養陰寧神方對去勢小鼠海馬神經元突觸的可塑性調節

雷華娟 田豐銘 易健 鄧涓 李梓歐 戴金城 郭芬樂 李樂 劉柏炎

〔摘要〕 目的 觀察養陰寧神方對雌性小鼠去勢后認知功能的影響。方法 將60只C57BL/6J雌性小鼠隨機分為假手術組，模型組，雌激素組，低、中、高劑量組，每組10只。假手術組僅切開皮膚和腹膜，不摘除小鼠的卵巢；其余各組均進行雙側卵巢切除術。假手術組、模型組均給予等容量的生理鹽水（0.1 mL/10 g），雌激素[雌二醇（estradiol， E2），0.09 mg/kg]組及低劑量組（9.459 g/kg）、中劑量組（18.459 g/kg）、高劑量組（36.99 g/kg）灌胃藥液，均灌胃3周。記錄小鼠術后傷口愈合時間，去勢前、去勢1周、去勢4周進行水迷宮潛伏實驗和穿梭實驗測試小鼠的學習記憶功能。采用ELISA法測定血清E2含量；HE染色觀察小鼠海馬神經元的形態；尼氏染色觀察海馬神經尼氏染色陽性細胞的數量；共聚焦顯微鏡下觀察小鼠海馬神經元細胞超微結構情況。結果 與假手術組相比，模型組傷口愈合時間延長（P<0.05）；與模型組、雌激素組及低、高劑量組比較，中劑量組傷口愈合時間縮短（P<0.05）。去勢1周，與假手術組比較，模型組、雌激素組及低、中、高劑量組逃避潛伏期延長、穿梭次數減少（P<0.05）。去勢4周，與假手術組比較，模型組逃避潛伏期延長、穿梭次數減少（P<0.05）；與模型組相比，雌激素組及低、中、高劑量組逃避潛伏期縮短、穿梭次數增加（P<0.05）。去勢4周，與假手術組比較，模型組E2濃度明顯降低（P<0.01）；與模型組比較，雌激素組及低、中、高劑量組E2濃度明顯增高（P<0.01）。尼氏染色顯示，與假手術組比較，模型組尼氏陽性細胞數減少（P<0.01）；與模型組比較，雌激素組及低、中、高劑量組尼氏陽性細胞數增加（P<0.01）。HE染色顯示，假手術組，雌激素組，低、中、高劑量組錐體神經元增多，且突起明顯；模型組錐體神經元較少、顆粒細胞較多。共聚焦顯微鏡下見，假手術組，雌激素組，低、中、高劑量組海馬神經元囊泡和突觸粗面內質網結構增多；模型組海馬神經元囊泡和突觸減少。結論 養陰寧神方可能通過提高血漿E2水平、改善海馬神經元突觸形態和功能可塑性、增加去勢小鼠的認知功能，從而發揮腦保護作用。

〔關鍵詞〕 養陰寧神方；去勢；雌激素；海馬；神經元；突觸可塑性

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.01.005

Modulation of synaptic plasticity of the hippocampus in ovariectomized mice by Yangyin Ningshen Formula

LEI Huajuan1，2， TIAN Fengming1， YI Jian1， DENG Juan1，3， LI Zi'ou1，3， DAI Jincheng4，

