Box- Behnken響應面法結合多指標綜合評分法優化俄色葉(變葉海棠)配方顆粒的提取工藝

蔣孟蓮，徐俊，顏雨豪，楊轉珍，楊永泓，康晉梅，陳怡璇，蔡曉洋，李敏

(成都中醫藥大學 藥學院/現代中藥產業學院/省部共建西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137)

藏藥材俄色葉為薔薇科蘋果屬植物變葉海棠Malus toringoides (Rehd.)Hughes或花葉海棠Malus transitoria(Batal.)Schneid.的干燥葉及葉芽[1]，具有攻堅化積、除膩滌滯、保肝利膽的功效，為甘孜藏族自治州民間的一味藥食兩用藥材，其藥用和食用歷史悠久。俄色葉藥材始載于《四部醫典》[2]，現已被《四川省藏藥材標準》(2014年版)[1]收載。俄色葉中主要含有黃酮類成分，變葉海棠葉中總黃酮含量高于花葉海棠，且變葉海棠在四川省甘孜州地區的資源蘊藏量遠大于花葉海棠，綜合成分含量和資源蘊藏量，為保證俄色葉的可持續發展，因此本研究選擇變葉海棠為研究對象。目前從俄色葉中已分離鑒別出20余種化合物，其黃酮類成分主要包括金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素、根皮素、蘆丁、紫云英苷[3- 5]等。其中根皮苷、根皮素、槲皮素具有降血糖、抗氧化、保肝[6- 8]、降血脂[9- 10]等作用。俄色葉中總黃酮含量約為同科屬植物西府海棠葉中的2倍[11]，其根皮苷含量約為湖北海棠葉中的6倍[12]，為尖嘴林檎葉中的33倍[13]。因此俄色葉的主要活性成分為黃酮類成分。

隨著中藥配方顆粒需求日益增高，國家食品藥品監督管理總局制定了《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求(征求意見稿)》，對中藥配方顆粒的制備工藝進行整體規定。但是各個生產企業僅根據自身的經驗和企業現有的設施、輔料等進行具體品種生產，沒有統一生產工藝參數，導致企業生產的同品種配方顆粒在規格、療效上存在差異[14]。因此對中藥配方顆粒制備工藝進行研究，并建立具體品種生產工藝具有重要意義，從而保障藥品質量穩定和療效。因此，本研究采用單因素結合Box- Behnken響應面法，篩選俄色葉(變葉海棠)配方顆粒的最佳提取工藝，為配方顆粒質量標準研究奠定基礎。

1 實驗材料與設備

1.1 實驗材料

俄色葉(變葉海棠)藥材采集自四川省甘孜州爐霍縣，凈制去除枝干雜質得到俄色葉(變葉海棠)飲片，經成都中醫藥大學李敏教授鑒定為薔薇科蘋果屬植物變葉海棠Malustoringoide(Rehd.)Hughes.的干燥葉。

1.2 試劑

綠原酸(批號：Wkq20042702，四川省維克奇生物科技有限公司)、金絲桃苷(批號：Wkq21021904，四川省維克奇生物科技有限公司)、異槲皮苷(批號：Wkq21061105，四川省維克奇生物科技有限公司)槲皮苷(批號：Wkq21022402，四川省維克奇生物科技有限公司)、根皮素(批號：Wkq21020808，四川省維克奇生物科技有限公司)、根皮苷(批號：Wkq20070810，四川省維克奇生物科技有限公司)、槲皮素(批號：Wkq20061112，四川省維克奇生物科技有限公司，純度均大于98%。乙腈、磷酸為色譜純，水為超純水。

1.3 儀器

UltiMate3000高效液相色譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；BP121S旋轉蒸發儀(德國Sartorius公司)；MD- DG30E103全自動煎藥壺(潮州市一壺百飲電器實業有限公司)；BP121S十萬分之一電子天平(德國Sartorius公司)；KQ- 500DE數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SCIENTZ- 20F/A冷凍干燥機(寧波新芝)。

2 實驗方法

2.1 俄色葉(變葉海棠)配方顆粒提取工藝評價指標

俄色葉(變葉海棠)配方顆粒提取工藝采用多指標綜合評價法對9個質量指標進行綜合評分，綜合分析篩選出最佳參數，其中出膏率(X1)、總黃酮(X2)、根皮苷(X3)、根皮素(X4)、綠原酸(X5)、金絲桃苷(X6)、異槲皮苷(X7)、槲皮苷(X8)、槲皮素(X9)為指標，以各指標質量分數的最大值作為參照對數據進行標準化處理，得到綜合評分公式：綜合得分(Y)=(X1/X1max)×0.2+(X2/X2max)×0.2+(X3/X3max)×0.3+(X4/X4max)×0.05+(X5/X5max)×0.05+(X6/X6max)×0.05+(X7/X7max)×0.05+(X8/X8max)×0.05+(X9/X9max)×0.05?？傸S酮含量參照俄色葉中藥標準(SCYPBZ2021- 001)項下總黃酮的測定方法[1]。綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素、根皮素7種成分含量參照課題組前期建立的含量測定方法[15]進行測定。

