清化腸飲對結腸炎相關結直腸癌小鼠及其腸道屏障功能的影響

危水香 張歆 王晗 曾玲靜 黃凱倫 游玲娜 吳異蘭

〔摘要〕 目的 觀察清化腸飲對結腸炎相關結直腸癌（colitis-associated colorectal cancer，CAC）小鼠及其腸道屏障功能的影響。方法 將40只C57BL/6小鼠隨機均分為空白組、模型組、清化腸飲組、陽性對照組。除空白組外，其余組均用氧化偶氮甲烷（azoxy？鄄methane，AOM）/葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium salt，DSS）聯合誘導建立CAC小鼠模型，清化腸飲組給予清化腸飲灌胃劑量為1.8 g/（kg·d）；陽性對照組給予柳氮磺吡啶混懸液0.45 g/（kg·d）；空白組給予等量無菌生理鹽水灌胃。均干預8周。觀察并記錄小鼠一般情況、體質量、疾病活動指數（disease activity index，DAI）及腫瘤長度；采用HE染色法觀察小鼠結直腸組織病理變化；采用Western blot法檢測小鼠結直腸組織中閉合蛋白-1（Claudin-1）、咬合蛋白（Occludin）、帶狀閉合蛋白-1（ZO-1）蛋白表達水平。結果 模型組出現便血、脫肛等情況。與空白組相比，模型組、清化腸飲組、陽性對照組小鼠DAI評分明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。與空白組相比，模型組、清化腸飲組、陽性對照組小鼠結直腸長度均縮短（P＜0.01或P＜0.05）；與模型組比較，清化腸飲組與陽性對照組結直腸長度增長（P＜0.01）。HE病理結果顯示，模型組腺體高級別管狀腺瘤形成，清化腸飲組存在低級別腺瘤和高級別瘤變。與空白組相比，模型組小鼠結直腸腫瘤組織中Claudin-1蛋白表達升高（P＜0.01），Occludin、ZO-1蛋白表達水平降低（P＜0.01）；與模型組相比，清化腸飲組、陽性對照組Claudin-1蛋白表達水平降低（P＜0.01），清化腸飲組、陽性對照組Occludin、ZO-1蛋白表達水平升高（P＜0.05或P＜0.01）。與清化腸飲組相比，陽性對照組Claudin-1蛋白表達水平降低（P＜0.01），Occludin、ZO-1蛋白表達水平升高（P＜0.01）。結論 清化腸飲可抑制CAC，其機制可能與改善腸道炎癥反應、調節腸道屏障功能相關。

〔關鍵詞〕 清化腸飲；結腸炎相關結直腸癌；腸道屏障；閉合蛋白-1；咬合蛋白；帶狀閉合蛋白-1

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.01.003

Effect of Qinghuachang Drink on mice with colitis-associated colorectal cancer and Intestinal barrier function

WEI Shuixiang1， ZHANG Xin2， WANG Han3， ZENG Lingjing1， HUANG Kailun1， YOU Lingna1， WU Yilan1*

1. Fujian University of Chinese Medicine， Fuzhou， Fujian 350122， China; 2. Clinical Skills Teaching Center， Fujian

University of Chinese Medicine， Fuzhou， Fujian 350122， China; 3. Department of Oncology， Fujian Medical University

Union Hospital， Fuzhou， Fujian 350001， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To observe the effects of Qinghuachang Drink （QHCD） on the mouse model of colitis-associated colorectal cancer （CAC） and its intestinal barrier function. Methods Forty C57BL/6 mice were randomized into blank group， model group， QHCD group， and positive control group. Except for blank group， the rest groups were induced to establish a CAC model by azoxymethane （AOM）/dextran sulfate sodium salt （DSS）. QHCD， positive control， and blank groups were given QHCD 1.8 g/（kg·d）， sulfasalazine suspension 0.45 g/（kg·d）， and the equal volume of sterile saline by gavage， respectively， for 14 d in succession. The general condition， body mass and disease activity index （DAI） of mice were observed and recorded; HE staining was used to observe the pathological changes in the colorectal tissue of mice; Western blot was used to determine the protein expression levels of Claudin-1， Occludin， ZO-1 in the colorectal tissue. Results The mice of model group had bloody stool and rectal prolapse. After intervention， the condition of mice in QHCD group was improved and the DAI score decreased （P<0.05 or P<0.01）. The pathological results of HE showed that high-grade tubular adenomas formed in model group， and low-grade adenomas and high-grade neoplasia were present in QHCD group， indicating that QHCD could alleviate intestinal inflammation and delay the progression of canceration. Compared with blank group， the protein expression level of Claudin-1 in the colorectal tissue of mice in model group was higher （P<0.01）， while the protein expression levels of Occludin and ZO-1 were lower （P<0.01）; compared with model group， the protein expression level of Claudin-1 in the colorectal tissue of mice in both QHCD and positive control groups decreased （P<0.01）， while the protein expression levels of Occludin and ZO-1 increased （P<0.05）. Conclusion QHCD can inhibit CAC， and the mechanism may be related to alleviating intestinal inflammatory response and regulating intestinal barrier function.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Qinghuachang Drink; colitis-associated colorectal cancer; intestinal barrier; Claudin-1; Occludin; ZO-1