GUO Fengle1， LI Le2， LIU Baiyan3*

1. Department of Anesthesiology， The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 2. Changsha Medical University， Changsha， Hunan 410219， China; 3. Hunan Academy of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410013， China; 4. Xinjiang Medical University， Urumqi， Xinjiang 830054， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To observe the effects of Yangyin Ningshen Formula （YYNSF） on cognitive function in ovariectomized female mice. Methods Sixty C57BL/6J female mice were randomly divided into sham-operated group， model group， estrogen group， and low-， medium-， and high-dose YYNSF groups， with 10 mice in each group. Sham-operated group underwent skin and peritoneal incision without removing the ovaries， while the rest groups were subject to bilateral ovariectomy. Sham-operated and model groups were given equal volume of saline （0.1 ml/10 g）， while estrogen group [estradiol （E2）， 0.09 mg/kg]， and low- （9.459 g/kg）， medium- （18.459 g/kg）， and high-dose （36.99 g/kg） YYNSF groups were given corresponding medications. All groups were treated by gavage for three weeks. The wound healing time after surgery was recorded. Morris water maze with recording latency and cross times were carried out before ovariectomy， one week and four weeks after ovariectomy respectively， in order to assess the learning and memory function of the mice. ELISA was used to measure the level of serum E2; HE staining was performed to observe morphology of the hippocampal neurons; Nissl staining was used to observe the number of Nissl-positive cells in the hippocampus; confocal microscopy was used to observe the ultrastructures in the hippocampal neurons. Results The wound healing time of model group was longer than that of sham-operated group （P<0.05）. Compared with model， estrogen， and low- and high-dose YYNSF groups， the wound healing time of medium-dose YYNSF group was shortened （P<0.05）. The Morris water maze test revealed that compared with sham-operated group， all other groups showed prolonged escape latency and reduced cross times at one week after ovariectomy （P<0.05）. At four weeks after ovariectomy， model group showed prolonged escape latency and reduced cross times compared with sham-operated group （P<0.05）. Compared with model group， estrogen and low-， medium-， and high-dose YYNSF groups showed shorter escape latency and more cross times （P<0.05）. Compared with sham-operated group， E2 level in model group decreased significantly at four weeks after ovariectomy （P<0.01）; while compared with model group， E2 level in estrogen and low-， medium-， and high-dose YYNSF groups increased significantly （P<0.01）. Compared with sham-operated group， Nissl staining demonstrated a decrease in the number of Nissl-positive cells in the hippocampus of model group （P<0.01）; while compared with model group， the number of Nissl-positive cells in the hippocampus of estrogen and low-， medium-， and high-dose YYNSF groups showed an increase （P<0.01）. HE staining showed increased pyramidal neurons and their dendritic synapses in sham-operated， estrogen， and low-， medium-， and high-dose YYNSF groups， and fewer pyramidal neurons and more granule cells in model group. Confocal microscopy showed increased synaptic vesicles and rough endoplasmic reticula in the hippocampal neurons of sham-operated， estrogen， and low-， medium-， and high-dose YYNSF groups， and decreased synapses and their vesicles in the hippocampal neurons of model group. Conclusion YYNSF may exert protective effects on the brain by increasing plasma E2 level， improving synaptic morphology and plasticity of the hippocampal neurons， and enhancing cognitive function of the ovariectomized mice.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Yangyin Ningshen Formula; ovariectomy; estrogen; hippocampus; neuron; synaptic plasticity

隨著全球老齡人口逐漸上升，2025年全球圍絕經期和絕經后婦女人口預計增長至11億[1]。圍絕經期指生殖能力衰退至完全喪失的階段，臨床上指最后一次月經至最后一次月經結束后的一年[2]。大多數圍絕經期跨度為1～2年，長者可達10年[3]，圍絕經期綜合征主要以潮熱、盜汗、心煩、圍絕經期健忘等為臨床表現[4]，其中，圍絕經期健忘主要以學習及記憶能力下降、注意力變差為主要表現，可伴有焦慮、抑郁或者其他異常情緒[5]。然而，圍絕經期健忘由于無特征性的臨床表現，易被個人、家庭和臨床忽視?；颊吆苌僖驀^經期認知功能減退單獨就診，常出現漏診、誤診[6]，不僅影響女性的生活質量，還會增加阿爾茨海默病的患病風險[7]。

圍絕經期健忘是圍絕經期腦功能衰老最主要的表現之一，與雌激素水平降低有關[8]。雌激素不僅參與維持正常生殖功能，在大腦神經元能量代謝、氧化應激、神經營養及再生維持和炎癥抑制等方面也發揮重要生理作用[9]。研究表明，圍絕經期雌激素水平變化，通過電生理、代謝、神經化學、微觀結構和行為學等對腦產生影響，特別是海馬雌激素可通過對雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα）的調節，發揮對記憶功能的調控[10]：一方面，雌二醇（estradiol， E2）通過海馬神經元能量代謝調節影響ERα的功能；另一方面，ERα調節神經元網絡興奮性，通過對海馬神經元突觸結構和功能的可塑性調節而調控認知功能，從而影響預后和轉歸[11]。

