基于Klotho、PI3K、Akt蛋白表達水平探討補腎活血湯對絕經后骨質疏松大鼠骨骼、血管及腎臟功能的影響

蔣佳豪 彭興寧 吳官保 譚婉俊 馮帥華

〔摘要〕 目的 通過觀察補腎活血湯對去勢大鼠股骨近端、主動脈外膜及腎小管中可羅索（Klotho）蛋白，大鼠股骨近端磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）蛋白及蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）表達水平的影響，探討補腎活血湯治療絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）的作用機制。方法 選取6月齡SD雌性大鼠31只，第1次隨機分為空白組8只、假手術組5只、手術組18只，手術造模8周后隨機處死空白組和手術組大鼠各3只，評估造模成功后，手術組按隨機數字表法第2次分組：模型組5只、補腎活血湯組5只、戊酸雌二醇組5只。然后分組給藥：空白組、假手術組及模型組予以蒸餾水灌胃，補腎活血湯組予補腎活血湯3.32 mg/kg灌胃，戊酸雌二醇組予戊酸雌二醇0.1 mg/kg灌胃，連續給藥8周。觀察大鼠的一般情況；分光光度法測定血清鈣含量；偶聯反應法測定血清磷含量；骨密度掃描儀測量股骨近端的骨密度；電鏡觀察股骨近端的骨細胞；HE染色觀察大鼠股骨近端的病理變化；ELISA法檢測大鼠股骨近端、主動脈外膜及腎小管中Klotho蛋白的水平；Western blot檢測大鼠股骨近端中Klotho、PI3K及Akt蛋白的相對表達水平。結果 與模型組比較，補腎活血湯組和戊酸雌二醇組大鼠的平均體質量較重、活力較好，飲食及毛發情況未見明顯差異。與模型組比較，補腎活血湯組和戊酸雌二醇組大鼠股骨近端細胞、骨小管形態數量均有不同程度恢復，股骨近端骨組織骨質疏松病變均得到不同程度的修復。與空白組、假手術組比較，模型組、補腎活血湯組血清鈣含量降低（P＜0.01，P＜0.05）；與模型組比較，戊酸雌二醇組血清鈣含量增加（P＜0.05）。與空白組、假手術組比較，模型組骨密度明顯降低（P＜0.01）；股骨近端、主動脈外膜及腎小管中Klotho蛋白含量明顯減少（P＜0.01）；骨組織中Klotho蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），PI3K、Akt蛋白表達水平顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，補腎活血湯組、戊酸雌二醇組股骨近端、主動脈外膜及腎小管中Klotho蛋白含量明顯增加（P＜0.01）；骨組織中Klotho蛋白表達水平顯著增加（P＜0.01），PI3K、Akt蛋白表達水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。與補腎活血湯組比較，戊酸雌二醇組股骨近端及腎小管中Klotho蛋白含量增加（P＜0.05，P＜0.01），骨組織中PI3K、Akt蛋白表達水平降低（P＜0.05）。各組大鼠血清磷含量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。結論 補腎活血湯可通過提高股骨近端、主動脈外膜及腎小管中Klotho蛋白的表達，抑制股骨近端中PI3K蛋白、Akt蛋白的表達，一定程度上緩解去勢大鼠的骨質疏松樣病變，其作用機制可能與抑制骨細胞凋亡、改善腎臟功能及循環系統功能相關。

〔關鍵詞〕 補腎活血湯；絕經后骨質疏松癥；可羅索蛋白；磷脂酰肌醇3-激酶；蛋白激酶B

〔中圖分類號〕R274? ? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.01.002

Effects of Bushen Huoxue Decoction on skeletal， vascular， and renal functions in postmenopausal osteoporosis rats based on protein?expressions of Klotho， PI3K， and Akt

