天名精內生真菌的分離鑒定及抗肝癌活性研究

張藝 姚思凡 孫伍慧 歐陽琳 趙碧清 周小江

〔摘要〕 目的 對天名精內生真菌進行分離和鑒定，并從中篩選出具有抗肝癌作用的活性菌株，為尋找新的抗肝癌先導化合物提供菌株資源。方法 采用植物組織切塊法和平板劃線法對天名精內生真菌進行分離純化；MTT法篩選對肝癌HepG2細胞增殖具有抑制作用的活性菌株，并計算活性顯著內生真菌的IC50值；運用形態學鑒定和分子鑒定的方法對活性菌株進行鑒定。結果 從天名精中共分離得到60株內生真菌，其中TMJ-03、TMJ-13、TMJ-15、TMJ-23、TMJ-54為活性內生真菌，其發酵物抑制HepG2細胞增殖的IC50值分別為19.49（TMJ-C-03）、31.13（TMJ-C-13）、88.65（TMJ-C-15）、37.42（TMJ-D-23）、17.22（TMJ-D-54）、32.72（TMJ-C-54） μg·mL-1。5株活性菌株均鑒定到種，分別為Aspergillus terreus、Chaetomium globosum、Alternaria tillandsiae、Fusarium proliferatum、Alternaria arborescens。結論 首次從天名精中篩選出對HepG2細胞增殖具有抑制作用的活性內生真菌，為尋找新的抗肝癌藥物提供了菌株資源。

〔關鍵詞〕 天名精；內生真菌；分離鑒定；抗肝癌；HepG2細胞；活性菌株

〔中圖分類號〕R284.1；R285.5? ? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.01.007

Isolation， identification， and anti-hepatoma activity of endophytic

fungi from Carpesium abrotanoides

ZHANG Yi1， YAO Sifan1， SUN Wuhui1， OUYANG Lin1， ZHAO Biqing1， ZHOU Xiaojiang1，2*

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Hunan Engineering Technology Research Center for Standardization and Function of Chinese Herbal Decoction Pieces， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To isolate and identify endophytic fungi from Carpesium abrotanoides and screen active strains with anti-hepatoma effects， so as to provide strain resources for the development of new anti-hepatoma lead compounds. Methods The endophytic fungi were isolated and purified from Carpesium abrotanoides by plant tissue culture and scribing method， the active strains with inhibitory effects on the proliferation of HepG2 cells were screened by MTT， and the IC50 value of the notably active endophytic fungi was calculated. Morphological and molecular identification were then applied for the identification of active strains. Results Sixty strains of endophytic fungi were isolated from Carpesium abrotanoides， among which， TMJ-03， TMJ-13， TMJ-15， TMJ-23， and TMJ-54 were active. The IC50 values of their fermentation products inhibiting the proliferation of HepG2 cells were 19.49 （TMJ-C-03）， 31.13 （TMJ-C-13）， 88.65 （TMJ-C-15）， 37.42 （TMJ-D-23）， 17.22 （TMJ-D-54）， and 32.72 （TMJ-C-54） μg·mL-1， respectively. These five active strains have been identified to species level， namely Aspergillus terreus， Chaetomium globosum， Alternaria tillandsiae， Fusarium proliferatum， and Alternaria arborescens. Conclusion The active endophytic fungi with inhibitory effects on the HepG2 cell proliferation were screened from Carpesium abrotanoides for the first time， which can provide strain resources for the development of new anti-hepatoma drugs.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Carpesium abrotanoides; endophytic fungi; isolation and identification; anti-hepatoma; HepG2 cells; active strains

