基于網絡藥理學及分子對接技術探究三棱-莪術配伍在卵巢癌輔助治療中的作用機制*

李鴻博，石丹寧，張杜娟，張 璐，李 翡△

1 陜西中醫藥大學附屬醫院，陜西 咸陽 712000； 2 陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046；3 北京中醫藥大學生命科學學院，北京 100029

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是女性生殖系統常見的三大腫瘤之一，由于其發病早期多無典型臨床癥狀，約70%的患者在確診時已屬晚期［1-2］。針對卵巢癌，臨床上常采用手術聯合放、化療的方案進行治療，不幸的是，雖然進行了及時的干預，但晚期卵巢患者的5 年生存率仍不足50%［3-4］。一項關于中國癌癥的統計顯示，在2015 年，中國女性中卵巢癌患者達到5.21 萬例，死亡人數達到2.25 萬例［5］。此外，全球每年新發卵巢癌約為22.5 萬例，且發病年齡趨于年輕化［6］。怎樣降低卵巢癌術后復發，提高患者5 年生存率，成為卵巢癌治療的研究重點。盡管新輔助化療、靶向治療等方法在臨床上得到重視，但患者耐受性程度不同或由于靶向單一，以至于無法滿足所有類型卵巢癌患者的治療需求，使得上述療法在臨床上的應用有一定局限性。

近年來，中醫藥以其獨特的優勢，在腫瘤的輔助治療中發揮著重要作用。中醫學古籍中雖無對“卵巢癌”一詞的記載，但其臨床癥狀和體征與《黃帝內經》中描述的“腸覃”相似，概屬中醫婦科“癥瘕”范疇。治療該類病證，中醫多采用活血化瘀，消積化癥之法。通過研究臨床常用于輔助治療卵巢的中藥復方，發現常用方劑理沖生髓飲、益氣活血解毒湯、復方大七氣湯等，均屬臨床中輔助治療卵巢癌的常用方劑［7-9］。分析其組方發現，以上方劑中均含有“三棱-莪術”藥對。三棱，味苦，性平，歸肝、脾經。其功效為破血行氣，消積止痛，常用于治療癥瘕痞塊，瘀血經閉，胸痹心痛等證；莪術，味辛、苦，性溫，歸肝、脾經，亦有破血行氣，消積止痛之效，常用于治療血瘀腹痛、積聚、婦女血瘀經閉等。臨床上，該藥亦廣泛應用于其他婦科腫瘤的治療中，可發揮抑制腫瘤細胞增殖和轉移、調節機體免疫等作用。

為了探究三棱-莪術藥對治療卵巢癌的潛在機制，本研究采用網絡藥理學，篩選三棱-莪術的有效成分及其作用靶點，通過生物功能及通路富集等分析其潛在的作用機制，此外，使用分子對接技術深入研究核心成分及關鍵靶點的相互作用，以期為三棱-莪術配伍的臨床應用提供新的理論依據，為臨床輔助治療卵巢癌以及開發新藥提供新的參考。

1 資料與方法

1.1 “三棱-莪術”藥對的活性成分及作用靶點的篩選基于中藥系統藥理學分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）［10］，檢索三棱及莪術兩味中藥的化學成分，篩選生物口服利用度（oral availability，OB）≥30%，且類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 的化合物，同時收集其作用靶點。利用R軟件，并基于Uniprot數據庫將化合物作用靶點轉換為規范基因名。

1.2 卵巢癌相關基因的篩選并獲取“藥物-疾病”交集基因通過Genecard 數據庫，以“ovarian cancer”為關鍵詞進行檢索，得到7946 個與卵巢癌相關的基因，根據相關性評分，篩選評分≥10 的基因進行后續研究。將得到的1541 個與卵巢癌相關的基因與三棱-莪術藥對的靶基因取交集，得到27 個“藥物-疾病”交集基因，并繪制韋恩圖以展示二者的聯系。

1.3 構建“藥物-疾病”交集基因蛋白互作網絡以獲取關鍵基因將“藥物-疾病”交集基因導入STRING 11.0［11］，獲取該27 個靶點的蛋白質互相作用網絡，同時運用Cluster 功能將交集靶點進行聚類分析，進一步闡述交集靶點間的緊密關系。此后，將PPI 網絡導入Cytoscape 3.6 軟件中，利用Cytohuba插件對PPI進行進一步的分析以確定關鍵基因。

