電針對2型糖尿病大鼠胰島素抵抗及炎癥因子表達水平的影響

王香，張月，陳炫宜，楊怡然，洪肖娟

(成都中醫藥大學，四川 成都 610075)

2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM)是由于胰島素抵抗和胰島β細胞功能缺陷導致血糖升高的一種慢性疾病。根據國際糖尿病聯盟[1]發布的《全球糖尿病地圖(第10版)》數據顯示，2021年全球成年糖尿病患者人數達到5.37億，且此病引發的大血管病變、微血管病變等并發癥的致殘率和致死率逐年上升，已成為人類健康的第三大“殺手”[2- 3]。胰島素抵抗(IR)作為2型糖尿病的核心病理機制，改善IR是目前治療 T2DM 糖代謝紊亂的重要切入點。研究發現胰島素抵抗的發生主要與各種促炎或氧化應激介質誘導的特異性炎癥反應有關，尤其是促炎細胞因子，如白細胞介素1β(IL- 1β)、白細胞介素6(IL- 6)、腫瘤壞死因子α(TNF- α)、大量趨化因子(MCP- 1)等[4]，認為T2DM是一種炎性疾病的狀態[5]。慢性炎癥會導致糖脂代謝紊亂、加劇胰島素抵抗而加速T2DM進程[6- 7]。

針灸治療T2DM療效確切，能有效控制血糖。薈萃分析[8- 9]表明針灸有較好的降糖效果，可降低患者血糖、血脂水平，改善糖化血紅蛋白水平。同時針灸操作簡單、方便，費用低廉、療效顯著、無副作用的特點在 T2DM 慢病管理中具有顯著優勢[10]。2003年世界衛生組織便認可針灸是治療T2DM可行的有效手段之一，但目前針灸降糖機制尚不完全明確。大量研究顯示，針灸改善胰島素抵抗療效顯著[11- 12]，但針刺是否通過改善慢性炎癥從而緩解胰島素抵抗狀態、降低血糖尚未可知。因此本研究選用SD雄性大鼠為研究對象，以電針刺激“足三里”“三陰交”“胃脘下俞”等穴位為干預手段，通過觀察電針對 T2DM大鼠血糖、胰島素抵抗以及MCP- 1、TNF- α、IL- 6、IL- 1β、TGF- β1、IL- 10等炎癥因子水平的影響，探討電針改善T2DM糖脂代謝紊亂的潛在機制，為針灸治療T2DM提供更多的科學研究證據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

24只SPF級雄性SD大鼠，體質量(200±20)g，鼠齡2月，由北京斯貝福實驗動物有限公司提供，生產許可證號為【SCXK(京)2019- 0008】。全部大鼠飼養于恒溫(23±1)℃，相對濕度50%- 60%，12 h光照與12 h黑暗交替循環，所有動物均自由攝食飲水。該實驗方案已得到成都森威動物中心動物倫理委員會的批準。

1.2 主要儀器及試劑

儀器：華佗牌一次性無菌0.20 mm× 25 mm針灸針(蘇州醫療用品廠有限公司)，華佗 SDZ- II 型電針儀(蘇州醫療用品廠有限公司)，冷凍高速離心機(Minispin plus/Eppendorf)，孵育箱(賽默飛世爾科技)，酶標儀(RT- 6100/Rayto)，石蠟切片機(RM2245/ Leica)，Image J 圖像分析軟件(美國 NIH)，血糖試條及血糖儀(GA- 3/三諾官方旗艦店)。

試劑：STZ(Sigma 公司，美國，貨號：102559123)、ELISA試劑盒HbAc、TG、FINS、TNF- α、IL- 6、IL- 1β、MCP- 1、TGF- β1、IL- 10(江蘇酶免實業有限公司，中國，貨號分別為：MM- 21055R1、MM- 0610R1、MM- 0690R1、MM- 0180R1、MM- 0190R1、MM- 0047R1、MM- 0099R1、MM- 0181R1、MM- 0195R1)，4%多聚甲醛溶液(武漢塞維爾生物科技有限公司，中國，貨號：BL539A)、蘇木精- 伊紅染色液(北京索萊寶科技有限公司中國，貨號：G1140)。

