短鏈氯化石蠟對人體正常肝細胞的代謝干擾

羅 云, 耿檸波, 陳雙雙, 程 琳, 張海軍, 陳吉平

(1. 臨沂大學醫學院, 山東 臨沂 276005; 2. 中國科學院大連化學物理研究所,中國科學院分離分析化學重點實驗室, 遼寧 大連 116023)

氯化石蠟(chlorinated paraffins, CPs)是一類人工合成的氯代正構烷烴,其分子式為CnH2n+2Clm,氯含量為30%～70%(質量分數)。根據碳鏈長度的不同,CPs可分為短鏈氯化石蠟(short-chain chlorinated paraffins, SCCPs, C10～C13)、中鏈氯化石蠟(medium-chain chlorinated paraffins, MCCPs, C14～C17)和長鏈氯化石蠟(long-chain chlorinated paraffins, LCCPs, C18～C30)[1]。因具有良好的熱穩定性和化學穩定性,SCCPs被用作增塑劑和阻燃劑,并廣泛添加在金屬加工液、涂料、密封劑、黏合劑、皮革處理劑、塑料和橡膠中[2,3]。與MCCPs和LCCPs相比,SCCPs具有更低的相對分子質量、更高的蒸汽壓和更高的水溶性,因此更容易釋放到環境中[4]。由于SCCPs具有生物持久性以及遠距離遷移能力、能夠生物積累并帶來一定的生物毒性,2017年斯德哥爾摩公約將其列入《關于持久性有機污染物的斯德哥爾摩公約》附件A的受控清單中[5]。此外,1990年國際癌癥研究機構將平均碳鏈長度為12和平均氯化程度為60%的SCCPs歸類為2B類潛在致癌物[6]。由于大規模生產和廣泛的工業應用,SCCPs在各種環境介質、生物樣本以及人體血液、母乳和臍帶血中被頻繁檢出[7-12]。人體母乳和血液中SCCPs的污染水平是評估SCCPs健康風險的重要指標。據研究報道,在中國四川省收集的母乳中SCCPs含量為29.2～270.7 ng/mL[11],在中國湖北省收集到的孕婦外周血中SCCPs含量為15.9～584 ng/mL[11]。因此,SCCPs對野生動植物和人類構成了潛在危害,對其進行生態風險和健康風險評估迫在眉睫。

據報道,SCCPs對水生生物、兩棲動物、鳥類、哺乳動物、體外細胞以及土壤生物均產生多種毒性效應,如神經毒性、內分泌干擾效應、免疫調節效應、肝毒性、腎毒性、發育毒性、致死效應以及致癌效應[13,14]。研究者也廣泛研究了SCCPs的毒性作用機制,他們發現SCCPs的毒性作用機制主要集中在氧化損傷、生物膜損傷、能量代謝抑制以及過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)激活、雌激素受體(ERα)激活、組成型雄烷受體(CAR)激活和β2腎上腺素能受體(β2-AR)等毒性作用通路的激活上[1,15]。高劑量SCCPs的長期暴露可能誘發多器官損傷。其中,肝臟是SCCPs最主要的毒性靶點。據文獻[16]報道,暴露于SCCPs(1 000 mg/kg)16天后,SD大鼠的肝臟明顯增大,肝細胞高度脂肪變性,肝竇變窄,肝組織出現點狀壞死,炎性細胞發生浸潤,纖維組織出現增生。大鼠經SCCPs暴露后,誘發了肝臟過氧化物酶體增殖以及細胞質中脂肪滴數量增加[17]。目前,研究者對SCCPs肝毒性的研究集中在動物身上。SCCPs的致癌機制難以實現從嚙齒類動物到人體的外推。如SCCPs對大鼠肝臟PPARα受體的激活作用和致肝癌有一定的關系。然而,PPARα受體在嚙齒動物中高度表達,而在人體內是低表達的。因而,SCCPs通過PPARα受體的激活而產生致癌效應的機制在人體中可能并不適用[18]。因此,SCCPs對人體的毒性效應和機制研究有待進一步開展。