1.4 基因本體論（gene ontology，GO）與京都基因和基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析應用在線富集分析軟件（WEB-based GEne SeT AnaLysis Toolkit，http：//www.webgestalt.org/）對“疾病-藥物”重合基因進行GO 富集分析，富集內容主要包括生物過程（biological process，BP）、細胞組成（cellular component，CC）及分子功能（molecular function，MF）三個部分，并以P＜0.01 為獲取標準，根據其富集程度及顯著性，對篩選結果進行可視化處理。此外，應用R 軟件進行KEGG 通路富集分析，并通用Cytoscape 軟件中的ClueGo 富集分析插件以P＜0.01 為篩選標準，對通路富集結果進行聚類分析。

1.5 構建網絡圖應用Cytoscape 3.6.0 軟件，分別構建“中藥-成分-疾病-靶點”網絡及“靶點-通路”網絡，進一步分析三棱-莪術配伍在治療卵巢癌過程中發揮作用的核心成分、關鍵基因及信號轉導過程，以闡釋其作用的潛在機制。

1.6 核心成分與關鍵基因的分子對接根據“中藥-成分-疾病-靶點”網絡及PPI 互作網絡的分析結果，將活性成分及作用靶點按degree 高低進行排序，選擇排序前兩位的化合物以及核心靶點，在RSCB PDB 數據庫中選擇相應的靶點蛋白結構并下載pdb 格式文件。根據TCMSP 中化合物分子的結構圖，在ChemDraw 3D 軟件中繪制核心成分結構圖。通過AutoDockTools 軟件將靶點蛋白和化合物分子配體進行處理，再通過AutoDock-Vina計算結合能，輸出對接結果，應用Pymol 及Discovery Studio進行數據可視化。

2 結果

2.1 三棱-莪術的活性成分與作用靶點的篩選通過TCMSP 數據庫篩選，共得到三棱活性成分30個及莪術活性成分81個。符合篩選條件OB≥30%，DL≥0.18 的活性成分分別為三棱5 個，莪術3 個。在TCMSP中分別輸入這8個活性成分，獲取其潛在的作用靶點，去重后得到60個靶點。見表1。

2.2 卵巢癌相關靶點及“疾病-藥物”重合靶點的獲取通過Genecard 數據庫，以“ovarian cancer”為關鍵詞，檢索到人類相關基因共7946 個，根據基因與疾病相關性評分，篩選評分≥10 的基因，得到1540 個與卵巢癌相關的基因。三棱-莪術作用于卵巢癌的潛在靶點，見表2。將三棱-莪術靶點與卵巢癌相關基因取交集，共得到27 個“疾病-藥物”交集基因。見圖1。

圖1 三棱-莪術與卵巢癌交集靶點Venn圖

表2 三棱-莪術藥對治療卵巢癌核心靶點

2.3 蛋白互作（Protein-Protein Interaction，PPI）網絡構建與分析通過STRING 數據庫構建這27 個重合基因的PPI 網絡，分析顯示該網絡中共有27 個節點（nodes），124 條邊（edges），其中PRSS1 基因與其他各基因之間無互相作用，見圖2。選取剩余26 個基因導入Cytoscape 3.6.0 軟件中，應用Cytohubba插件，分析上述26個基因中的關鍵節點。其中JUN，CASP3，ESR1，PTGS2 等基因互作頻次最高，靶點之間的相互作用強，degree值大，在該互作網絡中具有重要作用，說明上述基因可能為三棱、莪術活性成分在卵巢癌治療中的潛在作用靶點。見圖3。

圖2 通過STRING數據庫構建PPI網絡圖

圖3 PPI網絡圖

2.4 “中藥-活性成分-疾病-靶點”網絡構建將獲得的中藥、活性成分、疾病、靶點等相關信息通過R 軟件進行分析，其結果通過Cytoscape 3.6.0軟件進行可視化處理，獲得“中藥-活性成分-疾病-靶點”網絡。該網絡共包括節點35 個，其中中藥2個，活性成分5個，靶點27個，疾病1個。結果充分提示三棱、莪術中活性成分與卵巢癌多靶點作用的特點。通過分析網絡發現，在三棱諸成分中，與治療卵巢癌這一作用相關性最高的前三位活性成分依次為：芒柄花黃素，β-谷甾醇，豆甾醇，而在莪術諸成分中，發揮主要作用的成分為常春藤皂苷元。見圖4。