2.2 7種黃酮類成分含量測定方法

2.2.1 色譜條件

色譜條件 Insertsil ODS- 3 色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm )；流動相乙腈(A)- 0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0- 5 min，12%- 15%A；5- 15 min，15%- 20% A；15- 28 min，20% A；28- 48 min，20%- 42% A；48- 50 min，42%- 50% A；50- 55 min，50%- 12% A)；體積流量0.7 mL/min；柱溫30℃；檢測波長340 nm；進樣量10 μL。

2.2.2 對照品溶液制備

取綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素、根皮素各對照品適量，精密稱定，分別置于不同25 mL量瓶中，用75%甲醇溶解并定容，制備各單一對照品母液。分別取一定量的各對照品母液，置于同一10 mL量瓶中，用75%甲醇稀釋制成綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素質量濃度分別為0.125 mg/mL、0.35 mg/mL、0.86 mg/mL、0.38 mg/mL、9.3 mg/mL、0.01 mg/mL和0.85 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

取俄色葉藥材細粉(過四號篩)約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲(功率：500 W，頻率：40 kHz)處理45 min，放冷，用75%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.4 系統適應性試驗

按照“2.2.1”項下色譜條件測定混合對照品溶液、俄色葉供試品溶液和陰性樣品溶液，結果表明樣品中各成分分離度和理論板數均較好，且陰性無干擾，見圖1。

注:A- 混合對照品,B- 俄色葉樣品,C- 陰性對照;1- 綠原酸,2- 金絲桃苷,3- 異槲皮苷,4- 槲皮苷,5- 根皮苷,6- 槲皮素,7- 根皮素

2.3 單因素試驗

2.3.1 浸泡時間考察

參考標準湯劑的制備方法，取俄色葉飲片50 g，按料液比1：15，提取時間30 min，提取次數2次，分別考察浸泡0 min、15 min、30 min、45 min、60 min對提取效果的影響，結果見表1。由表可知，浸泡30 min后，各成分變化微弱，故確定30 min為最佳浸泡時間。

表1 不同浸泡時間考察 %

2.3.2 料液比考察

取俄色葉飲片50 g，浸泡30 min，提取時間30 min，提取次數2次，分別考察料液比1：10、1：15、1：20、1：25、1：30對提取效果的影響，結果見表2。

表2 不同料液比考察 %

表3 不同提取時間考察 %

由表可知，隨著提取時間的增加，綜合評分呈現先升高后降低的趨勢，在提取60 min時綜合評分最高，故確定60 min為最佳提取時間。

2.3.4 提取次數考察

取俄色葉飲片50 g，按料液比1∶15，浸泡30 min，提取45 min，分別考察提取次數1次、2次、3次對提取效果的影響，結果見表4。

表4 不同提取時間考察 %

由表可知，隨著提取次數的增加，綜合評分逐漸升高，提取次數為3次時，綜合評分最高，故選擇3次為最佳提取次數。

綜合單因素實驗結果，初步確定提取工藝參數為取俄色葉飲片加水煎煮兩次，第一次加15倍量水，浸泡30 min，煎煮60 min；第二次加13倍量水，煎煮60 min；第三次加13倍量水，煎煮60 min，濾過，即得。

2.4 響應曲面試驗

2.4.1 Box- Behnken響應曲面試驗

響應曲面試驗以浸泡時間(X1)、料液比(X2)、提取時間(X3)、提取次數(X4)4個因素作為自變量，利用Design- Expert8.0.6軟件按照Box- Behnken的中心組合實驗設計，選擇5個中心實驗點，得到29個實驗點，進行4因素3水平試驗。以綜合評分為響應值，通過響應面分析提取工藝的優化，得到最佳提取工藝，實驗設計見表5，實驗結果見表6。