JIANG Jiahao1， PENG Xingning2，3， WU Guanbao2， TAN Wanjun2，3， FENG Shuaihua2*

1. The First People's Hospital of Kunshan， Suzhou， Jiangsu 215300， China; 2. The Hospital of Hunan Academy of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410006， China; 3. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To observe the effects of Bushen Huoxue Decoction （BSHXD） on the protein expression level of Klotho in the proximal femur， adventitia of aorta， and renal tubules as well as those of phosphatidylinositol 3-kinase （PI3K） and protein kinase B （Akt） in the proximal femur of ovariectomized rats， so as to explore the mechanism of action of BSHXD in treating postmenopausal osteoporosis （PMOP）. Methods Thirty-one 6-month-old female SD rats were randomly divided into blank group （n=8）， sham-operated group （n=5）， and surgery group （n=18）. After eight weeks of surgical modeling， three rats from blank group and another three from surgery group were randomly selected and sacrificed. After successful modeling， the remaining rats in the surgery group were subdivided into model group （n=5）， BSHXD group （n=5）， and estradiol valerate group （n=5） according to the random number table method. Then， blank， sham-operated， and model groups were given distilled water， BSHXD group was given BSHXD 3.32 mg/kg， and estradiol valerate group was given estradiol valerate 0.1 mg/kg. All groups were treated by gavage continuously for eight weeks. The general condition of rats was observed; the serum calcium content was measured by spectrophotometry; the serum phosphorus content was determined by coupled reaction method; bone mineral density of the proximal femur was measured by bone density scanner， and the bone cells were examined by electron microscopy. In addition， the pathological changes in the proximal femur were observed by HE staining; Klotho protein level in the proximal femur， aortic adventitia， and renal tubules was measured by ELISA; the relative expression levels of Klotho， PI3K， and Akt proteins in the proximal femur were checked by Western blot. Results Compared with model group， the rats in BSHXD and estradiol valerate groups showed higher average body weight and better vitality， and there was no significant difference in the condition of diet and hair; the number and form of bone cells and bone tubules in the proximal femur were restored to varying degrees， and the osteoporotic lesions were also repaired to different extent. Compared with blank and sham-operated groups， the serum calcium content of rats in model and BSHXD groups was lower （P<0.01， P<0.05）; compared with model group， the serum calcium content of rats in estradiol valerate group was higher （P<0.05）. Compared with blank and sham-operated groups， rats in model group showed a significant decrease in the bone mineral density （P<0.01）， as well as in the Klotho protein content in the proximal femur， aortic adventitia， and renal tubules （P<0.01）; the Klotho protein expression in the bone tissue was significantly reduced （P<0.01）， while the protein expressions of PI3K and Akt were significantly elevated （P<0.01）. Compared with model group， the Klotho protein content in the proximal femur， aortic adventitia， and renal tubules of rats in BSHXD and estradiol valerate groups increased （P<0.01）; the Klotho protein expression in the bone tissue was significantly higher （P<0.01）， while the protein expressions of PI3K and Akt were significantly lower （P<0.05， P<0.01）. Compared with BSHXD group， the Klotho protein content in the proximal femur and renal tubules of rats in estradiol valerate group increased （P<0.05）， while the protein expressions of PI3K and Akt in the bone tissue decreased （P<0.05）. Moreover， there was no statistical difference in serum phosphorus content among the groups （P>0.05）. Conclusion BSHXD can alleviate the osteoporosis-like lesions of ovariectomized rats to a certain extent by elevating the Klotho protein expression in the proximal femur， aortic adventitia， and renal tubules and inhibiting the protein expressions of PI3K and Akt in the proximal femur. And its mechanism of action may be related to inhibiting osteocyte apoptosis and improving renal function and circulatory system function.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Bushen Huoxue Decoction; postmenopausal osteoporosis; Klotho protein; phosphatidylinositol 3-kinase; protein kinase B

絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）的主要發病機制是圍絕經期女性雌激素水平降低，導致破骨細胞吸收、骨丟失和骨折[1]。PMOP是骨質疏松癥（osteoporosis，OP）中占比最高的類型，全球老年人OP的患病率已高達21.7%[2]。由于骨質不斷流失，OP最嚴重的并發癥骨質疏松性骨折發病率不斷攀升[2]。年齡增長作為骨質疏松最主要的危險因素，往往伴隨各器官功能的衰退[3]。因此，PMOP的病程進展與器官功能的衰退密切相關。目前，治療OP的藥物有骨鈣化劑、骨吸收抑制劑、骨形成促進劑等。靶向性藥物可有效提高骨密度，但沒有證據表明這些藥物能夠改善機體器官功能，且長期服用存在一定的副作用[4]。中醫學對OP具有獨特的認識，針對OP的發病特點，形成了以補腎活血法為代表的治療方法和理論體系。補腎活血湯防治PMOP已廣泛運用于臨床，取得了較好的療效[5]。因此，本研究團隊從補腎活血湯對可羅索（Klotho）蛋白、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）蛋白及蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）蛋白表達水平的影響方面研究其作用機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物