中醫學將圍絕經期健忘歸屬于“呆癥”范疇。圍絕經期健忘病位在腦，與肝、腎關系最密切，主要臨床表現為腦對記憶力的存儲、處理和輸出功能下降。劉柏炎教授在多年的臨床觀察中發現，肝腎陰虛、肝郁氣滯是圍絕經期健忘的主要病因、病機。圍絕經期健忘與腎虛肝郁關系密切?；诟文I同源理論，腎精不足，肝氣郁結，神失所養導致“腦”核心的記憶功能失調[12]。因此，劉柏炎教授提出，“腎-肝-腦”軸理論在圍絕經期健忘中有重要意義[13]。養陰寧神方為劉柏炎教授自創的經驗方，由清代著名醫書《傅青主女科》中所記載的益經湯化裁而來。益經湯是治療圍絕經期綜合征的經典名方，主要用于治療圍絕經期綜合征之煩躁、盜汗、失眠、眩暈、焦慮和抑郁癥狀[14]。目前，養陰寧神方對圍絕經期健忘的影響鮮有研究，養陰寧神方化裁后通過大補腎水、疏肝解郁、養血柔肝，共奏補精生髓益智、養陰寧神之效，進而改善圍絕經期雌激素下降所致健忘。

本研究通過雌性小鼠雙側卵巢切除術建立去勢模型，模擬圍絕經期雌激素急劇變化，觀察去勢后小鼠認知功能的變化[14]。通過養陰寧神方干預，判斷其對去勢小鼠海馬神經元可塑性的影響，以期為圍絕經期健忘的防治提供實驗證據。

1 材料

1.1? 實驗動物

健康C57BL/6J雌性小鼠60只，鼠齡6個月，體質量20～25 g，飼養溫度22～26 ℃，濕度50%～70%。所有動物均由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號： SCXK（湘）2019-0004。動物自購入之日起，飼養于湖南中醫藥大學第一附屬醫院SPF級實驗動物中心，光暗周期12 h/12 h，自由攝取食物與水，按實驗動物3R原則給予人道關懷。本動物實驗通過湖南中醫藥大學第一附屬醫院動物實驗倫理審查（編號：ZYFY20190418）。

1.2? 試驗藥物及制備

養陰寧神方：熟地黃30 g，炒酸棗仁15 g，山茱萸12 g，柴胡、白芍、沙參、牡丹皮各10 g，當歸8 g。藥材購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科，由湖南省超微中藥工程技術中心制備藥液，濃縮至含生藥1.5 g/mL，分裝入200 mL廣口無菌試劑瓶中，于4 ℃冰箱中保存備用。戊酸雌二醇（1 mg/片，國藥準字：J20171038，德國拜耳公司）。

1.3? 主要試劑

小鼠E2、睪酮ELISA試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，批號：JL11790、JL12550）；尼氏抗體（江蘇菲亞生物科技有限公司，批號：G1430）；蘇木素、伊紅、結晶紫染色液（武漢博士德生物工程有限公司，批號：AR1180-1、AR1180-2、C8470）；2.5%戊二醛（北京索萊寶生物科技有限公司，批號：P1126）；Epon-812包埋劑（美國SPI公司，批號：SPI-02660）；戊巴比妥鈉（德國Merck KGaA公司，批號：P3761）。

1.4? 主要儀器

光學顯微鏡、圖像分析系統（日本Olympus公司，型號：BX51、Image-Pro Express 4）；水迷宮軟件（西班牙Panlab公司，型號：Smart3.0）；動物質量天平（上海精密儀器儀表有限公司，型號：YB102）；透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司，型號：HT7700）；攤片機、超薄切片機（德國LEICA公司，型號：UC-7）；恒溫干燥箱（上海福碼實驗設備有限公司，型號：DGX-9073B-1）。

2 方法

2.1? 動物分組及給藥

60只6月齡雌性小鼠自購入之日起，適應性飼養1周后，隨機分為6組：假手術組、模型組、雌激素組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組10只。所有動物均喂養普通飼料，并用耳標鉗打好記號。