2 實驗方法

2.1 T2DM大鼠模型的建立及分組

大鼠適應性喂養一周后，采用隨機數字表隨機分為空白組8只和造模組16只?？瞻捉M予普通飼料并灌胃0.9%氯化鈉溶液 3 mL/d，造模組予高脂高糖飼料并灌胃高脂高糖乳劑3 mL/d，連續喂養 4周后，進行腹腔注射2%鏈脲佐菌素30 mg/kg(溶于 0.1 mol/L 的檸檬酸- 檸檬酸鈉配制成 1%的溶液，pH值為4.2- 4.5)，同時空白組大鼠注射同樣體積的緩沖液。注射STZ 72 h 后，進行OGTT及隨機血糖檢測，兩次隨機血糖值均大于 16.7 mmol/L 且 OGTT 實驗 2 h的血糖值大于11.1 mmol/L 表示 T2DM 造模成功。16只造模成功的大鼠隨機分為T2DM 模型組(模型組)8只、T2DM 模型電針組(電針組)8 只。

2.2 干預方式

本研究針刺干預選用足三里、三陰交、胃脘下俞三個腧穴，穴位參照國家經穴部頒標準(GB12346- 90)及《中國獸醫針灸學》定位取穴，選用0.20 mm× 25 mm一次性毫針，毫針刺入3- 5 mm后針柄接電極，電針治療采用連續波，頻率為 10 Hz，強度 1.5- 2 mA(以引起大鼠肌肉輕微抖動為宜)，留針30 min，1次/d，連續治療6 d為1個療程，休息1 d，共治療4個療程?？瞻捉M、模型組同一時間進行抓取固定，不進行干預。

2.3 標本采集及指標監測

2.3.1 一般情況

實驗期間對各組大鼠精神狀態、活動情況、毛發色澤、飲水量、飲食量、尿量等進行觀察。

2.3.2 體質量、空腹血糖及糖耐量檢測

使用電子天平每周測量一次大鼠空腹體重(前一晚 22∶00- 次日早 8∶00禁食)，使用一次性血糖試紙測空腹血糖(次日早8∶00)并記錄；腹腔注射STZ 72 h后及干預完成后，各組大鼠禁食12 h，進行糖耐量檢測(OGTT)。

2.3.3 觀察各組大鼠胰腺組織HE染色病理切片

干預結束后處死各組大鼠，解剖后迅速采樣胰腺組織置于4%多聚甲醛中固定，24小時后通過常規脫水、浸漬、石蠟包埋制作切片，并進行HE染色，顯微鏡下觀察胰腺組織結構變化，觀察胰島細胞的病理性改變。

2.3.4 ELISA法檢測各組大鼠糖化血紅蛋白、甘油三酯、空腹胰島素及血清炎癥因子表達水平

稱重后用2%戊巴比妥鈉(0.2 mL/100 g)腹腔注射麻醉。大鼠完全麻醉后，腹主動脈取血，收集大鼠血漿，肝素鈉抗凝，靜置30 min，3000 r·min-1，離心半徑14 cm，4℃離心 15 min，取上層血清用于ELISA檢測。使用ELISA試劑盒，嚴格按照說明書檢測大鼠糖化血紅蛋白(HbAc)、甘油三酯(TG)及空腹胰島素(FINS)、TNF- α、IL- 6、IL- 1β、MCP- 1、IL- 10、TGF- β1等炎癥因子含量。計算各組大鼠胰島素抵抗指數HOMA- IR=空腹血糖×空腹胰島素/22.5。

2.4 統計學方法

3 實驗結果

3.1 各組大鼠一般情況及行為學觀察

4個療程干預后，空白組大鼠精神狀態佳，動作敏捷，毛發光亮，飲食、二便正常。模型組大鼠精神倦怠，反應遲鈍，毛色晦暗而粗糙、易脫落，同時日飲食量、日飲水量、尿量增多及體重逐漸消瘦，表現典型的T2DM 大鼠的多飲、多食、消瘦的癥狀。電針組大鼠精神狀態、反應靈敏度明顯改善，大鼠日飲水量、日飲食量、尿量有所改善，體重減輕不明顯。見圖1。

