絲氨酸肽酶抑制因子Kazal型5基因多態性與兒童哮喘易感性及病情相關性研究

張 林, 魏 兵, 宋俊美, 劉 寧, 曲雙雙, 常艷麗

1.遼寧中醫藥大學,遼寧 沈陽 110847;2.北部戰區總醫院 新生兒科,遼寧 沈陽 110016

支氣管哮喘(以下簡稱哮喘)是全世界范圍內兒童最常見的慢性下呼吸道疾病之一。2010年,我國城市0～14歲兒童哮喘的大規模流行病學調查顯示,兒童哮喘累計患病率約為3.02%[1],哮喘會對兒童正常的生長發育及身心健康造成負面影響[2]。哮喘是多基因性的復雜性疾病,了解基因的遺傳規律有助于揭示哮喘的致病機制[3]。絲氨酸肽酶抑制因子Kazal型5(serine protease inhibitor Kazal type 5,SPINK5)基因位于人類染色體5q32上,包含33個外顯子,全長約61 kb[4]。目前,國內外有關SPINK5基因與哮喘相關性研究較少。本研究旨在探討SPINK5基因rs17704908、rs2303067、rs3777134、rs4349706和rs6892205位點與哮喘易感性和病情的相關性,為SPINK5基因單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)與兒童哮喘的關系提供新的循證醫學依據?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取自2020年9月至2022年9月于北部戰區總醫院就診的86例哮喘患兒設為哮喘組,其中,男性61例,女性25例;平均年齡(6.87±2.29)歲。納入標準:(1)符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)》[1]的診斷標準;(2)年齡3～14歲;(3)就診時存在突然發生的喘息、氣促、咳嗽、胸悶等癥狀或原有癥狀加重,符合哮喘急性發作的表現。排除標準:(1)合并有自身免疫性疾病、先天性心臟病、肺結核或有惡性腫瘤;(2)肝腎功能不全;(3)正在接受其他研究。再根據哮喘組患兒哮喘的嚴重程度將其分為輕、中、重度組,輕度組患兒18例,男性10例,女性8例,平均年齡(7.33±2.22)歲;中度組患兒32例,男性22例,女性10例,平均年齡(7.34±2.28)歲;重度組患兒36例,男性29例,女性7例,平均年齡(6.22±2.23)歲。輕、中、重度組患兒的性別比例和年齡比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。另選取同期在該醫院體檢的66例健康兒童設為健康組,其中,男性33例,女性33例;平均年齡(6.89±2.21)歲。哮喘組與健康組研究對象的年齡及性別比例比較,差異均無統計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準。所有研究對象家屬均簽署知情同意書。

1.2 基因位點檢測 (1)抽取外周靜脈血3 ml于抗凝管中,采用DNA提取試劑盒(上海天昊生物科技有限公司)提取DNA。(2)應用在線Primer 3.0設計PCR引物(表1)。配置PCR反應預混合液:2.0 μl 10×PerfectStart?聚合酶緩沖液(Taq buffer),6.0 μl 10×GC Enhancer,2.4 μl dNTP(2.5 mM),0.8 μl MgCl2(25.0 mM),2.0 μl Probe Mix,0.4 μl 耐熱聚合酶(HotStarTaq,2.5 U/μl),5.4 μl 雙蒸水(ddH2O)。PCR反應:離心0.5 min,放置PCR儀上進行變性、退火、延伸、保持。(3)在20.0 μl PCR產物中加入5 U 蝦堿性磷酸酶和2 U核酸外切酶Ⅰ(Exonuclease Ⅰ),37℃溫浴1 h,然后75℃滅活15 min。(4)配置連接反應預混合液:1.0 μl 10×連接酶緩沖液,0.25 μl Labelp Mix,0.4 μl Ligase Primer Mix(1 μM),1.0 μl DNA連接酶(50 U/μl),3.35 μl ddH2O。離心0.5 min,放置PCR儀上,進行變性、連接、保持。(5)連接產物稀釋10倍后,取1.0 μl與0.5 μl Liz500 SIZE STANDARD,8.5 μl Hi-Di混勻,95℃變性5 min后上ABI3730XL測序儀。(6)應用軟件 GeneMapper 4.1(Applied Biosystems,USA)分析。

表1 PCR引物信息

2 結果

2.1 哮喘組及健康組群體代表性 應用Hardy-Weinberg平衡檢驗檢測健康組和哮喘組的rs17704908、rs2303067、rs3777134、rs4349706、rs6892205位點的基因型頻率,哮喘組P值分別為0.99、0.39、0.99、0.99、0.39,健康組P值分別為0.27、0.34、0.27、0.27、0.30,兩組研究樣本均符合Hardy-Weinberg平衡定律,提示群體代表性好。

2.2 SPINK5基因5個位點基因型及等位基因在哮喘組及健康組中的分布 健康組和哮喘組SPINK5基因5個位點基因型頻率和等位基因頻率比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2、3。

表2 哮喘組及健康組患兒SPINK5基因5個位點各基因型頻率分布情況/例(百分率/%)

表3 哮喘組及健康組患兒SPINK5基因5個位點各等位基因頻率分布情況/例(百分率/%)

