circPDE3B在食管鱗狀細胞癌組織中的表達及對癌細胞生物學行為的影響

鄭釗洋,王獻增,張 曼,陳雙雙,楊 瑩,劉紅春

1)河南中醫藥大學第二附屬醫院檢驗科 鄭州 450002 2)林州市人民醫院胸外科 河南安陽 456550 3)鄭州大學第一附屬醫院檢驗科 鄭州 450052

我國是世界上食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)高發國家之一,ESCC患者的5 a生存率僅有20%～35%,且復發風險較高[1-2]。環狀RNA(circular RNA,circRNA)是一類新發現的非編碼RNA,在人體組織中廣泛表達[3]。研究[4]表明,circRNA在惡性腫瘤中異常表達,并且可作為蛋白質誘餌、miRNA海綿參與轉錄和剪接的調節,參與腫瘤的發生發展。有研究[5-7]發現多種circRNA在ESCC進展中起重要作用。本研究檢測ESCC組織和細胞中circPDE3B的表達,構建敲低circPDE3B表達的KYSE150細胞,探討circPDE3B對ESCC細胞惡性生物學行為的影響;采用雙熒光素酶報告實驗驗證circPDE3B靶向miR-1294的結合位點,探討circPDE3B/miR-1294調控軸對ESCC發生發展的影響,以期為食管癌早期診斷標志物以及潛在治療靶點的開發提供新思路。

1 材料與方法

1.1 臨床組織標本選取2020年1月至2022年1月鄭州大學第一附屬醫院臨床病理信息完整的ESCC患者30例,其中男21例,女9例,年齡45～83歲。在手術切除之前,患者均未接受過化學治療、放射治療或免疫治療,所有患者均在手術前簽署知情同意書。本研究由該院醫學倫理委員會批準(2021-KY-1131-002)。收集切除的癌組織及相應的癌旁(距原發灶5 cm以外)正常食管組織,用以檢測circPDE3B的表達。

1.2 細胞和主要試劑ESCC細胞系KYSE30、EC9706、ECA109、KYSE150,正常食管上皮細胞系HEEC和人胚胎腎細胞系293T均購自上海市生命科學院細胞中心;RPMI 1640培養基、胎牛血清和青霉素-鏈霉素購自上海源培生物科技股份有限公司;反轉錄試劑盒和PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司;si-circRNA、si-NC、miR-1294 inhibitor、inhibitor NC、miR-1294 mimic及mimic NC均購自上海吉瑪制藥有限公司;雙熒光素酶報告實驗試劑盒購自美國Promega公司;Trizol試劑和Lipofectamine 3000試劑盒購自美國Invitrogen公司;CCK-8試劑盒購自武漢亞科因生物科技有限公司;基質膠和Transwell小室購自美國Corning公司。

1.3 組織和細胞中circPDE3B和miR-1294表達的qRT-PCR檢測使用Trizol提取組織和細胞中的總RNA,用反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA,然后進行qPCR。反應體系20 μL:上、下游引物各1 μL, SuperMix 10 μL,模板1 μL,RNase Free Water 7 μL;反應條件:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性10 s,60 ℃退火10 s,72 ℃延伸10 s,40個循環;最終72 ℃ 10 min中止反應。qPCR在QuantStudio 12K Flex系統上進行。采用2-ΔΔCt法測定靶基因相對表達水平。以GAPDH作為circPDE3B的內參基因,U6作為miR-1294的內參基因。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 細胞分組與轉染在37 ℃、體積分數5%CO2條件下培養KYSE150細胞,細胞復蘇貼壁后每隔3 d傳代1次。將處于對數生長期的細胞以2×105個/孔的密度接種到60 mm培養板上,細胞融合度達50%～60%時,采用Lipofectamine 3000試劑進行轉染,嚴格按照試劑說明書操作,分別轉染si-NC、si-circPDE3B#1、si-circPDE3B#2、si-circPDE3B#1+inhibitor NC、si-circPDE3B#1+miR-1294 inhibitor 48 h。

1.5 細胞增殖的CCK-8法檢測將轉染第1、2、3、4天后的KYSE150細胞接種到96孔板中,每孔注入100 μL細胞懸液(3×104個/mL),孵育24 h后加入10 μL CCK-8溶液,2 h后用酶標儀測定450 nm處的吸光度值。實驗重復3次。

1.6 細胞克隆形成實驗轉染48 h后的細胞以1 000個/孔的密度接種到12孔板,孵育10 d后取出,PBS沖洗,多聚甲醛固定,結晶紫染色,Image J軟件計數克隆形成的細胞團數量。每個克隆直徑0.3～1.0 mm,含有50個以上的細胞團。實驗重復3次。

1.7 劃痕實驗當KYSE150細胞融合達到90%～100%時,用200 μL吸管尖端在細胞板上畫三條相互平行的軌跡。PBS沖洗,加入無血清培養基繼續培養。觀察劃痕實驗中細胞愈合情況,48 h后比較劃痕愈合率。劃痕愈合率=(初始劃痕面積-48 h后劃痕面積)/初始劃痕面積×100%。實驗重復3次。