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是一組慢性非特異性腸道炎癥性疾病，具有易復發、難治愈等特點。近年，我國IBD發病率呈現逐年上升趨勢[1-2]。研究發現，與一般人群相比，IBD患者發生結直腸癌的風險顯著增加[3]。目前，IBD的發病機制尚未完全明確，但研究發現機體腸道菌群失調，使得有害微生物增加，破壞腸道屏障，誘發炎癥反應[4]，長期患有IBD的患者更易發生結直腸癌[5]，又稱結腸炎相關結直腸癌（colitis-associated colorectal cancer，CAC）。

腸道屏障是抵御病原微生物進入機體的重要防線，腸道屏障功能障礙可能與緊密連接結構受損密切相關[6]，Claudin、Occludin、ZO蛋白家族為緊密連接蛋白的主要組成結構。其中，咬合蛋白（Occludin）是第一個被人們發現定位于緊密連接的跨膜蛋白[7]，為構成腸道屏障完整及調節通透性的重要分子蛋白。帶狀閉合蛋白-1（ZO-1）可與Occludin蛋白末端連接，相互作用維持腸道屏障的通透性與完整性[8]。閉合蛋白-1（Claudin-1）蛋白失調，可改變腸上皮細胞分化，并促進結腸炎發展，損害腸道修復能力[9]。因此，保護腸道屏障，促進腸道黏膜愈合，對治療IBD患者、預防癌變至關重要。

IBD基本病機為濕熱蘊結，氣血不和[10]。當濕熱久郁不化，則濕熱蘊毒，癌毒內生。清化腸飲源于張景岳《景岳全書·新方八陣》中的清化飲。國醫大師楊春波結合福建地理特點及飲食習慣，基于清化飲加減化裁，創制清化腸飲。清化腸飲具有清熱化濕、散瘀止血之效，主要由仙鶴草、黃連、地榆炭、豆蔻等中藥組成。臨床觀察發現，清化腸飲治療IBD不良反應少，療效顯著[11]。

本研究通過氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）/葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium salt，DSS）建立CAC小鼠模型，探討清化腸飲對腸道屏障功能及抑制CAC的作用機制，為臨床推廣應用清化腸飲治療CAC，提供實驗依據。

1 材料

1.1? 實驗動物

SPF級C57BL/6小鼠40只，雄性，6～8周，體質量18～22 g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司[合格證書SCXK（滬）2022-004]，飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心SPF級動物房，每籠5只，每只小鼠用耳號進行標記。依據國家標準嚙齒類動物飼料常規飼養，保持環境清潔，專用飼料，自由攝食、飲水，每日給予12 h光照時間，室內溫度（22±2） ℃，相對濕度50%～60%。每日更換飲水、添加飼料，隔日更換一次墊料。本研究已通過福建中醫藥大學實驗動物倫理管理委員會審定（倫理編號：FJTCM IACUC 2022052）。

1.2? 藥物及制備

清化腸飲組成：仙鶴草20 g，茯苓20 g，地榆炭15 g，薏苡仁15 g，茵陳10 g，炒白扁豆10 g，佩蘭10 g，赤芍10 g，姜厚樸6 g，豆蔻5 g，黃連3 g。中藥飲片購自福建中醫藥大學附屬第二人民醫院中藥房，制備成全成分中藥配方顆粒劑。顆粒劑加入煮沸的蒸餾水，充分攪拌，根據給藥劑量進行濃縮，置于4 ℃冰箱保存備用。陽性對照組采用柳氮磺吡啶，研磨成粉末狀后，用網篩過濾顆粒，加入蒸餾水，置于4 ℃冰箱保存備用。