表5 因素設計表

表6 Box- Behnken實驗結果

以提取工藝中綜合得分為因變量，對浸泡時間、料液比、提取時間、提取次數各因素進行多元回歸擬合，得到二項式擬合的復相關系數r2=0.8872，模型P<0.05，達顯著水平，說明模型擬合度良好，使用此方程可以代替真實的試驗點進行分析。由表7可知，回歸方程失擬性檢驗P=0.1913>0.05，無顯著性差異，說明該方程與實際情況擬合良好，模型的殘差可能是隨機誤差產生，可用此模型來分析預測最佳提取工藝。由方差分析得到多元回歸擬合方程為綜合得分=0.71-0.011A+0.013B+5.912E-003C+0.089D+0.024AB+0.029AC-0.045AD+5.639×10- 3BC+5.684×10- 3BD-0.046CD-0.016A2+0.035B2+8.531×10- 3C2-0.027D2。

表7 響應面方差分析

從F值的大小可知，單因素對提取的影響順序為D>B>A>C，即提取次數>料液比>浸泡時間>提取時間；且回歸模型中1次項A、B、C不顯著，D顯著；2次項均顯著；交互項AB、AC、BC、BD不顯著，AD、CD顯著，說明不同的提取工藝與綜合得分之間不是簡單的線性關系。通過DesignExpert8.0.6軟件對各因素之間的交互作用進行響應面分析，繪制響應面曲線圖，響應曲面陡峭程度越大，則對綜合得分的影響也越大，結果見圖2。

圖2 基于響應曲面法不同因素對綜合得分的影響

根據響應曲面結果篩選出最佳提取工藝為按料液比1：15加水，浸泡27.85 min，提取3次，每次45 min。結合實際生產能耗和其他生產成本控制因素，以及最接近標準湯劑原則，確定更合理的提取工藝，將最佳提取工藝條件修正為取俄色葉飲片加水煎煮兩次，第一次加15倍量水，浸泡30 min，煎煮45 min；第二次加13倍量水，煎煮45 min，濾過，即得。

2.5 提取工藝驗證試驗

根據“2.3.1”優選出的最佳工藝制備3批樣品，測定樣品中多種成分的含量，并進行綜合評分，見表8。由最佳提取工藝所得提取液的測定結果可知，實測OD值與預測值0.938的相對誤差較小(3.08%)，表明本實驗所建立的回歸模型準確可靠，優化得到的最佳加工工藝重現性好。

表8 驗證試驗結果 %

3 討論

3.1 俄色葉(變葉海棠)標準湯劑及配方顆粒指標成分的選擇

目前《四川省藏藥材標準》(2014年版)中僅對俄色葉項下總黃酮和根皮素含量做出規定，但研究表明，俄色葉中已能分離鑒別出20余種化合物[16]，其黃酮類成分根皮苷、根皮素、槲皮素具有多種重要生物活性，因此黃酮類成分的含量對保證俄色葉藥材質量和藥效十分重要。本實驗選擇綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素、根皮素這7個黃酮類成分作為評價指標，能夠更好地評價俄色葉(變葉海棠)配方顆粒的提取工藝。

3.2 俄色葉(變葉海棠)配方顆粒提取工藝的確定

本實驗首先采用單因素實驗對俄色葉配方顆粒提取工藝的浸泡時間、提取時間、料液比、提取次數四因素進行考察，初步確定為浸泡30 min，料液比1：15，提取時間60 min，提取次數3次。標準湯劑制備工藝研究表明飲片的吸濕率為200%，故在對料液比進行考察時，針對飲片吸濕對水的損耗，第二次加水量均在第一次加水的基礎上減少2倍水。隨后采用響應曲面法對篩選出的提取工藝進行綜合實驗，分析不同因素對配方顆粒提取率的綜合影響，結合現代實際生產情況，對正交實驗確定的條件進行修正為取俄色葉飲片加水煎煮兩次，第一次加15倍量水，浸泡30 min，煎煮45 min；第二次加13倍量水，煎煮45 min，濾過，即得。

綜上分析，本文采用單因素結合Box- Behnken響應曲面實驗，以7種黃酮類成分含量、總黃酮、出膏率的綜合評分為考察指標，優選俄色葉(變葉海棠)配方顆粒最佳提取工藝為：加水煎煮兩次，第一次加15倍量水，浸泡30 min，煎煮45 min；第二次加13倍量水，煎煮45 min，濾過，合并煎液。四川省藏藥資源豐富，而且在許多高原疾病上面具有顯著優勢，但是目前許多藏藥的研究開發仍較為薄弱，需要加強對其化學成分、作用機制等方面的研究[17]。本文僅對俄色葉(變葉海棠)配方顆粒的提取工藝進行了研究，后續還需建立其配方顆粒的質量標準評價方法，以完善整個俄色葉(變葉海棠)配方顆粒的質量控制體系。