在過去的十幾年中,組學技術(如轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學)的重大進步使得研究者對各種生物過程的生物分子的高通量監測成為可能。組學技術在揭示外界因素作用于生物體的機制方面顯現出了極其重要的作用,是毒性機制機理研究可以依賴的技術手段[19,20]。為評估SCCPs暴露對人體的潛在健康風險,本研究以人體正常肝細胞L02為模式細胞,以代謝組學技術為研究手段,從分子水平上探究了SCCPs肝毒性的代謝干擾機制。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Q-TOF 6540超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜儀(美國Agilent公司);Q-Trap 5500超高效液相色譜(美國Waters公司)-四極桿線性離子阱質譜儀(美國AB SCIEX公司);氧化碳培養箱(美國Thermo Fisher公司);臺式高速低溫離心機(Biofuge?Stratos,德國Heraeus公司);倒置顯微鏡(南京江南光電股份有限公司);真空冷凍干燥儀(美國LABCONCO公司);渦旋振蕩儀(G-560E,美國Scientific Industries公司)。

L02細胞購自中國科學院細胞庫。SCCPs(C10～C13, 56.5%Cl)標樣為C10-、C11-、C12-、C13-CP的1∶1∶1∶1(物質的量比)的混合標樣,平均氯含量(以質量分數計)為56.5%,按照Tomyet等[21]報道的正烷烴氯化的方法在實驗室合成。細胞培養所需試劑均購自美國Gibco公司,包括:細胞培養基(RPMI 1640)、胎牛血清、青霉素-鏈霉素、胰蛋白酶以及PBS緩沖溶液。甲醇和乙腈均為質譜純級別,均購自Fisher Scientific公司(美國)。色譜級甲酸與色譜級碳酸氫銨購自百靈威公司(中國);細胞培養級別二甲基亞砜(DMSO)和D5-L-苯丙氨酸與辛?；?8,8,8-D3)-L-肉堿購自Sigma-Aldrich公司(美國);十一烷酸(FFA C11∶0)與十九烷酸(FFA C19∶0)購自阿拉丁公司(中國); 1-十二烷基溶血磷脂酰膽堿(LysoPC 12∶0)與磷脂酰乙醇胺(PE 17∶0/17∶0)購自AVANTI公司(美國)。實驗用水均為超純水。

1.2 細胞暴露實驗

將L02細胞置于培養箱中培養,將細胞培養箱的溫度與二氧化碳體積分數設置為37 ℃與5%; L02細胞培養液為含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養基。待細胞進入對數生長期時,將L02細胞接種在六孔板中,細胞接種密度為5×105細胞/孔,并設置一個對照組與3個暴露組,每組設置6個平行。待細胞鋪滿六孔板面積的80%～90%,將細胞培養基棄去,向對照組加入含有0.05%(v/v) DMSO的培養液;將SCCPs(C10～C13, 56.5%Cl)通過DMSO引入培養基中,向3個暴露組分別加入含1 μg/L(低劑量)、10 μg/L(中劑量)、100 μg/L(高劑量)SCCPs的培養基,使DMSO在培養液中的最終體積分數為0.05%。3個暴露劑量均低于SCCPs在人體血液中的最高含量(584 ng/mL)[11]。

1.3 細胞代謝物提取

暴露24 h后,棄去六孔板中剩余細胞培養液,每孔加入2 mL超純水快速洗滌細胞,洗滌3次后,加入液氮淬滅,使細胞的代謝活動終止,并放置于-80 ℃冰箱中保存,待進一步提取。

向六孔板的每孔中加入1 mL超純水,冰水浴中超聲3 min,使細胞破碎并從培養皿壁上脫落。隨后將細胞碎片懸液轉移到1.5 mL離心管中。將細胞破碎懸液冷凍干燥,然后加入0.5 mL 80%甲醇水溶液(其中含有6個內標,分別為0.5 μg/L D5-L-苯丙氨酸、0.5 μg/L辛?；?8,8,8-D3)-L-肉堿、0.5 μg/L FFA C11∶0、0.5 μg/L FFA C19∶0、0.5 μg/L LysoPC 12∶0與1 μg/L PE 17∶0),室溫渦旋20 min,離心(14 000 g, 4 ℃)20 min。最后,取上清液過有機相濾膜并轉移到進樣小瓶中保存,待進行小分子代謝物分析。