注：A為空白組、B為模型組、C為電針組

3.2 各組大鼠實驗干預前后的體重、血糖及OGTT變化

造模后，與空白組相比，模型組和電針組體重較重(P<0.05)，模型組與電針組之間體重無統計意義；干預4周后，與空白組相比，模型組體重明顯降低(P<0.01)，電針組體重有所減輕(P<0.05)；與模型組相比，電針組體重較高(P<0.05)；各組治療前后均有差異。見圖2。

注：與空白組比較，*P<0.05；與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05；與治療前相比，△P<0.05；與治療前相比，△△P<0.01

造模72 h后，模型組及電針組大鼠血糖及OGTT AUC明顯高于空白組，差異具有統計學意義(P<0.01)，血糖值>16.7 mmol/L 且 OGTT 實驗2 h血糖>11.1 mmol/L，說明模型建立成功，模型組與電針組之間無顯著差異(P>0.05)；干預4周后，與空白組相比，模型組血糖及OGTT AUC明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，電針組大鼠血糖及OGTT AUC有所降低(P<0.05)；且電針組血糖及OGTT AUC較治療前有所降低(P<0.05)。見圖2。

3.3 各組大鼠胰腺組織形態學的變化觀察

正常組大鼠胰腺組織結構完整，胰島呈規則的橢圓形，邊界清晰，胰島內β細胞豐富均勻、形態飽滿、排列緊密，未見明顯病理變化；模型組大鼠胰腺組織結構不完整，胰島形態不規則，邊緣模糊，胰島面積縮小，胰島內β細胞減少、排列紊亂，分布不均，部分變形；電針組大鼠胰腺組織結構較完整，胰島邊界清晰，胰島面積及β細胞形態結構有所恢復，且β細胞數目較模型組增多。見圖3。

注：A為空白組100×，B為模型組100×，C為電針組100×，D為空白組400×，E為模型組400×，F為電針組400×；黑色箭頭示胰島β細胞

3.4 各組大鼠HbAc、TG、FINS及HOMA- IR 的比較

干預后，與空白組相比，模型組HbAc及TG含量升高(P<0.05)；與模型組相比，電針組HbAc、TG含量有所降低(P<0.05)，與空白組比較無顯著性差異(P>0.05)。見圖4。

注：與空白組比較，*P<0.05；與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05；與模型組比較，## P<0.01

電針4周后，與空白組相比，模型組FINS含量顯著升高(P<0.01)，電針組FINS含量有所升高(P<0.05)，與模型組相比，電針組FINS含量降低(P<0.05)；進一步分析計算各組大鼠HOMA- IR 值，結果顯示：與空白組相比，模型組及電針組的HOMA- IR 值顯著升高(P<0.01)，與模型組相比，電針組 HOMA- IR 值顯著降低(P<0.01)。見圖4。

3.5 各組大鼠血清MCP- 1、TNF- α、IL- 6、IL- 1β、TGF- β1、IL- 10炎癥因子表達水平的比較

促炎因子結果顯示，與空白組相比，模型組MCP- 1、TNF- α、IL- 1β含量明顯升高(P<0.01)，模型組IL- 6及電針組MCP- 1、TNF- α、IL- 6較于空白組有所升高(P<0.05)；與模型組相比，電針組的MCP- 1、TNF- α、IL- 6、IL- 1β有所降低(P<0.05)?？寡滓蜃咏Y果顯示，與模型組相比電針組的TGF- β1含量(P<0.01)、IL- 10含量(P<0.05)升高，見圖5。

注：與空白組比較，*P<0.05；與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05；與模型組比較，##P<0.01