2.3 SPINK5基因5個位點基因型在輕、中、重度組中的分布 輕、中、重度組SPINK5基因5個位點基因型及等位基因頻率比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表4、5。

表4 輕、中、重度組患兒SPINK5基因5個位點各基因型頻率分布情況/例(百分率/%)

表5 輕、中、重度組患兒SPINK5基因5個位點各等位基因頻率分布情況/例(百分率/%)

2.4 連鎖分析 經hap-phase軟件分析對SPINK5基因5個位點進行連鎖不平衡(linkage disequilibrium,LD)分析。紅色小方框中數值為LD系數(D′)的百分數,數值越大表示連鎖性越強,沒有數值表示D′=1,即提示完全連鎖不平衡。rs6892205與rs2303067、rs3777134、rs17704908和rs4349706四處位點有強連鎖性,同時,rs2303067與rs3777134、rs17704908和rs4349706存在強連鎖性。見圖1。

圖1 LD圖

2.5 SPINK5基因5個位點組成單倍型在哮喘組及健康組中的分布 SPINK5基因的5個位點構成6種單倍型,分別為ACCGA、GTTAG、GTTAA、ACCGG、GCCGG和ATTAA,哮喘組和健康組的6種單倍型的頻率分布比較,差異均有統計學意義(χ2=8.61,P=0.04);二元Logistic回歸結果示單倍型GTTAG罹患哮喘的風險OR值為2.20,95%可信區間1.03～4.70,差異有統計學意義(P<0.05)。哮喘輕、中、重度組的6種單倍型頻率分布比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。

3 討論

SPINK5基因編碼絲氨酸蛋白酶抑制物,包含15種潛在的絲氨酸蛋白酶抑制區域,是一種非常重要的pH依賴性的表皮脫屑調節器,其在表皮顆粒層分化表達后,轉移至角質層與顆粒層的交界處。當SPINK5的mRNA表達水平增加時,可使角質層胰蛋白酶和角質層糜蛋白酶、通道活化絲氨酸蛋白酶1(channel-activating serine protease 1,CAP1)的mRNA表達水平降低[5-7]。角質層胰蛋白酶和角質層糜蛋白酶參與了角層橋粒鈣黏素的降解過程,CAP1隨著鈣離子濃度增加與角質層胰蛋白酶和角質層糜蛋白酶共同作用,釋放絲聚合蛋白(filaggrin,FLG),FLG是維持皮膚屏障結構和功能完整的關鍵蛋白[7]。李令雪等[8]研究表明,FLG基因rs11204981和rs146466242位點攜帶次要等位基因可能與噬酸性粒細胞百分比和IgE的升高有關。SPINK5基因與上皮細胞的形成及角質形成細胞終末分化過程中蛋白質水解的調節相關,并且該基因的某些突變可導致皮膚屏障功能紊亂[4]。

Walden等[9]研究認為,SPINK5基因中存在與哮喘有關的某些突變。隨后,開始陸續有各國學者對SPINK5基因與哮喘的相關性進行研究。Biagini等[10]研究發現,白人兒童群體中SPINK5基因與哮喘的發生顯著相關。Martinez-Aguilar等[11]研究結果提示,墨西哥兒童SPINK5基因rs2303067、rs4349706、rs3777134和rs6892205位點基因型和等位基因與兒童哮喘易感性及發病程度均無相關性,但其組成的單倍型與墨西哥兒童哮喘發作具有相關性。Genuneit等[12]分析了13個國家17個研究中心的兒童哮喘人群的結果表明,SPINK5基因與白細胞介素13水平及IgE水平顯著相關,在其測試的14個SNP中,有4個與喘息癥狀相關。本研究對象為中國東北地區漢族兒童,結果表明,SPINK5基因rs17704908、rs2303067、rs3777134、rs4349706和rs6892205位點SNP與兒童哮喘的易感性及病情無相關性,其中,rs2303067、rs3777134、rs4349706和rs6892205位點研究結果與Martinez-Aguilar等[11]研究結果相吻合。

基因連鎖不平衡是指同一條染色體上兩個等位基因間的非隨機相關,其采用連鎖不平衡系數D′及相關系數r2進行衡量,LD模式在關聯研究的SNP選擇中起著重要作用[13]。單倍型是指同一染色體各位點基因緊密連鎖組成的基因單。本研究結果表明,SPINK5基因的5位點可構成6種單倍型,其中,GTTAG是兒童罹患哮喘的高危因素,ACCGA、GTTAA、ACCGG、GCCGG和ATTAA與兒童哮喘的易感性及病情無相關性。

綜上所述,SPINK5基因rs17704908、rs2303067、rs3777134、rs4349706和rs6892205位點SNP與兒童哮喘的易感性及病情無相關性,其構成的單倍型GTTAG是兒童罹患哮喘的高危因素。但鑒于本研究選擇的是中國東北地區漢族兒童,且樣本量相對較小,對基因位點檢測尚不全面,結果可能受到影響。今后可在加大樣本量的同時,進一步進行多中心、多地域、多民族的大規模研究。