1.4 代謝物檢測

采用擬靶向代謝組學方法對細胞內小分子代謝物進行檢測分析[22]。首先用Q-TOF 6540超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜對細胞樣品進行非靶向分析,分為正、負離子兩種掃描模式。通過高分辨Q-TOF-MS的AutoMS/MS功能對小分子代謝物實行全掃和二級質譜掃描,獲得離子對信息。然后,采用Q-Trap 5500超高效液相色譜-四極桿線性離子阱質譜對獲得的離子對進行靶向(Schedule MRM)分析,色譜分離條件與非靶向分析完全一致。

色譜條件 正離子模式:色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C8(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm, Waters, USA);流動相由0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)組成;梯度洗脫程序:0～1.0 min, 5%B; 1.0～23.0 min, 5%B～100%B; 23.0～27.0 min, 100%B; 27.0～27.1 min, 100%B～5%B; 27.1～30.0 min, 5%B。負離子模式:色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3 (100 mm×2.1 mm, 1.8 μm, Waters, USA);流動相由5 mmol/L NH4HCO3水溶液(A)與含5 mmol/L NH4HCO3的甲醇溶液(B)組成;梯度洗脫程序:0～1.0 min, 2%B; 1.0～3.0 min, 2%B～42%B; 3.0～12.0 min, 42%B～100%B; 12.0～16.0 min, 100%B; 16.0～17.0 min, 100%B～2%B; 17.0～20.0 min, 2%B。正、負離子模式下柱溫均為50 ℃,流速均為0.35 mL/min。

Q-TOF 6540質譜參數 干燥氣溫度:350 ℃;干燥氣流速:9 L/min;霧化器(N2氣)壓力:310.275 kPa (45 psi);毛細管電壓:3500 V;碎裂電壓:175 V;錐孔電壓:65 V;MS采集范圍:m/z50～1000;MS/MS采集范圍:m/z30～1 000;MS采集速率:4 spectra/s;MS/MS毛細管電壓:2 spectra/s;碰撞能采用公式CE=5×m/z(母離子)/100+3計算;每個循環(0.25 s)允許分析的最大母離子個數設置為5,絕對閾值為5000 Count,相對閾值為1%。

Q-Trap質譜條件的正、負離子模式參數 電噴霧離子源(ESI),溫度為550 ℃,噴霧電壓分別為5 500 V(正離子模式)與4 500 V(負離子模式),氣簾氣壓力為0.241 MPa,霧化氣(ion source gas 1, GS1)壓力為0.276 MPa,輔助氣(ion source gas 2, GS2)壓力為0.276 MPa。

1.5 數據處理及統計分析

使用MultiQuant軟件(AB SCIEX)進行數據批量處理,導出經內標校正過的峰面積數據(某個樣品中的原始峰面積除以該樣品中內標峰面積再乘以所有樣品內標峰面積的平均值),并進行歸一化處理,用于后續的統計分析。MetaboAnalyst 5.0(http://www.metaboanalyst.ca/)網站用于單因素方差分析(ANOVA)、t-test以及主成分分析(PCA); RStudio(version 4.1.2)用于熱圖繪制;InCroMAP軟件(version 1.7.0)用于通路富集分析。

此外,本研究還根據文獻[23],進行了代謝擾亂水平指數(MELI)計算,來反映污染物暴露對代謝的整體干擾。首先計算單個樣本中每個代謝物的代謝變化,然后將單個樣本中所有代謝物的代謝變化進行求和,再除以樣本中代謝物的總個數,從而得到該樣本的MELI值。