實驗動物選取6月齡SD雌性大鼠31只，由湖南省中醫藥研究院動物實驗室提供，許可證號：SCXK（湘）2019-0004。大鼠一般情況均良好，稱重得體質量（220±20） g。動物的飼養和試驗方案遵守中國試驗動物管理條例（衛生部第55號文件）和湖南中醫藥大學動物實驗倫理要求，倫理審批編號：ZYFY20230209-03。

1.2? 實驗藥品制備

1.2.1? 補腎活血湯中藥溶液? 參考《傷科大成·應用諸方篇》中記載的補腎活血湯組成[6]，按照現代臨床常用劑量：熟地黃15 g，杜仲10 g，枸杞子10 g，補骨脂15 g，菟絲子10 g，當歸尾10 g，沒藥10 g，山茱萸10 g，肉蓯蓉10 g，獨活10 g，紅花6 g。方中藥材由湖南省中醫藥研究院附屬醫院藥劑科提供，生產批號分別為：21070016、21040340、21040149、21050160、21035144、21070012、21075321、21050205、21040318、21050063、21060344。通過浸泡、煎煮、去渣，濃縮至0.58 g/mL的補腎活血湯中藥溶液（臨床等效劑量），封瓶備用。

1.2.2? 戊酸雌二醇溶液? 戊酸雌二醇（法國DELPH？鄄ARM Lille S.A.S公司，批號：H20160679）由湖南省中醫藥研究院附屬醫院藥劑科提供，溶解于50 ℃的純凈水中制成藥物濃度0.018 mg/mL的戊酸雌二醇溶液（臨床等效劑量），封瓶備用。

1.3? 主要試劑及儀器

DDSA、NMA、DMP30（北京中鏡科儀技術有限公司，批號：GS02827、GS02828、GS02823）；Klotho（武漢華美生物工程有限公司，批號：CSB-E14958r）；BCA蛋白定量試劑盒（中國Abiowell公司，批號：AWB0104）；TEMED（中國Abiowell公司，批號：AWB0068）。

透射電子顯微鏡（日本電子JEOL，型號：JEM1400）；切片機（德國萊卡公司，型號：leica UC-7）；電泳儀、轉膜儀（中國北京六一公司，型號分別為：DYY-6C、DYCZ-40D）；精密pH計（中國雷磁公司，型號：PHS-3C）；生物樣品均質儀（中國杭州奧盛公司，型號：BioPrep-24）；顯微鏡（Motic公司，型號：BA210T）；臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，型號：H1650R）。

2 實驗方法

2.1? 動物分組

31只6月齡SD雌性大鼠適應性喂養3 d后，稱重排號按隨機數字表第一次分組：空白組8只、假手術組5只、手術組18只，造模后第8周隨機處死空白組和手術組大鼠各3只，評估造模成功后，手術組按隨機數字表第二次分組：模型組5只、補腎活血湯組5只、戊酸雌二醇組5只。

2.2? 造模方法

參照陳沙的造模方法[7]，以卵巢切除術去勢方法造模。具體操作：將約1 mL的2%利多卡因注射液注入大鼠腹腔進行麻醉，取側臥位固定頭和四肢。術前嚴格消毒、備皮，術中全程注意無菌，在脊柱旁開約1 cm背部肋骨下緣作縱行切口，剝離肌肉夾起卵巢，用可吸收線結扎后摘除，術口采用皮內縫合，假手術組采用相同方法在卵巢周圍剝除相同重量的脂肪組織。術后腹腔內連續注射3 d的青霉素1 U，禁食不禁水1 d。手術組大鼠造模當天大鼠均蘇醒，3 d后查看一般情況良好，切口均對位、愈合良好，喂養第8周隨機處死空白組和手術組大鼠各3只，運用骨形態學方法，根據HE染色對比觀察股骨近端骨組織形態，評估模型。與空白組比較，手術組大鼠HE染色顯示股骨內骨小梁細短，間隙較大，可見結構斷裂，連續性差且不完整，提示造模成功[8]。詳見圖1。