4 討論

糖尿病屬中醫學“消渴”的范疇，古籍關于其記載頗豐，最早出現在《黃帝內經》的《素問·奇病論篇》中：“有病口甘者，病名為何？何以得之？岐伯曰：此五氣之溢也，名曰脾癉?！盵13]針灸治療本病歷史悠久，在《針灸甲乙經》中已有治療糖尿病的取穴記載，如：“陰氣不足，熱中消谷善饑，腹熱身煩狂言，三里主之；嗜臥，四肢不欲動搖，身體黃，灸五里，左取右，右取左?！盵14]說明本病與脾胃關系密切。本研究選穴基于古籍記載及相關數據挖掘[15- 16]，發現足三里、三陰交、胃脘下俞治療2型糖尿病臨床使用頻率較高且療效確切。足三里為足陽明胃經的合穴和下合穴，是胃經經氣匯聚之處，對于脾胃的推動和氣血運行具有較好的作用；三陰交為肝脾腎三經交會穴，可調補肝腎、調理氣血、疏經通絡；胃脘下俞為背俞穴，中醫認為背俞穴與相應的器官之間存在體表- 神經階段- 內臟聯系，本穴處于第八胸椎棘突下后正中線旁開1.5寸，該穴所處位置有支配胰腺的神經傳入，且該穴是治療糖尿病的經驗穴。結合團隊前期研究基礎[17]，發現電針雙側足三里、三陰交和胃脘下俞穴可改善 T2DM 大鼠糖代謝紊亂和胰島素抵抗狀態。

胰島素抵抗是引發 T2DM 的始動因素，發生胰島素抵抗后，機體對葡萄糖的攝取利用降低，血糖持續升高，機體代償性的分泌過多胰島素從而導致高胰島素血癥，并進一步導致糖尿病的發生發展[18]。流行病學調查顯示，約24.4%的糖尿病患者是由胰島素抵抗所致[19]。因此，研究胰島素抵抗的病理機制及改善胰島素抵抗尤為重要。已有研究表明電針能夠調控線粒體動力學相關蛋白，增加T2DM大鼠葡萄糖代謝能力以減輕胰島素抵抗狀態[20]；針刺通過胰腺內在神經系統的神經調節，增加膽堿乙酰轉移酶和神經肽Y表達，促進胰高血糖素樣肽- 1的分泌，實現降糖作用，提高胰島素敏感性，改善胰島素抵抗[21]。本次研究也證實電針干預足三里、三陰交、胃脘下俞可降低 T2DM 大鼠 FBG、HOMA- IR。

研究表明T2DM是一種炎性疾病[22- 23]，IL- 1β、IL- 6水平升高可預測T2DM的發生[24]。在2型糖尿病患者與健康人的研究中發現，前者IL- 6、TNF- α和 C 反應蛋白 (C- reactive protein，CRP)水平顯著升高，會對胰島細胞產生細胞毒性作用，加速糖尿病的發生[25]。慢性炎癥與胰島素抵抗的發生關系密切，是誘導胰島素抵抗的重要機制[26- 27]，如TNF- α會損害胰島素信號通路從而誘導胰島素抵抗[28]。部分學者認為，在2型糖尿病患者中，全身的炎癥因子含量增加會導致IR的發生[29]。而已有相關研究證明，電針耳甲可降低T2DM模型大鼠促炎因子TNF- α，升高抗炎細胞因子IL- 10[30]；“標本配穴”針刺干預結合其他療法可降低T2DM患者IL- 6、1L- 1β及TNF- α等炎性細胞因子[31]。動物實驗[32]及臨床試驗[33]也證實溫針灸可有效改善糖尿病糖脂代謝及胰島素抵抗狀態。因此，改善慢性炎癥狀態從而改善胰島素抵抗可能是針刺治療T2DM的重要途徑?；诖?，發現電針干預4周后，2型糖尿病大鼠FBG、HbAc、FINS、HOMA- IR指數水平均下降且抗炎因子(TGF- β1 、IL- 10)含量明顯升高，促炎因子(TNF- α、IL- 6、IL- 1β、MCP- 1)明顯降低，說明電針可以緩解T2DM大鼠慢性炎癥狀態、改善胰島素抵抗發揮降低血糖的作用。

綜上所述，電針可以調控T2DM大鼠炎癥因子表達水平，抑制低度炎性狀態，有效改善2型糖尿病大鼠的糖脂代謝水平、胰島素抵抗狀態及胰島β細胞的形態結構。但電針調節T2DM炎癥因子水平的作用機制還需進一步探討研究，因此，后續還需從相關炎癥信號通路著手，探究電針是否通過調控相關信號通路抑制低度炎癥從而起到改善2型糖尿病相關癥狀的作用。