1.6 質量控制與質量保證

在所有暴露組與對照組的樣品中移取等量樣品混合作為質控樣品(QC)。將QC插入分析序列,每分析6個樣品后分析一個質控樣品。正、負離子模式下,各插入7個QC樣品。計算QC樣品中每個代謝物濃度的相對標準偏差(RSD),結果表明,在正、負離子模式下,一共檢測到565個代謝物。其中,在正離子模式下檢測到355個代謝物,93.2%的代謝物RSD<30%; RSD<10%、10%30%。在負離子模式下檢測到210個代謝物,94.3%的代謝物RSD<30%。其中,RSD<10%、10%30%。該結果表明:代謝物靶標分析序列具有滿意的穩定性和重復性。

2 結果與討論

2.1 代謝輪廓分析

采用擬靶向代謝組學分析方法研究SCCPs暴露對L02細胞中小分子代謝物的擾亂,共檢測到565個代謝物。為評估SCCPs引起的L02細胞中的代謝紊亂,對檢測到的所有代謝物進行PCA分析(圖1a),建立了包含第一主成分和第二主成分的二維空間模型。在PCA因子得分圖中(圖1a), 3個暴露劑量組在第一主成分上均能夠與對照組明顯分開。對照組分布在第二象限,低劑量組(1 μg/L)和中劑量組(10 μg/L)主要分布在第一象限,高劑量組(100 μg/L)主要分布在第三象限。表明3個劑量組的SCCPs均能夠引起L02細胞代謝活動的紊亂;同時研究還發現,1 μg/L的SCCPs暴露組與10 μg/L的SCCPs暴露組部分重疊,表明1 μg/L和10 μg/L的SCCPs對L02細胞的代謝擾亂存在相似之處。為比較3個劑量組的SCCPs暴露對L02細胞總代謝的干擾強度,我們還計算了MELI。如圖1b所示,3個暴露組的MELI值均顯著(P<0.05)高于對照組。結果表明,3個劑量的SCCPs暴露均能引起L02細胞代謝紊亂。

通過MetaboAnalyst 5.0對所有暴露組與對照組的565個代謝物進行了ANOVA分析來篩選差異代謝物,篩選標準為False discovery rate (FDR)<0.05且Variable importance in the projection (VIP)值>1,共篩選出220個差異代謝物。其中,72個差異代謝物經化合物二級質譜圖信息定性或標準品驗證。韋恩圖(圖1c)顯示,1 μg/L SCCPs暴露組與10 μg/L SCCPs暴露組和100 μg/L SCCPs暴露組分別有33個和36個相同的差異代謝物。10 μg/L SCCPs暴露組與100 μg/L SCCPs暴露組有46個相同的差異代謝物。3個暴露組有33個相同的差異代謝物。

圖 1 SCCPs暴露L02細胞24 h后引起的代謝擾動Fig. 1 Effects of 24 h of exposure to short-chain chlorinated paraffins (SCCPs) on the metabolomic profiles of L02 cells a. Principal component analysis (PCA) score plot of metabolite levels in L02 cells; b. metabolic effect level index (MELI) values of different treatment groups; c. Venn diagram showing the number of shared differential metabolites (DMs) among groups. Significant differences (in comparison with the control) were determined using t-test (n=6). * P<0.05; ** P<0.01.

為了進一步分析SCCPs暴露引起的細胞內代謝變化,基于各自的代謝通路類別,對所有定性的差異代謝物進行熱圖分析(圖2)。在72個經二級質譜圖信息定性或標準品驗證的差異代謝物中,參與氨基酸代謝、核苷酸代謝和脂質代謝通路的差異代謝物分別為9、9以及45個。如圖2所示,3個劑量的SCCPs暴露均引起參與氨基酸、核苷酸以及脂質代謝通路的代謝物的紊亂。