1.3? 主要試劑及儀器

氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）（美國Sigma-Aldrich公司，批號：A5486）；葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium salt，DSS）（上海翌圣生物科技股份有限公司，批號：60316ES60）；Occludin蛋白抗體（武漢博士德生物工程有限公司，批號：BM4832）；Claudin-1蛋白抗體（武漢三鷹生物技術有限公司，批號：28674-1-AP）、ZO-1（武漢三鷹生物技術有限公司，批號：21773-1-AP）；柳氮磺吡啶腸溶片（上海信誼天平藥業有限公司，批號：H310209557）。

JXFTPRP-48型研磨機（上海凈信實業發展有限公司）；JID-17R型冷凍離心機（廣州吉迪儀器有限公司）；DYCP-31DN型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；ND-100c型紫外可見分光光度計（杭州米歐儀器有限公司）。

2 方法

2.1? 構建CAC小鼠模型及分組

本實驗采用10 mg/kg AOM與2% DSS聯合建立CAC模型[12-13]。C57BL/6雄性小鼠適應性喂養1周，采用隨機數字表法分為空白組、模型組、清化腸飲組、陽性對照組，每組10只。剔除死亡或造模失敗小鼠，按只數最少組，每組均隨機抽取6只。除空白組外，其余3組第1周第1日進行腹腔注射10 mg/kg AOM；空白組同時給予等量生理鹽水腹腔注射。第2周開始給予2% DSS自由飲用7 d，蒸餾水自由飲水14 d，3周為一個循環，共3個循環，9周，整個實驗共11周。清化腸飲組飲用DSS 7 d后，開始灌胃，依據人與動物按體表面積折算的等效劑量比值進行計算[14]。臨床上，清化腸飲用量以12 g/d來計算，成人劑量為0.2 g/（kg·d），計算出20 g小鼠劑量為1.8 g/kg。灌胃體積為0.1 mL/10 g，調整藥物濃度為0.18 g/mL，得出小鼠清化腸飲灌胃劑量為1.8 g/（kg·d）。同理，按成人每日用量3 g，計算得出陽性對照組給予柳氮磺吡啶混懸液0.45 g/（kg·d）灌胃；空白組給予等量無菌生理鹽水灌胃。

2.2? 小鼠一般情況、體質量與疾病活動指數（disease activity index，DAI）評估

每日于同一時間點，觀察小鼠的精神活動狀態、皮毛光澤情況、飲食及大便形狀等情況，每周固定時間測量并記錄小鼠的體質量。計算DAI評分。DAI=（體質量指數+大便性狀指數+便血指數）/3[15]，總分范圍為0～12分。根據狀態進行賦分：體質量下降0%，大便性狀正常，糞便隱血試驗呈陰性，各計0分；體質量下降6%～10%，大便性狀松散，糞便隱血試驗呈陽性，各計2分；體質量下降大于15%，水樣腹瀉，肉眼血便，各計4分。

2.3? 小鼠結直腸組織病理觀察

小鼠禁食不禁水12 h后，摘取眼球取血后，脫頸處死，沿腹中線打開腹腔，剪取回盲部至結直腸末端的腸段，用4 ℃預冷的生理鹽水清洗腸道，測量腸道長度。用眼科剪刀沿長軸方向剖開腸腔，置于白色背景下觀察是否有腫瘤生成并拍照。取小鼠結直腸組織，置于10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，HE染色，置于顯微境下進行病理學檢查，觀察各組結直腸組織癌變情況，并得出病理檢查報告。

2.4? 小鼠結直腸組織Claudin-1、Occludin、ZO-1蛋白表達檢測

采用Western blot法檢測小鼠結直腸組織Claudin-1、Occludin、ZO-1蛋白表達水平。取適量凍存小鼠結直腸組織，剪碎研磨，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，后電泳、轉膜，加入含5%脫脂奶粉進行封閉后，4 ℃過夜孵育一抗，TBST洗滌（3次，10 min/次），孵育二抗室溫2 h后，再次洗滌（3次，10 min/次）進行顯色，該實驗重復3次，以GAPDH為內參進行條帶灰度值分析。

2.5? 統計學方法

采用SPSS 26.0進行數據統計分析，符合正態分布的計量資料采用“ｘ±s”表示，多組間比較采用單因素方差分析。重復測量資料，符合正態分布，方差齊時采用重復測量方差分析；不符合正態分布，采用非結構化的廣義估計方程，統計圖經GraphPad Prism 8.0繪制。以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1? 清化腸飲對小鼠一般情況、DAI評分的影響