2.3? 給藥方法

第8周起逐日給大鼠灌胃，共計8周。給藥劑量按照人體和SD雌性大鼠體表面積比換算[9]：補腎活血湯組予補腎活血湯3.32 mg/kg灌胃，戊酸雌二醇組予戊酸雌二醇0.1 mg/kg灌胃，空白組、假手術組、模型組予以等量蒸餾水灌胃。

2.4? 觀察指標

2.4.1? 觀察大鼠的一般情況? 觀察大鼠存活情況、活力、飲食、體質量及毛發。

2.4.2? 測定血清中鈣、磷含量? 采用尾尖采血的方法取大鼠血液。分光光度法測定血清鈣，鄰-甲酚酞絡合酮和偶氮砷Ⅲ作為染色劑，利用堿性溶液將樣本中與蛋白質結合鈣和復合鈣釋放出鈣離子后與染色劑結合反應后測定。偶聯反應法測定血清磷，參與反應的酶有糖原磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶及葡萄糖6-磷酸脫氫酶，反應中使煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸還原成還原型輔酶Ⅱ，形成還原型輔酶Ⅱ在340 nm波長下測定其吸光度。

2.4.3? 骨密度掃描儀測量股骨近端的骨密度 腹腔注入2%的利多卡因注射液麻醉后頸椎脫臼法處死大鼠，立即摘取右側股骨，分離股骨近端骨組織，按相同方向排列在骨密度掃描儀探頭下進行掃描。

2.4.4? 電鏡觀察大鼠股骨近端的骨細胞 取大鼠股骨近端骨細胞置于孔徑2 nm的載樣銅網上，室溫下靜置3 min，用濾紙從濾網側邊吸干液體，滴加3%磷鎢酸溶液30 μL，室溫環境下負染5 min，在室溫下干燥，于透射電鏡下觀察細胞結構形態并拍攝。

2.4.5? HE染色檢測大鼠股骨近端的形態病變? 60 ℃烤片12 h；切片脫蠟至水：先將切片置于二甲苯中20 min，3次。然后依次置于100%、100%、95%、85%和75%乙醇中，每級放置5 min。再用蒸餾水浸洗5 min；蘇木精染色1～10 min，蒸餾水沖洗，PBS返藍；伊紅染色1～5 min，蒸餾水沖洗；梯度乙醇脫水，每級5 min。取出后置于二甲苯10 min，2次，中性樹膠封片，顯微鏡觀察股骨近端的形態變化。

2.4.6? ELISA檢測大鼠股骨近端、主動脈外膜及腎小管中Klotho蛋白的水平? 稀釋BSA標準品；配制BCA工作液；定量檢測：將稀釋好的BSA標準品和待測蛋白樣品各25 μL分別加到做好標記的96孔板微孔中。每孔加入200 μL BCA工作液，充分混勻，蓋上96孔板蓋，37 ℃孵育30 min，冷卻至室溫，須在3～5 min內完成檢測。用酶標儀在540～590 nm范圍內，測定每個樣品及BSA標準品的吸光值，同時做好記錄。繪制標準曲線，計算樣品中的蛋白濃度。

2.4.7? Western blot檢測大鼠股骨近端中Klotho蛋白、PI3K蛋白及Akt蛋白的表達水平? 取股骨近端骨細胞按細胞蛋白提取試劑盒說明進行細胞蛋白提取，冰上孵育20 min后12 000 r/min離心20 min（離心半徑6 cm），收集上清液，采用BCA法計算蛋白含量。將制備好的蛋白樣品加入10%的凝膠中電泳，轉膜，封閉液中封閉后，用蒸餾水將一步法試劑盒中的10×洗液稀釋為1×洗液；將二抗HRP放入離心管，使一抗與二抗充分混勻，于室溫條件下孵育5 min，加入一抗（1∶500），4 ℃過夜，TBST洗膜，加入二抗（1∶5 000）孵育，傾去抗體混合液，用洗液漂洗3次。在反應盒內加入高靈敏度化學發光檢測試劑盒A液及B液各1 mL，混勻，放入PVDF膜，ECL化學發光試劑顯色曝光，凝膠成像系統分析結果。目的蛋白相對表達量=目的蛋白表達量/同一樣本內參表達量。

2.5? 統計學方法

實驗數據均采用SPSS 23.0統計軟件進行分析。計量資料以“ｘ±s”表示，組間比較采用卡方檢驗、t檢驗和析因設計資料的方差分析。單因素方差分析檢驗先進行Levene方差齊性檢驗，整體比較時方差齊者用F檢驗，方差不齊者用近似F檢驗Welch法，多重比較時方差齊者采用LSD法，方差不齊者采用Dunnett' T3法。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1? 各組大鼠一般情況比較