1.8 細胞遷移和侵襲的Transwell實驗用基質膠覆蓋的Transwell小室進行細胞侵襲實驗,不覆蓋的進行細胞遷移實驗。以無胎牛血清的培養基調整KYSE150細胞密度為2×105個/mL。取200 μL細胞懸液接種于上室,底部小室裝入650 μL含體積分數20%胎牛血清的培養基,孵育36～48 h后取出,用多聚甲醛固定,結晶紫染色。在100倍倒置顯微鏡下拍攝,并用Image J軟件計數跨膜細胞。實驗重復3次。

1.9 雙熒光素酶報告實驗擴增野生型circPDE3B(circPDE3B WT)或突變型circPDE3B(circPDE3B MUT)序列,并將其插入到pmirGLO雙熒光素酶載體中。將上述報告載體分別與miR-1294 mimic或mimic NC共轉染293T細胞。48 h后使用雙熒光素酶報告分析系統檢測熒光素酶活性。

1.10 統計學處理ESCC組織和癌旁正常食管組織中circPDE3B表達的比較采用配對樣本t檢驗;5種細胞中circPDE3B表達,si-NC組、si-circPDE3B#1和si-circPDE3B#1+inhibitor NC組,以及si-NC組、si-circPDE3B#1、si-circPDE3B#1+inhibitor NC組和si-circPDE3B#1+miR-1294 inhibitor組細胞增殖能力、克隆形成數、劃痕愈合率、遷移細胞數和侵襲細胞數的比較均采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。

檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 ESCC組織和細胞中circPDE3B的表達ESCC組織中circPDE3B的表達(3.07±2.95)高于癌旁正常食管組織(1.45±1.34)(t配對=2.879,P=0.007);與HEEC細胞相比, EC9706、ECA109和KYSE150細胞中circPDE3B的表達升高,KYSE150細胞最高(表2)。選擇KYSE150細胞進行后續實驗。

表2 5種食管上皮細胞中circPDE3B的表達

2.2 敲低circPDE3B表達對KYSE150細胞增殖、遷移和侵襲的影響與si-NC組比較,si-circPDE3B#1和si-circPDE3B#2組細胞增殖受抑,circPDE3B表達降低,克隆形成數、遷移細胞數和侵襲細胞數減少,劃痕愈合率降低(表3、4)。

表3 3組KYSE150細胞吸光度值比較

表4 3組KYSE150細胞circPDE3B表達、克隆形成數、劃痕愈合率、遷移細胞數和侵襲細胞數比較

2.3 circPDE3B和miR-1294靶向關系驗證通過CircInteractome數據庫預測出circPDE3B可靶向miR-1294的結合位點(圖1)。將攜帶circPDE3B WT和circPDE3B MUT的報告載體分別與miR-1294mimic和mimic NC共轉染入293T細胞內,結果顯示circPDE3B WT和miR-1294 mimic共轉染組的熒光素酶活性降低(表5)。

圖1 circPDE3B與miR-1294的靶向關系

表5 雙熒光素酶報告實驗結果(n=3)

2.4 miR-1294 inhibitor對敲低circPDE3B表達的KYSE150細胞增殖、遷移和侵襲的影響與si-NC組比較,si-circPDE3B#1和si-circPDE3B#1+inhibitor NC組KYSE150細胞增殖受抑,克隆形成細胞數、遷移細胞數和侵襲細胞數減少,劃痕愈合率降低;miR-1294 inhibitor可部分逆轉以上變化(表6、7)。

表6 4組KYSE150細胞吸光度值比較

表7 4組KYSE150細胞克隆形成數、劃痕愈合率、遷移細胞數和侵襲細胞數比較

3 討論

多項研究[8-10]表明circRNA在食管癌中異常表達,并且能夠通過“海綿作用”調控下游miRNA的表達,進而抑制或促進食管癌的進展。食管癌組織中circ_0006168高表達,且能夠靶向調節miR-100/mTOR,促進食管癌的進展[11];高表達circ_0004771可通過作用于miR-339-5p/CDC25A通路,從而調節惡性食管癌的進展[12];在食管癌組織和細胞中,高表達的circ_0006948可直接與miR-490-3p結合,靶向癌基因高遷移率蛋白A2的3＇UTR,進而誘導食管上皮間質轉化[13]。本研究結果顯示ESCC組織和細胞中circPDE3B表達升高,敲低circPDE3B可以抑制ESCC細胞的增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力。

作為一組內源性非編碼小RNA分子,miR-1294在食管癌中的異常表達越來越受到重視[14-16]。Zong等[17]發現,LncRNA TUG1可通過負調節miR-1294的表達,促進食管癌細胞的凋亡。最新的研究[14]表明,miR-1294不僅能抑制ESCC細胞增殖、遷移、侵襲,還可誘導細胞周期停滯在G0/G1期,發揮抑癌作用。本研究中雙熒光素酶報告實驗結果顯示miR-1294和circPDE3B有靶向關系,抑制miR-1294可以部分逆轉敲低circPDE3B導致的ESCC細胞增殖受抑,克隆形成數、遷移細胞數和侵襲細胞數減少,劃痕愈合率降低。

總之,ESCC中circPDE3B表達上調,circPDE3B可能通過miR-1294影響ESCC細胞的增殖、遷移和侵襲。