空白組小鼠毛色黝黑有光澤，精神狀態正常，食物攝入量、飲水量均正常，無腹瀉及便血情況發生。喂養DSS期間，模型組、清化腸飲組、陽性對照組小鼠均出現萎靡蜷縮，毛色稀疏欠光澤，食物攝入量與飲水量均有所減少。除空白組外，其余3組在DSS喂養3 d后，小鼠出現腹瀉、便血，部分小鼠后期出現脫肛現象。

實驗過程中，空白組小鼠體質量隨時間穩步增加。模型組、清化腸飲組、陽性對照組小鼠在DSS喂養期間的第2、5、8周，與空白組小鼠相比，體質量均下降（P＜0.01）；在3輪循環中，恢復蒸餾水飲用的第3、6、9、10周，模型組、清化腸飲組、陽性對照組小鼠體質量上升，與空白組相比，3組小鼠體質量差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組相比，清化腸飲組與陽性對照組體質量差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見圖1。

實驗過程中，DAI評分結果顯示：在3輪循環中，自由飲用DSS后，3組小鼠DAI評分均明顯升高，經藥物干預后，DAI評分逐漸下降。第2至10周，與空白組相比，模型組、清化腸飲組、陽性對照組小鼠DAI評分明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組相比，清化腸飲組、陽性對照組DAI評分差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見圖2。

3.2? 清化腸飲對小鼠腫瘤生成及腸道長度的影響

除空白組外，其余3組小鼠可見腫瘤在腸道內以大小不一的息肉狀向腸腔內突出隆起；與模型組相比，清化腸飲組與陽性對照組小鼠腫瘤數量減少。詳見圖3。

與空白組相比，模型組、清化腸飲組、陽性對照組小鼠結直腸長度均縮短（P＜0.01或P＜0.05）；與模型組相比，清化腸飲組與陽性對照組結直腸長度增長（P＜0.01）；與清化腸飲組相比，陽性對照組結直腸長度增長（P＜0.05）。詳見圖4。

3.3? 清化腸飲對小鼠結直腸組織形態的影響

空白組小鼠結腸各層結構清晰，無明顯異常，上皮細胞排列緊密，腺體及杯狀細胞未見減少。與空白組相比，模型組小鼠周邊腺體伴息肉樣增生，腺體高級別管狀腺瘤形成，伴可疑黏膜內腺體癌變，腺體背靠背，并融合成篩狀，炎性細胞浸潤，細胞失去極性，細胞核深染，伴異型。與模型組相比，清化腸飲組與陽性對照組癌變形成稍有減緩，形成低級別腺瘤。清化腸飲組周邊腺體伴息肉樣增生，杯狀細胞增生，伴高級別瘤變，腺體背靠背，細胞核深染，拉長，略呈筆桿狀。詳見圖5。

3.4? 清化腸飲對小鼠結直腸組織Claudin-1、Occludin、ZO-1蛋白表達的影響

與空白組相比，模型組小鼠結直腸腫瘤組織中Claudin-1蛋白表達升高（P＜0.01），Occludin、ZO-1蛋白表達水平降低（P＜0.01）；與模型組相比，清化腸飲組、陽性對照組Claudin-1蛋白表達水平降低（P＜0.01），Occludin、ZO-1蛋白表達水平升高（P＜0.05或P＜0.01）；與清化腸飲組相比，陽性對照組Claudin-1蛋白表達水平降低（P＜0.01），Occludin、ZO-1蛋白表達水平升高（P＜0.01）。詳見圖6、表1。

4 討論

CAC是IBD最為嚴重的并發癥之一，其發病過程呈現為“炎癥-不典型增生-癌變”[16]，防止IBD癌變是降低CAC發生率的有效方式之一。目前，IBD的西醫藥物治療有一定的不良反應，費用較為昂貴[17-18]，中醫學在防治IBD的實踐中積累了豐富的經驗，也發揮了至關重要的作用[19]。

