病毒構建體，shRNA序列如下：

SMRACAD1shRNA：

5’-CCAGCACCTGACAATTAA-3’

shCON：

5’-GCCTTATTTGACAATGCTTAT-3’

取對數生長期AGS 細胞進行鋪板，待細胞密度達30%左右時，按照制造商說明使用HiTrance A轉染試劑將SMRACAD1shRNA 和shCON 分別轉移至六孔板內，轉染72 h 后留取細胞進行后續實驗。

1.2.4 實時熒光定量PCR

取Trizol 裂解液從細胞中提取總RNA，操作步驟按照試劑盒說明書進行。PCR 在以下條件下進行：95℃10 min，95℃15 s，60℃20 s，72℃40 s，40 個循環。計算Ct 值，以β-actin 為mRNA 的歸一化參考，采用2-△△Ct方法定量相對表達量。每個樣本檢測3 個，重復進行統計分析。PCR 中使用的正向（F）和反向（R）引物序列如下：

SMRACAD1：

正向：5’-TCTTTGGCCCCTTTGTGTCC-3’

反向：5’-GAGAAGCTCCCTGTGCTACC-3’

β-actin:

正向：5’-CCTTCCTGGGCATGGAGTC-3’

反向：5’-TGATCTTCATTGTGCTGGGTG-3’

1.2.5 蛋白印跡法

取RIPA 裂解液裂解細胞后，用BCA 蛋白檢測試劑盒對細胞裂解液中的蛋白含量進行定量。將蛋白加入SDS-PAGE 分離過程中，轉移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉膜，用特異性單克隆一、二抗檢測SAMARCAD1、E-catenin、N-catenin、波形蛋白（Vimentin）、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mMOR、β-actin 和GAPDH 蛋白。

1.2.6 平板克隆實驗

取胰酶消化各組細胞后，用完全培養基將離心后的細胞制成細胞懸液，以500 個細胞/孔平鋪至6 孔板中，靜置培養12 天肉眼可見克隆的細胞團塊，4%多聚甲醛固定，結晶紫染色，計數細胞克隆數。

1.2.7 CCK-8實驗

取胰酶消化各組細胞制備細胞懸液，每孔取100 μL，含4 000 個懸浮細胞，平鋪至96 孔板中，分別在細胞培養的第2、3、4、5 天時每孔加入10 μL CCK-8 溶液，避光培養2 h 后用酶標儀參數為450 nm 的光密度（optical density，OD）值測量細胞的增殖情況。

1.2.8 劃痕實驗

取轉染后的細胞6 孔板繼續培養24 h，用200 μL 槍頭豎直劃痕，PBS 清洗后完全培養基繼續培養，拍照后放入培養箱，待12 h、24 h 后再次拍照。

1.2.9 Transwell小室檢測細胞遷移和侵襲能力

取各組轉染后細胞培養2 天后，胰酶消化各組細胞制備細胞懸液，取200 μL 含5×104個懸浮細胞的無血清培養基，在涂有Matrigel 基質膠（侵襲）或不涂有（遷移）Transwell 上室加入200 μL細胞懸液，下室加入500 μL 完全培養基。培養24～48 h 后4%聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色30 min，PBS 清洗后顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行數據分析，插圖數據均采用GraphPad Prism 進行分析。符合正態分布的計量資料用均數和標準差（±s）表示，采用t檢驗；計數資料以頻數和百分比（n，%）描述，采用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SMRACAD1在胃癌中表達上調

分析TCGA-STAD 數據集發現SMRACAD1在胃癌組織中表達上調（P＜0.001），見圖1-A。此外，PCR 結果顯示，與GES-1 細胞相比，HGC-27 細胞（P＜0.01）和AGS 細胞（P＜0.001）中SMRACAD1表達顯著增高（圖1-B）。蛋白印跡法（Western blot，WB）結果與實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative realtime polymerase chain reaction，qPCR）結果一致，表明SMRACAD1的117kDa 的蛋白帶在HGC-27細胞和AGS 細胞中有差異，見圖1-C。

圖1 SMRACAD1在胃癌組織和胃癌細胞系中的表達Figure 1. Expression of SMRACAD1 in gastric cancer tissues and cell lines

2.2 SMRACAD1下調抑制胃癌細胞的增殖

使用特異性靶向SMRACAD1的慢病毒載體處理AGS 細胞后，PCR 結果提示AGS 細胞轉染shSMRACAD1后下調了SMRACAD1的表達（P＜0.001），見圖2-A。SMRACAD1表達下調后行CCK-8 檢測和平板克隆實驗，結果顯示與shCON 組相比，shSMRACAD1組的AGS 細胞增殖速度在第2 天開始減弱，在第3 天增殖速度明顯減慢（P＜0.001），并且顯著抑制了AGS 細胞的克隆形成數，見圖2-B、圖2-C。