2.2? 模型制備與鑒定

2.2.1? 雌性小鼠的去勢模型制備? 雌性小鼠用1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）行腹腔注射，等待到達足夠的麻醉深度[15]，運用聚維酮碘常規消毒側腹部皮膚，剪除約1.5 cm毛發，于髂前上棘上1 cm切開皮膚及腹部肌肉，切開腹膜，分離結扎雙側卵巢動脈后，切除雙側卵巢，止血后縫合腹膜、肌肉和皮膚。假手術組僅切開皮膚和腹膜，不摘除小鼠的卵巢。每天給予傷口換藥一次。

2.2.2? 去勢模型鑒定? 將小鼠放在鼠籠蓋上，用一個單獨尖端含有無菌蒸餾水（25～50 μL）的負壓吸引管沖洗陰道口。然后將沖洗液滴在玻片涂片上，干燥、結晶紫染色1 min、無菌蒸餾水沖洗2次后進行觀察。去勢后3、7、10 d，共檢測3次小鼠陰道脫落細胞，去勢成功的標準為：小鼠陰道涂片細胞多為白細胞，而未去勢小鼠為多形上皮細胞[16]。

2.3? 動物給藥

取熟地黃30 g，炒酸棗仁15 g，山茱萸12 g，柴胡、白芍、沙參、牡丹皮各10 g，當歸8 g，總共105 g生藥，以60 kg的成人用量，按體表面積計算為1.75 g/kg，假設人的標準體質量為60 kg，人的標準體表面積為1.62 m2；假設小鼠的標準體質量為0.02 kg，小鼠的標準體表面積為0.007 m2，設定K=標準體質量/標準體表面積，則Rab=K人/K小鼠=12.33，根據人與小鼠的標準質量換算公式：Db=Da·Rab，成人即1.75 g/kg，Rab取12.33，養陰寧神方小鼠中劑量則為21.577 5 g/kg，低劑量為10.788 7 g/kg，高劑量為43.155 0 g/kg[17]。采用旋轉蒸發儀濃縮養陰寧神方藥液至含生藥劑量為1.5 g/mL。根據小鼠體積（10 mL/kg）計算灌胃劑量，灌胃2次/d，連續21 d。戊酸雌二醇灌胃劑量為0.09 mg/kg[18]。

2.4? 小鼠傷口愈合時間觀察

給予聚維酮碘消毒傷口，每天1次，并記錄去勢后每只小鼠的傷口愈合時間。

2.5? 水迷宮實驗

采用Morris水迷宮系統評估小鼠的空間學習記憶能力[19]，選取潛伏期和穿梭次數進行分析，水迷宮被分為1、2、3、4象限，第4象限設置平臺，水位淹沒平臺1 cm，并被牛奶顏色所覆蓋。

2.5.1? 定位巡航實驗? 實驗共歷時5 d，每天固定時間段，每個時間段訓練4次，每次訓練90 s，間隔20 s，訓練4次后進行測試，記錄第5天小鼠找到平臺的時間（逃避潛伏期），作為小鼠定位巡航的成績。

2.5.2? 空間探索實驗 在訓練的第6天撤除平臺，小鼠從第1象限入水，記錄小鼠在60 s內跨越原平臺的穿梭次數，作為空間探索實驗的成績。整個實驗過程中水溫控制在25 ℃。

2.6? ELISA檢測

采用ELISA法測定小鼠血漿E2 7個濃度梯度點，通過鏈酶素-HRP反應，封板、溫育、洗滌，吸水拍干，顯色、加樣、加酶，最后在空白孔調零，450 nm波長處測量OD值。

2.7? HE染色

海馬組織依次通過不同濃度乙醇脫水，依次浸泡于2個二甲苯中透明；再將海馬組織浸泡于2個石蠟缸包埋制成蠟塊。將海馬蠟塊預冷后固定、切片，然后烤片。石蠟切片脫蠟，最終染色并使用中性樹膠封片。