干預結束后，空白組與假手術組大鼠的飲食、毛發、體質量及活力情況未見明顯差異；模型組大鼠飲食明顯減少，毛發粗糙無光澤，體重明顯減輕，活力顯著下降；與模型組比較，補腎活血湯組和戊酸雌二醇組大鼠的平均體質量較重、活力較好，飲食及毛發情況未見明顯差異。

3.2? 各組大鼠血清中鈣、磷含量比較

與空白組、假手術組比較，模型組、補腎活血湯組血清鈣含量降低（P＜0.01，P＜0.05）；與模型組比較，戊酸雌二醇組血清鈣含量增加（P＜0.05）。各組大鼠血清磷含量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見表1。

3.3? 各組大鼠股骨近端骨密度水平比較

與空白組、假手術組比較，模型組骨密度明顯降低（P＜0.01）。詳見表2。

3.4? 各組大鼠電鏡下骨細胞形態比較

空白組和假手術組大鼠股骨近端骨細胞形態較為規則，骨小管較多且細長，呈輻射狀，細胞核尚飽滿，未見明顯病理改變；模型組細胞形狀不規則且結構紊亂，分布較少的骨小管，且骨小管較短小，胞核出現明顯破裂皺縮；補腎活血湯組和戊酸雌二醇組大鼠股骨近端細胞及骨小管形態數量均有不同程度恢復。詳見圖2。

3.5? 各組大鼠骨組織HE染色比較

空白組和假手術組大鼠股骨結構連續完整，骨小梁較厚，間距較小，數目較多，結構致密。模型組大鼠股骨近端見股骨骺端松質骨密度較低，骨小梁稀疏，連接減少，出現斷裂、變形等；松質骨內紅骨髓轉化為黃骨髓，脂肪堆積增加。而補腎活血湯組和戊酸雌二醇組大鼠股骨近端骨組織骨質疏松病變均得到不同程度的修復。詳見圖3。

3.6? 各組大鼠股骨近端、主動脈及腎小管中Klotho蛋白含量比較

與空白組、假手術組比較，模型組股骨近端、主動脈外膜及腎小管中Klotho蛋白含量明顯減少（P＜0.01）；與模型組比較，補腎活血湯組、戊酸雌二醇組股骨近端、主動脈外膜及腎小管中Klotho蛋白含量明顯增加（P＜0.01）；與補腎活血湯組比較，戊酸雌二醇組股骨近端及腎小管中Klotho蛋白含量增加（P＜0.05，P＜0.01）。詳見表3。

3.7? 各組大鼠骨組織中Klotho、PI3K及Akt蛋白表達水平比較

與空白組、假手術組比較，模型組骨組織中Klotho蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），PI3K、Akt蛋白表達水平顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，補腎活血湯組和戊酸雌二醇組骨組織中Klotho蛋白表達水平顯著增加（P＜0.01），PI3K、Akt蛋白表達水平降低（P＜0.05，P＜0.01）；與補腎活血湯組比較，戊酸雌二醇組骨組織中PI3K、Akt蛋白表達水平降低（P＜0.05）。詳見圖4、表4。

4 討論

Klotho蛋白在調控鈣、磷代謝中發揮著重要的作用[10]。Klotho蛋白能與成纖維細胞生長因子受體1（fibroblast growth factor receptor 1，FGFR1）結合，增加FGF23分泌，同時抑制1，25-二羥維生素D3的合成，從而降低血磷[11]。另外Klotho蛋白通過刺激腎小管上皮細胞的鈣通道來促進骨吸收釋放血磷，從而維持血磷的穩定[11]。Klotho蛋白調控血鈣平衡主要是刺激破骨細胞進行骨重吸收，通過瞬態受體電位（transient receptor potential， TRP）通道促進骨鈣的釋放，同時TRP能刺激腎臟遠曲小管重吸收鈣以維持血鈣平衡[12]。在本研究中，我們發現Klotho蛋白的調控失衡是PMOP大鼠鈣、磷代謝異常的原因之一。補腎活血湯能增加Klotho蛋白的表達，但對于鈣、磷代謝的調節作用不顯著，有待進一步研究。