2.2 代謝通路分析

為了準確描述SCCPs暴露后L02細胞中代謝通路的改變,基于差異代謝物的倍率變化(FC)數據集對所有暴露組進行通路富集分析。保留與代謝相關且P<0.01的代謝通路作為顯著影響的通路。-log10Q的數值代表SCCPs對代謝通路的干擾程度。如圖3所示,低、中、高劑量的SCCPs暴露干擾了相似的代謝通路,包括甘油磷脂代謝、亞油酸代謝、α-亞油酸代謝、花生四烯酸代謝、不飽和脂肪酸合成通路、鞘脂類代謝以及嘌呤代謝通路。此外,隨著暴露劑量的增加,SCCPs擾亂的代謝通路也同步增加,中、高劑量的SCCPs暴露還干擾氧化磷酸化(OXPHOS)以及脂肪酸合成通路。中劑量的SCCPs暴露單獨干擾嘧啶代謝通路,高劑量的SCCPs暴露單獨干擾苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成通路?？傊?中、高劑量的SCCPs暴露引起了更廣泛的代謝通路紊亂。

圖 2 對照組和SCCPs暴露組中72個差異代謝物的熱圖Fig. 2 Heatmaps of 72 DMs in control and SCCP exposure groups False discovery rate (FDR)<0.05; variable importance in the projection (VIP)>1; P<0.05. FFAs: free fatty acids; PC: phosphatidylcholine; PE: phosphatidylethanolamine; SM: sphingomyelin; Lyso PC: lysophosphatidylcholine; Lyso PE: lysophosphatidylethanolamine; ADP: adenosine 5′-diphosphate; CDP: cytidine diphosphate; dAMP: deoxyadenosine monophosphate; dGDP: 2′-deoxyguanosine 5′-diphosphate; IMP: inosine monophosphate; NAD: nicotinamide adenine dinucleotide; UDP: uridine 5′-diphosphate; CoA: coenzyme A; MG: monoacylglyceride.

2.2.1脂質代謝通路干擾

脂質代謝是3個劑量SCCPs暴露組共同干擾的代謝通路,如圖3所示,低、中、高劑量的SCCPs暴露均干擾甘油磷脂代謝以及鞘脂類代謝通路。SCCPs暴露后,脂類豐度發生了明顯變化,包括磷脂酰膽(PCs)、磷脂酰乙醇胺(PEs)、溶血磷脂酰乙醇胺(lyso PEs)、溶血磷脂酰膽堿(lyso PCs)以及鞘磷脂(SMs)(圖4)。PCs、PEs和SMs是細胞膜脂質雙分子層的主要結構成分[24],其豐度的顯著變化表明SCCPs暴露對細胞膜有一定的損傷作用。已有研究表明:SCCPs可通過磷脂水平紊亂、結構親脂性以及脂質過氧化破壞生物膜[15]。磷脂是細胞膜的重要組成部分,SCCPs暴露后磷脂水平的紊亂將會對細胞膜的穩定性和膜結合蛋白質的能力產生負面影響[25]。另外,磷脂的異常代謝還可以影響許多生物學過程,包括炎癥效應[26]。

圖 3 通路富集分析顯示的SCCPs暴露后顯著干擾的代謝通路Fig. 3 Metabolic pathways significantly perturbed by SCCP exposures based on pathway enrichment analysis

圖 4 SCCPs誘導的脂質代謝通路的紊亂Fig. 4 Perturbations of lipid metabolism induced by SCCPs Significant differences were determined using t-test (n=6). * P<0.05.

低、中、高劑量的SCCPs均干擾了L02細胞中脂肪酸代謝,尤其是脂肪酸β氧化(圖4)。如圖5所示,短鏈(C3)、中鏈(C6)?；鈮A的含量在中、高劑量的SCCPs暴露組中顯著降低。同時,脂肪酸水平在3個劑量的SCCPs暴露組中均顯著下降。在脂肪酸β氧化過程中,脂肪酸首先被活化成脂酰CoA,而活化的脂酰CoA需進入線粒體才能被氧化。游離肉堿作為載體將脂肪酸運輸到線粒體,并將其轉化為相應的?；鈮A,進而才能實現脂肪酸β氧化并產生能量[27]。因此,?；鈮A的減少提示脂肪酸β氧化過程被抑制。在本研究中,SCCPs暴露降低了短鏈和中鏈?；鈮A的含量,表明SCCPs暴露抑制了L02細胞中脂肪酸β氧化。值得注意的是,高劑量SCCPs對脂肪酸β氧化抑制作用更加明顯。相關研究表明SCCPs對脂肪酸β-氧化通路的干擾可能與PPARα受體有關。SCCPs可通過激活大鼠肝臟PPARα受體,調控PPARα下游編碼與脂肪酸代謝有關的蛋白質的靶基因的表達水平,進而影響線粒體脂肪酸β-氧化[28]。然而,PPARα激活效應存在物種差異,人PPARα的激活效應與嚙齒類動物比相對較弱[18,29]。需要通過實驗進一步探討本研究中脂肪酸β氧化抑制作用與人PPARα的激活效應之間的關系。