2.8? 尼氏染色

石蠟切片用4%多聚甲醛固定10 min，蒸餾水洗滌2 min，換用新鮮蒸餾水再洗滌2 min，尼氏染色液染色10 min。蒸餾水洗滌，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察尼氏陽性細胞數量，并用Image J軟件進行處理。

2.9? 電鏡觀察海馬神經元超微結構

在冰上解剖海馬組織，并放入2.5%戊二醛中固定，然后用0.01 mmol/L PBS（pH 7.3）漂洗，1%鋨酸室溫固定后脫水，脫水后用Epon-812包埋劑包埋海馬，再用超薄切片機，將小鼠海馬組織切成60～80 nm超薄切片，最后用電子顯微鏡觀察。

2.10? 統計學處理

應用SPSS 22.0統計軟件對數據進行統計分析，所有數據以“ｘ±s”表示，多組間比較采用單因素方差分析檢驗，符合正態分布、方差齊者采用LSD法，符合正態分布、方差不齊者采用秩和檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1? 各組小鼠傷口愈合時間比較

與假手術組相比，其余各組小鼠傷口愈合時間延長（P<0.05）；與模型組、雌激素組、低劑量組、高劑量組相比，中劑量組小鼠傷口愈合時間縮短（P<0.05）。詳見表1。

3.2? 各組小鼠水迷宮測試結果比較

3.2.1? 定位巡航實驗? 去勢前，各組小鼠尋找平臺的逃避潛伏期時間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。去勢1周，與假手術組比較，其余各組小鼠尋找平臺的逃避潛伏期時間延長（P<0.05）。去勢4周，與假手術組比較，模型組小鼠尋找平臺的逃避潛伏期時間延長（P<0.05）；與模型組比較，雌激素組及低、中、高劑量組小鼠尋找平臺的逃避潛伏期時間縮短（P<0.05）。與去勢前比較，去勢1周，模型組、雌激素組及低、中、高劑量組小鼠尋找平臺的逃避潛伏期時間延長（P<0.05）。與去勢1周比較，去勢4周，雌激素組及低、中、高劑量組小鼠尋找平臺的逃避潛伏期時間延長（P<0.05）。詳見圖1、表2。

3.2.2? 空間探索實驗? 去勢前，各組小鼠穿梭次數比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。去勢1周，與假手術組相比，其余各組小鼠穿梭次數減少（P<0.05）。去勢4周，與假手術組比較，模型組小鼠穿梭次數減少（P<0.05）；與模型組比較，雌激素組及低、中、高劑量組小鼠穿梭次數增加（P<0.05）。與去勢前比較，去勢1周，模型組、雌激素組及低、中、高劑量組小鼠穿梭次數減少（P<0.05）。與去勢1周比較，去勢4周，雌激素組及低、中、高劑量組小鼠穿梭次數增加（P<0.05）。詳見圖1、表3。

3.3? 各組小鼠E2濃度的比較

去勢4周，與假手術組比較，模型組E2濃度降低（P<0.01）；與模型組比較，雌激素組及低、中、高劑量組E2濃度增高（P<0.01）。詳見表4。

3.4? 各組小鼠HE染色比較

假手術組小鼠海馬區神經元細胞排列緊密、整齊，錐體神經元數量較多，核濃染，神經元突觸細長且明顯。模型組海馬區表現為顆粒細胞多、錐體神經元稀少。雌激素組及低、中、高劑量組錐體神經元數量增多，樹突突起增加。詳見圖2。

3.5? 各組小鼠海馬神經元尼氏染色比較

去勢4周，與假手術組比較，模型組尼氏染色陽性細胞數減少（P<0.01）；與模型組比較，雌激素組及低、中、高劑量組尼氏染色陽性細胞數明顯增加（P<0.01）。詳見圖3、表5。

3.6? 各組小鼠海馬神經元突觸可塑性比較

假手術組神經元突觸量多，突觸內囊泡清晰可見。去勢4周，模型組可見囊泡、突觸減少，海馬神經元出現核糖體稀疏、粗面內質網減少。與模型組相比，雌激素組及低、中、高劑量組突觸和粗面內質網結構增多。詳見圖4。