圖2 下調SMRACAD1后AGS細胞的增殖活性Figure 2. The proliferation activity of AGS cells after downregulating SMRACAD1

2.3 SMRACAD1下調抑制胃癌細胞的遷移和侵襲

劃痕實驗結果顯示，與shCON 組相比，shSMRACAD1組AGS 細胞在12 h、24 h 內劃痕愈合速度明顯降低（P＜0.05），見圖3-A。此外，Transwell 遷移和侵襲實驗結果顯示，與shCON 組相比，shSMRACAD1降低了AGS 細胞的遷移數量（P＜0.01）和侵襲數量（P＜0.001），見圖3-B、圖3-C。

圖3 下調SMRACAD1后AGS細胞的遷移和侵襲能力Figure 3. The migration and invasion ability of AGS cells after downregulating SMRACAD1

2.4 SMRACAD1下調抑制胃癌細胞EMT和PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活

KEGG 富集分析結果顯示，SMRACAD1主要參與中間絲組織、依賴于中間絲的細胞過程、中間絲的細胞骨架組織和角質化（圖4-A）。SMRACAD1表達下調后AGS 細胞中上皮標志物E-cadherin 表達上調，間充質細胞標志物N-cadherin、間充質標志物Vimentin 和Snail 表達下調（圖4-B）。此外，與對照組相比，shSMRACAD1組AGS細胞PI3K、AKT、mTOR 表達無明顯差異，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR 表達下調（圖4-C）。

3 討論

近年來，隨著衛生標準的提高、幽門螺桿菌的根除和早期胃癌的篩查等，胃癌發病率從全球癌癥發病率第五位下降至第七位，但中國仍然是全球胃癌發病率和死亡率最高的地區[1,11-12]。盡管胃癌診斷及治療取得了顯著進展，但由于術后轉移復發，胃癌患者五年生存率在30%～35%[13]。探究胃癌進展的分子機制及新的治療靶點對胃癌的診斷和預后具有重要意義。

SMRACAD1是解旋酶超家族的染色質重塑ATP酶，在維持染色質穩定性方面起重要作用，特別是在DNA 雙鏈斷裂（DNA double-strand breaks, DSBs）修復中[14]。近年來，有研究發現SMRACAD1與腫瘤的進展和轉移有關。Al Kubaisy 等發現SMRACAD1促進乳腺癌細胞的遷移、侵襲和轉移，并減少細胞間黏附能力[9]。Arafat 等發現SMRACAD1在乳腺癌組織中表達升高，下調SMRACAD1表達可通過下調IKK-β 表達和減少STAT3 磷酸化減少乳腺癌細胞增殖、集落形成和腫瘤生長，可成為乳腺癌潛在的治療靶點[15]。Liu 等發現SMRACAD1在胰腺癌組織中表達上調，是胰腺癌預后的不利因素，且下調SMARCDA1表達后可通過抑制Wnt/ β-catenin 信號通路抑制胰腺癌細胞的增殖、侵襲和EMT[8]。本研究對TCGA 數據庫進行差異基因分析發現SMRACAD1在胃癌組織中表達上調，體外實驗發現SMRACAD1在胃癌細胞中表達上調。此外，下調SMRACAD1表達后AGS 細胞增殖、侵襲和遷移能力降低。

EMT 在腫瘤進展和遷移中起著重要作用，被認為是腫瘤細胞獲得更高侵襲和轉移能力的關鍵步驟[16]。許多信號通路參與EMT 的調控，其中PI3K/AKT/mTOR 信號通路與EMT 密切相關[17]。PI3K/AKT/mTOR 信號通路通過促進細胞增殖、血管生成、EMT 和化療耐性藥性等多種機制參與胃癌的進展和轉移[18]。KEGG 通路富集分析表明，SMARCDA1主要富集在與中間絲有關的信號通路。Vimentin 是蛋白質中間絲家族的主要成分，也是EMT 的關鍵生物標志物之一，有研究認為Vimentin 可作為癌癥治療的潛在分子靶點[19]。本研究發現下調SMRACAD1表達后E-catenin 表達升高，E-catenin、Vementin 和Snail 表達降低，這表明SMARCDA1通過誘導EMT 促進胃癌細胞轉移。本研究還發現下調SMRACAD1表達抑制了胃癌細胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR 的表達，因此，SMRACAD1可能通過PI3K/AKT/mTOR 信號通路促進胃癌細胞的EMT。

綜上所述，SMRACAD1在胃癌組織和胃癌細胞系中表達上調，下調SMRACAD1的表達可抑制胃癌細胞的EMT和PI3K/AKT/mTOR信號通路的活化，SMRACAD1可能通過激活PI3K/AKT/mTOR 信號通路誘導胃癌細胞的增殖、侵襲、遷移和EMT 過程。