圖4 中藥-活性成分-疾病-靶點網絡圖

2.5 GO 功能注釋與KEGG 信號通路富集分析通過在線富集分析軟件進行GO 富集后，得到結果如圖5所示。結果顯示，藥物-疾病重合基因參與的生物過程主要包括代謝過程、刺激反應、生物調節等；參與的細胞組成主要包括膜包圍的內腔、細胞核、細胞質基質等；參與的分子功能主要包括蛋白質結合、離子絡合、核酸結合等。通過R軟件進行KEGG通路富集分析，共得到104條相關通路（P＜0.05）。根據其富集程度排序后篩選前20 條通路進行可視化處理得到如圖6 所示的氣泡圖，結果顯示疾病-藥物重合基因主要神經退行性病變、乙肝、HIV病毒感染、卡波濟肉瘤相關皰疹病毒感染、人巨細胞病毒感染、IL-17 信號通路、雌激素信號通路等相關。此外，應用Cytoscape/Clue Go 軟件對重合基因以P＜0.01，Kappa 系數=0.4 為標準進行KEGG通路聚類分析，結果如圖7所示，進一步提示三棱、莪術在卵巢癌的治療中可能主要通過調控IL-17 信號通路、凋亡信號通路、雌激素信號通路等來達到治療目的。

圖5 GO富集分析

圖6 KEGG通路富集分析

圖7 KEGG通路聚類分析

2.6 “三棱-莪術”核心活性成分與關鍵靶點的分子對接綜合“中藥-活性成分-疾病靶點網絡”及PPI 互作網絡，選取三棱的核心成分芒柄花黃素（formononetin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）與莪術的核心活性成分常春藤皂苷元（hederagenin）分別與PPI網絡排名前十且與核心成分相關聯的靶點進行分子對接模擬研究。對接結果如表3所示，各分子間親和力均小于-7 kcal/mol，說明分子間具有良好的對接活性。其中，芒柄花黃素、β-谷甾醇及常春藤皂苷元與PTGS2 對接時，親和力均小于-9.0 kcal/mol，對接活性極佳，這表明PTGS2 很可能是三棱-莪術藥對治療卵巢癌的潛在靶點。使用Pymol及Discovery Studio軟件分析對接結果并將結果進行可視化，分子間作用力由2D 圖展示，見圖8-10，其中PTGS2 與β-谷甾醇相互作用的Vina Score（即結合能）最佳，為-9.3 kcal/mol。結合圖9 可以看出，β-谷甾醇與PTGS2蛋白之間通過豐富的π-烷基疏水鍵形成較為穩定的結構。其次，芒柄花黃素與PTGS2（結合能為-9.1 kcal/mol）依靠氫鍵、π-烷基疏水鍵、π-陰離子鍵等形成較為穩定的結構。

圖8 芒柄花黃素與對應靶點對接結果

圖9 β-谷甾醇與對應靶點對接結果

圖10 常春藤皂苷元與對應靶點對接結果

表3 三棱-莪術中活性成分與其對應靶點的結合能kcal/mol

3 討論

手術及術后放化療依然是目前臨床治療卵巢癌的主要手段。長期以來，中醫藥在婦科各類疾病的治療中具有舉足輕重的地位，尤其在惡性腫瘤的治療過程中，手術及放化療后配合中醫藥輔助治療，可明顯緩解副作用給患者帶來的痛苦［12］。此外，堅持口服湯藥的患者，5 年生存率明顯高于未經中醫藥治療的患者［13-14］。卵巢癌在中醫婦科學中屬“癥瘕”范疇，其證成因多為瘀血凝滯。三棱、莪術二藥均有破血行氣、消積止痛之效，善緩結消癥，可治血瘀腹痛及婦女血瘀經閉等，但由于中藥本身多成分、多靶點的特性，使其作用機制的詳盡闡述頗為困難。網絡藥理學是近年來基于系統生物學的一種新興研究方法，能夠較為系統地探討中藥及其復方多成分、多靶點的作用機制［15-16］，為研究中藥帶來全新的思路。