4 討論

圍絕經期綜合征除生殖系統改變明顯外，還出現潮熱、心慌、出汗、記憶力下降等一系列臨床表現[4]。目前，圍絕經期大腦記憶功能減退備受關注，圍絕經期女性健忘的發生率是絕經前的1.4倍，其獨立于潮紅、焦慮、抑郁之外，需要引起臨床醫師的重視[18]。圍絕經期綜合征與卵巢功能密切相關，生物學特征為血液中雌激素劇烈波動，特別是血漿E2水平。近幾十年來，E2已成為治療雌激素缺乏（雙側卵巢切除致絕經）和雌激素減少（自然絕經）的一線用藥。除對生殖功能的影響，雌激素還能改善大腦功能，在研究中得到越來越多的重視[20]。E2片劑臨床用量是1 mg/d，為0.02～0.33 mg/kg[21]。早期補充雌激素的效果更佳，特別是對記憶功能的改善作用。但是長期雌激素治療可能增加子宮內膜癌、乳腺癌等腫瘤和血栓發生的風險[22]，如何利用雌激素改善記憶功能，同時又不增加腫瘤和血栓發生的風險是目前臨床上的難點之一。

養陰寧神方是劉柏炎教授的經驗方，劉柏炎教授從中醫腎、肝、腦的關系出發，指出圍絕經期易出現腎虛肝郁，而導致精虛髓虧，從而發生健忘，以“腎-肝-腦”軸立論闡述圍絕經期健忘的病因病機，基于“養陰寧神定智”創立了“養陰寧神方”治療圍絕經期健忘。本研究用雌性小鼠去勢模擬圍絕經期，通過養陰寧神方干預觀察其對去勢小鼠認知功能的影響。

各組小鼠去勢后傷口愈合時間比較發現，與假手術組比較，模型組，雌激素組，低、高劑量組小鼠傷口愈合時間延長；與模型組、雌激素組、低劑量組、高劑量組相比，中劑量組小鼠傷口愈合時間縮短。去勢1周，水迷宮測試發現，與假手術組比較，其余各組去勢后學習、記憶功能下降；去勢4周，除模型組外，其余各組逃避潛伏期縮短、穿梭次數增加。說明雌激素、養陰寧神方可增強小鼠海馬神經元的學習、記憶等認知功能。模型小鼠去勢后，血漿E2水平顯著下降。去勢4周，在外源性的E2和養陰寧神方干預后，各組血漿E2水平明顯高于模型組。說明養陰寧神方可增加血漿E2水平，與口服E2片劑效果一致。結合行為學的結果和血漿E2水平的變化，說明去勢后E2水平急劇下降是學習認知功能減退的主要原因之一，養陰寧神方通過升高血漿E2的水平而改善學習記憶能力。HE染色發現，雌激素組和養陰寧神方各組海馬錐體神經元粗大、核濃染，突起明顯，養陰寧神方各組錐體神經元的數量增加，相反，模型組海馬錐體神經元稀少而顆粒細胞居多，突起不明顯。尼氏染色發現，模型組尼氏染色陽性細胞數量明顯低于其他組，提示雌激素組及養陰寧神方各組均可增強去勢后海馬神經元蛋白合成功能。電鏡結果提示，模型組小鼠海馬神經元胞漿內粗面內質網和突觸數量減少，而雌激素組及養陰寧神方各組均能增加去勢后神經元突觸數量，從而改善海馬神經元突觸可塑性。

E2是腦強力調節劑，是調節神經元存活、可塑性、神經保護的重要激素之一[23]。該激素對學習和記憶調節具有不可替代的作用[24]。前額皮質、海馬等區域都含有大量的雌激素受體[24]。E2能通過海馬組織ERα等，調節海馬神經元發生和樹突形成[25]。E2可通過調節ERα神經內分泌反應而改善認知功能。本研究發現小鼠去勢后認知功能下降與E2的水平密切相關。養陰寧神方可模擬E2的作用，通過雌激素-神經-內分泌網絡，改善去勢神經元突觸可塑性，從而發揮對去勢小鼠海馬神經功能的保護作用，其中，養陰寧神方中劑量組效果最好。

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