大腸濕熱證為結直腸癌臨床最常見的證型之一。大多數醫家認為IBD病因為脾氣虧虛，外加感受外邪等，使得脾虛釀濕生熱，下注腸道，濕熱互結，損傷腸絡，而濕熱久郁不化致濕熱毒蘊，最終導致癌毒內生[20-21]。因此，清熱化濕法為防治結直腸癌的主要治法之一。清化腸飲包括仙鶴草、茯苓、地榆炭、薏苡仁、茵陳、炒白扁豆、佩蘭、赤芍、姜厚樸、豆蔻、黃連11味中藥。仙鶴草、地榆炭收斂止血，黃連清熱燥濕、瀉火解毒為君藥；赤芍活血涼血，豆蔻與姜厚樸理氣共為臣藥；茵陳清熱化濕，佩蘭芳香化濕，薏苡仁、炒白扁豆、茯苓健脾化濕，加強主藥祛濕作用為佐使藥。全方共奏清熱化濕、散瘀止血之效。研究發現，清化腸飲聯合灌腸Ⅲ號方可有效治療潰瘍性結腸炎，促進黏膜愈合[22]。本研究探討清化腸飲對CAC小鼠炎癌反應及腸道屏障的影響。

本研究采用AOM/DSS聯合應用構建CAC小鼠模型。該方案具有造模時間短、穩定性較強，且發病機制與人類相似等特點，是研究結直腸炎癌轉化適合的模型方案[23]。為降低小鼠死亡率，本研究依據相關文獻及預實驗調節DSS濃度[24]。結果顯示，造模后，小鼠出現萎靡、腹瀉、血便及脫肛情況，解剖后發現腫瘤生成，表明該濃度可刺激小鼠發生炎癥反應，促進炎癌轉化。研究發現，清化腸飲可抑制促炎因子分泌，抑制核因子kB信號通路激活[25]。本研究結果顯示，清化腸飲干預后，可改善小鼠結直腸長度縮短情況，降低DAI評分，且HE分析顯示炎性浸潤減輕。對各組小鼠結直腸進行肉眼觀察及病理分析，發現模型組腫瘤明顯，HE顯示已形成高級別腺瘤，伴黏膜內腺體癌變，清化腸飲組存在低級別腺瘤伴高級別瘤變。以上結果表明清化腸飲可有效減輕腸道炎癥反應，延緩癌變進展。

結腸炎發展過程中，刺激免疫細胞，從而釋放大量促炎細胞因子，進一步觸發免疫反應，損害上皮細胞緊密連接蛋白表達，破壞腸道上皮屏障[26]。細胞間緊密連接結構是腸道屏障功能的重要組成部分，由Occludin、Claudin和ZO-1等跨膜蛋白組成。緊密連接結構的異常改變，使得腸道通透性增強，屏障功能被破壞，將進一步促進促炎因子釋放，炎癥反應持續，引起癌變[27-28]。Occludin具有維持細胞間通透性，保持腸上皮細胞和緊密連接結構的保護作用。ZO-1是腸上皮細胞間的重要連接蛋白，對相鄰細胞間的滲透，細胞增殖、分化及生長等具有重要作用。在正常腸道上皮中，Claudin-1參與維持上皮細胞極性，調節腸道屏障通透性，對人體腸道屏障具有保護功能[29]。研究發現，Claudin-1在IBD中表達上調，且炎性因子可誘導Claudin-1，促進腫瘤生長[30]。隨著癌變的發展，其蛋白表達逐漸上調，在結直腸癌中呈現高表達[31]。ZO-1、Occludin蛋白在結直腸癌小鼠中呈現低表達[32]。ZO-1、Occludin蛋白表達上調，可抑制腫瘤的侵襲與增殖[33]。研究表明，清化腸飲可通過上調緊密連接蛋白Occludin、ZO-1的表達，恢復腸道黏膜屏障功能，抑制腸道炎癥反應的發生發展[34]。研究結果與上述結果保持一致，清化腸飲干預后，Claudin-1的表達水平降低，Occludin、ZO-1的表達水平升高，表明清化腸飲可調節腸道緊密連接蛋白表達，從而促進腸道屏障功能恢復。

綜上所述，清化腸飲可改善CAC小鼠模型結腸炎癥狀，延緩癌變進展，可能是通過調節小鼠腸道屏障中Claudin-1、Occludin、ZO-1緊密連接蛋白的表達，一定程度上恢復腸道屏障功能及完整性，抑制CAC的發展。前期研究表明，清化腸飲可有效治療潰瘍性結腸炎[22]。本研究為清化腸飲臨床防治CAC提供了實驗依據，并初步探討其可能的機制，而清化腸飲對CAC的臨床療效及具體作用機制仍需進一步驗證。

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