內生真菌（endophytic fungi）是指在其生活史的某一段時期生活在植物組織內，對植物組織沒有引起明顯病害癥狀的真菌[1-2]。內生真菌在與宿主植物長期協同進化過程中形成了互惠共生關系，許多內生真菌帶有植物體的酶系，使得內生真菌能夠產生與宿主植物相同或相似的次級代謝產物，具有與宿主相似的藥理作用[3-4]。自STROBEL等[5]從短葉紅豆杉的內生真菌Taxomyces andreanae中得到紫杉醇以來，植物內生真菌迅速被國內外研究者關注，成為研究熱點，藥用植物內生真菌代謝產物的多樣性為尋找新穎天然活性化合物提供了有效途徑[6]。

天名精為菊科植物天名精Carpesium abrotanoides L.的干燥全草。味辛，性寒，歸肝、肺經，有清熱解毒、散瘀止痛、止血及殺蟲的功效，可用于治療牙痛、胃潰瘍、膿腫、扁桃體炎、支氣管炎、細菌感染、瘀傷、腫脹、病毒感染、蟲積等[7-9]。天名精含有倍半萜、倍半萜二聚體、單萜、甾醇和含氮化合物等多種成分，具有抗腫瘤、抗寄生蟲、抗炎、抗氧化和抗病毒等生物活性[9-12]。目前，天名精的研究主要集中于化學成分、藥理活性、臨床應用等領域[13-15]，對其內生真菌多樣性的研究尚未有報道。近年來從天名精中分離得到的化合物特勒內酯、2α，5α-dihydroxy-11αH-eudesma-4（15）-en-12，8β-olide、2-去氧-4-表-天人菊靈、oxoeudesm-11（13）-eno-12，8α-lactone、2，3-Dihydroaromomaticin、11（13）-去氫腋生依瓦菊素、5α-Epoxyal？鄄antolactone、Ivalin等均對HepG2細胞表現出較強的抑制作用[16-18]，根據互惠共生關系，天名精內生真菌中可能產生與天名精相同或相似的抗肝癌活性成分，為了更好地開發利用天名精內生真菌資源，本課題組對天名精內生真菌進行研究，獲得抗肝癌活性菌株，旨在為將來新型抗肝癌活性成分發現和藥物開發打下基礎。

1 材料

1.1? 藥材

天名精于2021年11月采自湖南中醫藥大學含浦校區周邊，經湖南中醫藥大學中藥鑒定教研室周小江教授鑒定為菊科植物天名精C. abrotanoides L.的新鮮全草。

1.2? 主要儀器與試劑

HERAcell 150i CO2細胞培養箱、ST8/ST8R高速冷凍離心機、Multiskan FC酶標儀（賽默飛世爾科技有限公司）；SW-CJ-1C超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；ATX124 電子天平（東京島津儀器有限公司）。

青霉素-鏈霉素溶液（批號：WH1022C211）、HepG2專用培養基（批號：WHAA23N022）、0.25% EDTA-胰蛋白酶溶液（批號：WH2622U261）均購于武漢普諾賽生命科技有限公司；MTT噻唑藍（批號：163880，上海陶術生物科技有限公司）；二甲基亞砜（批號：401Q0313，北京索萊寶科技有限公司）；順鉑（批號：153593，MedChemExpress公司）。

1.3? 培養基

PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，純凈水1 L。PDA-抗生素培養基：PDA培養基中加青霉素使濃度為100.0 mg·mL-1。大米培養基：大米200 g，純凈水100 mL。糙米培養基：糙米80 g，純凈水120 mL。

2 方法

2.1? 內生真菌的分離和純化

取天名精新鮮植株，蒸餾水沖洗干凈后，剪切成2 cm左右的片塊，在超凈工作臺用75%乙醇浸泡1 min，無菌水沖洗3～4次，2%次氯酸鈉溶液浸泡2 min，無菌水清洗5次后吸干表面水分，修剪去末端暴露組織，新切口接種于PDA-抗生素培養基平板，每板接種4～5塊片，封口膜密封，28 ℃恒溫培養3～7 d，待接種植物組織周圍長出菌絲時，用接種環挑取新長菌絲至PDA平板，如此反復純化直至得到單一菌株。以最后1次清洗植物的無菌水作為無菌參照，確保分離得到的菌株為天名精內生真菌。將純化好的菌株接種至斜面培養基中，4 ℃保存。