Klotho蛋白主要由腎臟產生，是重要的抗衰老因子[10]。研究表明，與衰老相關的許多疾病都與Klotho蛋白的表達下降有關[13-14]。在本實驗中，我們發現模型組骨密度與體內Klotho蛋白均降低，證明PMOP發病可能與Klotho蛋白的表達下降有關。因為Klotho蛋白能夠調控骨形成和骨吸收[15]。研究表明，Klotho蛋白能調節骨特異性轉錄因子Runx2，促進骨組織的形成和修復；并抑制Runx2的基質金屬蛋白酶-13，從而減緩破骨細胞的移行和骨基質的吸收[16]。因此，Klotho蛋白高表達時，PMOP大鼠的骨小梁數目和骨形態結構均明顯改善。在本研究中，補腎活血湯組大鼠的骨密度未見顯著改善，但骨質疏松樣病理損傷明顯緩解，與前人研究結果基本一致。疾病研究發現，Klotho蛋白的低表達會導致慢性腎病患者發生血管鈣化和骨質疏松[17]。腎臟分泌的Klotho蛋白能有效逆轉或改善血管鈣化及骨質疏松[18-19]。因為Klotho蛋白具有修復器官衰老的作用[20]。而Klotho蛋白的分泌在與衰老無關的疾病中通常沒有顯著差異，例如腎性高血壓患者的Klotho水平沒有改變[21]。因此，可以推斷Klotho蛋白的表達能特異性反映器官功能。在本實驗模型中，Klotho蛋白在PMOP大鼠的骨組織、主動脈及腎組織中均呈現低表達，反映了大鼠骨骼、血管及腎臟功能的減退。表明PMOP的發生和發展與多器官功能相關，而非單一骨骼改變。在本研究中，補腎活血湯干預后有效提高了大鼠股骨近端、主動脈外膜和腎小管中Klotho蛋白的表達，結果表明補腎活血湯治療PMOP的機制可能與改善臟腑功能有關。

Klotho蛋白能調控PI3K/Akt通路，通過對線粒體凋亡的調控影響細胞的凋亡、增殖和分化[22]。PI3K/Akt通路的調節機制和生物學功能對骨骼、血管、腎臟等組織均有重要意義[23-24]。本實驗數據表明補腎活血湯減緩骨細胞凋亡可能通過提高Klotho蛋白，抑制PI3K、Akt蛋白實現。研究發現，PI3K/Akt通路作用于骨骼后，能修復骨細胞形態，增加骨小管數量，一定程度恢復骨小梁厚度，減少骨髓腔內脂肪細胞分布，修復骨組織的病理改變。本實驗結果表明，補腎活血湯同樣能提高臟器功能、延緩骨細胞凋亡，對Klotho、PI3K、Akt蛋白的調控作用接近戊酸雌二醇，且在骨組織和細胞的修復方面優于戊酸雌二醇。臨床研究數據表明，補腎活血湯療效明確，并能有效減少治療時的不良反應，是治療PMOP的可靠藥物[25]。

本研究結果提示，器官功能減退可能是PMOP發生的關鍵因素。已有研究者嘗試通過靶向抑制細胞衰老改善骨小梁和皮質骨的骨量和骨微結構[26]。中醫藥治療PMOP等退行性疾病具有顯著優勢。中醫學認為PMOP的發病機制是“腎虛為本，血瘀為標”。補腎活血湯是中醫治療腎虛血瘀型PMOP的代表方劑，方中熟地黃、杜仲為君藥，補肝益腎、填精壯骨；山茱萸、枸杞子、肉蓯蓉、補骨脂、菟絲子為臣藥，有溫補元陽、使筋骨堅強、增強君藥的治療作用；當歸尾、沒藥、紅花為佐藥，通經活絡、行氣活血，通則不痛；獨活祛風除濕、宣痹止痛。本方組方嚴謹，以補益肝腎為主，從本質入手，扶正祛邪，佐以活血化瘀、祛風除濕的藥物，療效顯著。

綜上所述，補腎活血湯可通過提高股骨近端、主動脈外膜及腎小管中Klotho蛋白的表達，抑制股骨近端中PI3K蛋白、Akt蛋白的表達，一定程度上緩解去勢大鼠的骨質疏松樣病變，其作用機制可能與抑制骨細胞凋亡、改善腎臟功能及循環系統功能相關。

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