2.2.2核苷酸代謝通路干擾

如圖6所示,SCCPs暴露誘導了核苷酸代謝通路的紊亂。SCCPs暴露降低了L02細胞中二磷酸核酸(胞嘧啶核苷二磷酸(CDP)、尿苷二磷酸(UDP)、腺嘌呤核苷二磷酸(ADP)、脫氧鳥苷5′-二磷酸(dGDP))的含量。相反,SCCPs暴露誘導了單磷酸核苷(單磷酸肌苷(IMP)與脫氧腺苷單磷酸(dAMP))、鳥嘌呤(guanine)、胞嘧啶(cytosine)以及次黃嘌呤(hypoxanthine)的累積。核苷酸代謝失調會導致基因組不穩定和進一步的致癌作用[30]。據報道,次黃嘌呤水平的升高在許多器官系統中表現出有害的影響[31,32]。作為嘌呤降解通路中的反應中間體,次黃嘌呤經黃嘌呤氧化酶分解代謝成黃嘌呤和尿酸。在缺氧狀態下,腺嘌呤核苷酸降解為次黃嘌呤的速度加快,黃嘌呤氧化酶轉化次黃嘌呤為黃嘌呤和尿酸的速度減慢。因此,次黃嘌呤升高已被證明是幾種疾病狀態下缺氧的標志,比如圍產期窒息、急性呼吸窘迫綜合征、缺血性腦水腫[33,34]。另外,黃嘌呤氧化酶氧化次黃嘌呤也會產生活性氧(ROS)并引發細胞毒性。比如,次黃嘌呤已被證實通過ROS的產生上調膽固醇水平誘導動脈粥樣硬化[35]。次黃嘌呤還可以在慢性炎癥過程中通過腺嘌呤脫氨產生,能夠啟動炎癥驅動效應并產生致癌作用[36]。在本研究中,低、中與高劑量的SCCPs暴露均導致了次黃嘌呤的累積,這與文獻報道SCCPs對細胞產生氧化損傷的結果一致[15]。

圖 5 SCCPs誘導的脂肪酸代謝通路的紊亂Fig. 5 Perturbations of fatty acid metabolism induced by SCCPs Significant differences were determined using t-test (n=6). * P<0.05.

圖 6 SCCPs暴露后核苷酸代謝通路相關代謝物的相對峰面積Fig. 6 Relative peak areas of metabolites participating in the nucleotide metabolism pathway perturbed by SCCPs Significant differences were determined using t-test (n=6). * 0.01

3 結論

本研究以代謝組學為手段探討了SCCPs暴露對人正常肝細胞L02的代謝干擾。研究表明:SCCPs對L02細胞的代謝干擾主要表現在脂質代謝、脂肪酸β氧化以及核苷酸代謝通路上。SCCPs暴露可能對細胞膜產生明顯的損傷作用,抑制L02細胞中脂肪酸β氧化以及誘導L02細胞氧化損傷等相關不良效應。另外,在本研究中,與中、低劑量SCCPs暴露相比,高劑量SCCPs暴露引起更廣泛的代謝通路的紊亂。同時,高劑量SCCPs暴露對脂質代謝、脂肪酸β氧化以及核苷酸代謝通路的干擾作用更強。然而,本研究僅僅在一個組學層面上來探索SCCPs對人體肝細胞的毒性機制顯然是不夠的,需要結合其他組學手段以及分子學技術手段深入探究其毒性作用機制,找到SCCPs對人體肝細胞的毒性作用靶點。