2.2? 內生真菌的發酵培養

將4 ℃保存的菌株接種至PDA平板培養基，置于28 ℃培養箱中活化7 d后，分別切塊接種至不同培養基中發酵，具體如下：大米培養基接種帶菌平板后，常溫下靜置25 d，進行發酵；糙米培養基接種帶菌平板后，常溫下靜置40 d，進行發酵。

2.3? 內生真菌發酵提取物的制備

菌株發酵結束后，加入等體積乙酸乙酯，將大米（糙米）帶菌培養基搗碎，浸泡過夜，超聲提取3次，每次10 min，濾過，合并濾液，減壓回收乙酸乙酯，得提取物，備用。

2.4? 內生真菌抑制HepG2細胞增殖活性測定

2.4.1? MTT法篩選抑制HepG2細胞增殖的活性菌株? 取生長狀態良好的HepG2細胞，按5×104的密度，接種于96孔板，每孔100 μL，培養箱中培養24 h后，棄去舊培養液。給藥組（即120個內生真菌發酵提取物組TMJ-大米-1～TMJ-大米-60和TMJ-糙米-1～TMJ-糙米-60后續為了簡便大米用D表示，糙米用C表示）加入250 μg·mL-1的天名精內生真菌發酵提取物工作液，陽性藥組加入250 μg·mL-1的順鉑工作液，正常對照組加入含1% FBS的DMEM培養基，每孔100 μL，每組設5個復孔。繼續培養24 h后，棄去舊培養液，每孔加100 μL MTT溶液（0.5 mg·mL-1），繼續培養4 h后，避光條件下小心吸棄上清液，避免吸去紫色結晶。每孔加150 μL

DMSO，震搖10 min，于490 nm波長下，酶標儀檢測各孔OD值。重復3次，計算各組抑制率，結果以均值表示。抑制率=[（正常對照組-給藥組）/正常對照組]×100%

2.4.2? 活性菌株抑制HepG2細胞增殖的IC50值測定? 按照MTT法檢測，具體操作同上。給藥組加入不同濃度（0、6.25、12.5、25、50、100 μg·mL-1）含藥培養基，正常對照組加入含1% FBS的DMEM培養基，每組設5個復孔，每孔100 μL。每組實驗獨立重復3次，取均值并繪制生長曲線，計算IC50值。

2.5? 活性內生真菌的鑒定

2.5.1? 形態特征? 將純化好的菌株接種在PDA培養基上，將滅菌的蓋玻片以45°角斜插入培養基中制作菌絲玻片，倒置顯微鏡下觀察菌絲、孢子形態，參考《真菌鑒定手冊》對菌株類型進行初步鑒定。

2.5.2? 分子生物學鑒定? 采用真菌基因組提取試劑盒提取菌株DNA，用通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'），ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTG？鄄ATATGC-3'）擴增，反應體系25 μL：PCR Mix 21 μL，Primer F（5p） 1 μL，Primer R（5p） 1 μL，模板2 μL。反應程序：96 ℃預變性5 min；96 ℃變性20 s，56 ℃復性30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物送北京六合華大基因科技有限公司測序。測序片段用BLAST軟件進行同源性比對，通過MEGA 7.0軟件中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）、基于Kimura 2-parameter距離構建菌株系統發育進化樹，并以自展法Bootstrap進行檢驗，自展次數設為1 000次。

3 結果

3.1? 內生真菌的分離與活性菌株的篩選

從新鮮天名精中共分離得到60株內生真菌，分別為TMJ-1～TMJ-60，其中大米培養基中菌株TMJ-（13、15、23、51、54），糙米培養基中菌株TMJ-（2、3、6、7、13、15、23、37、40、43、51、54），對HepG2細胞有明顯抑制作用（圖1），這表明以上12株內生真菌為活性內生真菌。

3.2? 活性菌株抑制HepG2增殖的IC50值

計算出各組的抑制率，通過Graphpad prism 8.0軟件進行數據分析測出各藥物的IC50值，本文僅記錄活性顯著的內生真菌即IC50值小于100 μg·mL-1?；钚跃旮鹘M抑制率，隨藥物濃度遞增，抑制率變大，抑制效果越強，菌株TMJ-54的大米發酵物在質量濃度為100 μg·mL-1時抑制率最大，為94.49%。在活性菌株發酵提取物抑制HepG2細胞增殖的IC50值中，TMJ-D-54的IC50值最小，為17.22 μg·mL-1，說明TMJ-54的大米發酵物對HepG2細胞增殖的抑制能力在這5株活性菌株當中最強。詳見表1。

3.3? 活性內生真菌的鑒定

3.3.1? 形態學鑒定

3.3.1.1? 菌株TMJ-03特征? 在PDA培養基上菌落邊緣不整齊，呈圓形或近圓形，中心稍隆起，質地為絨毛狀，淡黃色至黃褐色（圖2a），背面為淡黃色（圖2b）。菌絲無色，有隔（圖2c），分生孢子頭呈疏松放射狀，黑褐色色素沉積，分生孢子梗光滑、透明，分生孢子為球形（圖2d），根據以上形態學特征觀察，初步鑒定為曲霉屬真菌。

3.3.1.2? 菌株TMJ-13特征? 在PDA培養基上菌落為羊毛狀或棉花狀，初起白色狀菌落，后來變為橄欖綠色或棕灰色（圖2e），背面灰色至黑色（圖2f）。兩周時隱約可見白色菌落中心散布灰色或黑色子囊殼小點，反面呈棕色至棕紅色。菌絲有隔，無色（圖2g），子囊殼球狀暗棕色至黑色，單個或聚集成團，外被各種形狀的附屬絲，附屬絲棕色（圖2h），根據以上形態學特征觀察，初步鑒定為毛殼屬真菌。

3.3.1.3? 菌株TMJ-15特征? 在PDA培養基上氣生菌絲初為白色，后為灰粉色至灰色，外觀絨毛狀（圖2i），背面橘紅色后變黑色（圖2j），菌絲無色、透明有隔膜，分生孢子梗直立或膝狀，分支或不分支（圖2k），分生孢子有的無喙，有的具柱狀假喙，形狀變化極大，卵形、橢圓形、倒棍棒形，表面有縊縮，淡褐色或深褐色，有橫隔膜1～6個（圖2l），根據以上形態學特征觀察，初步鑒定為鏈格孢屬真菌。

3.3.1.4 菌株TMJ-23特征? 在PDA培養基上菌落呈圓形，菌絲白色疏松、絮狀（圖2m），背面黃色，略帶粉色（圖2n）。菌絲具隔膜，無色，小型分生孢子狹長圓形，較多（圖2o），大型分生孢子，紡錘形或鐮刀形，較粗壯，稍彎曲，較少（圖2p），根據以上形態學特征觀察，初步鑒定為鐮刀屬真菌。

3.3.1.5? 菌株TMJ-54特征? 在PDA培養基上氣生菌絲初為白色，后為綠褐色至黑褐色，外觀絨毛狀（圖2q），背面黑色（圖2r），菌絲有隔膜，無色、透明，分生孢子梗直立或膝狀，分支或不分支（圖2s），分生孢子同TMJ-15（圖2t），根據以上形態學特征觀察，初步鑒定為鏈格孢屬真菌。

3.3.2? ITS序列分析鑒定? ITS擴增序列為ITS1和ITS2，大小為600 bp左右（圖3）?；谡婢腎TS序列比對結果以及構建系統進化樹，對活性內生真菌進行分子鑒定。

菌株TMJ-03與Aspergillus terreus（MT530046.1）聚類在同一進化支上，ITS序列的同源性為100%，鑒定為A. terreus（圖4）；菌株TMJ-13與Chaetomium globosum（MT420609.1）聚類在同一進化支上，ITS序列完全匹配，同源性為100%，鑒定為C. globosum；菌株TMJ-15與Alternaria tillandsiae（KU144925.1）聚類在同一進化支上，ITS序列的同源性為99%，鑒定為A. tillandsiae；菌株TMJ-23與Fusarium proliferatum（MK611678.1）聚類在同一進化支上，ITS序列的同源性為100%，鑒定為F. proliferatum；菌株TMJ-54與菌株Alternaria. arborescens（MT420628.1）構成一個支持力100%的分支，ITS序列的同源性為100%，鑒定為A. arborescens。經NCBI序列比對，結合形態學和分子生物學方法，初步將菌株TMJ-03鑒定為A. terreus；TMJ-13鑒定為C. globosum；TMJ-15鑒定為A.tillandsiae；TMJ-23鑒定為F. proliferatum；TMJ-54鑒定為A. arborescens。

4 討論

本研究首次對天名精內生真菌進行系統分離培養，共得到60株內生真菌。對分離得到的60株內生真菌分別進行大米、糙米培養基發酵，采用MTT法對內生真菌發酵提取物抑制HepG2細胞增殖作用進行了篩選，最終得到5株抗肝癌活性較好的內生真菌。經鑒定5株活性內生真菌分別屬于曲霉屬Aspergillus、毛殼菌屬Chaetomium、鏈格孢屬Alternaria和鐮刀菌屬Fusarium，以上4屬內生真菌，均有抗肝癌活性報道。比如，青蒿內生真菌毛殼菌屬Chaetomium菌株分離得到的化合物毛殼球菌素W，具有較好的抗肝癌活性[19]。毛葡萄Vitis quinquangularis內生真菌鏈格孢屬Alternaria菌株分離得到的化合物alterperylenol能夠抑制HepG2細胞生長，并誘導其凋亡和鐵死亡[20]。黃芪內生真菌曲霉屬Aspergillus菌株分離得到的喜樹堿能夠抑制HepG2細胞生長，其IC50值為0.9 mmol·L-1[21]。Dysosma diffomis內生真菌曲霉屬Aspergillus菌株發酵提取物具有較強的抗癌活性其IC50<5 μg·mL-1，利用高效液相分析發現該提取物中含有鬼臼毒素，提示該內生真菌可作為鬼臼毒素的潛在來源[22]。由此可見，本研究分離培養的天名精活性內生真菌具有抗肝癌活性成分的潛力，但其抗肝癌的具體成分還有待深入研究。

此外，本研究發現天名精內生真菌A. arborescens（TMJ-54）的大米發酵物和糙米發酵物均對HepG2細胞具有較好的抑制作用，與TMJ-54菌株同屬的A. alternate L-10菌株產生的兩種具有新骨架的聚酮化合物，alternatones A-B （1-2），其中alternatone A （1）對人肝癌HepG2細胞系表現出細胞毒性[23]。紅樹林內生真菌Alternaria sp.分離得到的3個新化合物resveratrodehydes A-C （1-3），均對HepG2細胞表現出抑制作用（IC50<50 μmol·L-1）[24]。Vitis quinquangularis內生真菌鏈格孢屬（Alternaria sp.）真菌中分離出一對具有新骨架的對映體聚酮化合物（±）alternamgin，其中（-）alternamgin對HepG2細胞表現出一定的細胞毒性，且在一定程度上能夠誘導HepG2細胞凋亡[25]。因此，推斷TMJ-54菌株發酵物有可能存在新的抗肝癌活性成分，值得進一步深入研究。

綜上，本研究篩選出的活性內生真菌可能為潛在的新型抗肝癌活性成分的來源，今后將對活性菌株的次生代謝產物和抗肝癌作用機制進行深入研究，以期為開發新型抗肝癌藥物打下基礎。

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