本研究采用網絡藥理學結合分子對接技術的研究方法，較為全面地探究了治療卵巢癌常見配伍三棱-莪術的活性成分及其潛在靶點。通過構建并分析“中藥-成分-疾病-靶點”網絡圖，結果發現芒柄花黃素、β-谷甾醇、常春藤皂苷元是三棱-莪術藥對發揮治療卵巢癌作用的關鍵活性成分。芒柄花黃素（formononetin），又稱刺芒柄花素或芒柄花素，是一種生物活性異黃酮，是常用中藥當歸、黃芪、三棱等的活性成分之一。研究表明，芒柄花黃素具有保護血管、抗炎、抗焦慮、抗腫瘤［17］等多種活性。其中，抗腫瘤活性，尤其是其抗卵巢癌的活性，近年來備受研究者們關注。古彩茹等［18］通過體外實驗發現，芒柄花黃素能夠抑制卵巢癌細胞SKOV-3 的遷移和侵襲，其作用機制可能是通過芒柄花黃素增加了E-cadherin 并降低MMP-9 的表達實現的。顧萬等［19］同樣利用SKOV-3細胞進行了體外實驗研究，結果顯示芒柄花黃素能夠通過調節凋亡蛋白Bax 及抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表達，誘導卵巢癌SKOV-3 細胞的凋亡。常春藤皂苷元（Hederagenin）是一種五環三帖酸類化合物，具有抗腫瘤［20］、抗抑郁［21］等藥理作用和生物活性。左方等［22］通過體外實驗發現，常春藤皂苷元能夠抑制乳腺癌細胞MCF-7 的增殖，誘導凋亡和減少侵襲，其作用機制分別涉及調節PCNA、Bcl-2/Bax 及MMP-9 的表達；此外，研究表明常春藤皂苷元表現出對宮頸癌細胞［23］、胃癌細胞［24］等多種腫瘤細胞明顯的抑制作用，然而，其在卵巢癌中的藥理作用尚未見報道。β-谷甾醇是一種植物甾醇，存在于包括天麻在內的多種中草藥之中，可在人體內發揮多種有益的作用，其所表現出的抗腫瘤作用逐漸成為天然藥物的研究重點［25］。與常春藤皂苷元類似的是，盡管β-谷甾醇能夠作用于多種腫瘤細胞，發揮抑制腫瘤細胞增殖或誘導其凋亡的藥理作用［26］，但在卵巢癌細胞中的作用尚未見報道，這將為我們日后的研究提供一些參考。

芒柄花黃素、常春藤皂苷元及β-谷甾醇分別與PPI網絡中排名前十的靶點進行分子對接后，活性成分與其對應靶點的結合能均小于-7.0 kcal/mol，說明以上活性成分與其對應靶點結合性良好。其中，PTGS 是上述三種活性成分的共同靶點，且其對接結合能均小于-9.0 kcal/mol，表明活性成分與PTGS2 之間具有較強的結合力。前列腺素內過氧化物合酶2（prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2），又稱環氧化酶2（cyclooxygenase-2，COX-2），是前列腺素生物合成的關鍵酶，兼有環氧化酶和過氧化物酶的作用。近年來，越來越多的研究顯示，COX-2 在人類多種腫瘤中呈異常表達，且能夠在腫瘤的發生、發展及腫瘤細胞對放化療的敏感性中發揮多方面的作用［27］。選擇性COX-2 抑制劑也被作為一種新型的抗癌藥得到了廣泛關注和研究［28］。研究表明，在卵巢癌患者中，COX-2 的表達顯著增多，且其高表達往往與卵巢癌的不良預后相關［29］。此外，COX-2能夠通過調節上皮間質轉化從而促進卵巢癌細胞遷移，同時增強了患者對順鉑的耐藥性［30］，而選擇性COX-2抑制劑塞來昔布能夠顯著降低由于COX-2高表達而引起的卵巢癌細胞遷移和耐藥性［31-32］，這說明COX-2 作為卵巢癌治療的潛在靶點，值得進一步探究。然而，COX-2 抑制劑在臨床使用中所帶來的心腦血管及消化系統損傷等副作用［33-34］亦不容忽略，因此，若能進一步闡明三棱-莪術及其活性成分這類天然成分對PTGS2 的作用，將對COX-2 抑制劑在腫瘤治療中的應用帶來一些新的參考。

在對關鍵基因進行KEGG 通路富集研究后，我們發現這些關鍵基因主要與神經退化信號通路、乙型肝炎、HIV-1 感染、凋亡信號通路、卡波濟肉瘤相關皰疹病毒感染、EB病毒感染、人巨細胞病毒感染、IL-17 信號通路、雌激素信號通路等信號轉導途徑具有較強的關聯。將這些相關通路進行聚類分析后發現，這些信號轉導途徑主要分為以下幾類：卵巢類固醇生成、甲狀腺激素信號通路、雌激素信號通路、白細胞介素17（interleukin 17，IL-17），信號通路、凋亡信號通路、乙肝及利什曼病。這說明三棱-莪術藥對在發揮對卵巢癌的輔助治療作用時，可能主要是通過上述信號轉導機制來實現的。IL-17 是主要由T 細胞的亞型Th17細胞分泌產生的炎癥相關性細胞因子。研究表明，無論是否是炎癥相關性腫瘤，炎癥因子均是抑制腫瘤炎性作用的重要介質，能夠促進腫瘤相關性炎性，使腫瘤細胞逃避免疫監控［35-36］。IL-17 是近年來備受關注的促炎細胞因子，在包括卵巢癌在內的多種惡性腫瘤中，均存在IL-17 的高表達［37-38］，因此，IL-17 及其介導的信號通路在卵巢癌的研究中逐漸受到廣泛關注。在本研究中，我們發現三棱-莪術藥對在卵巢癌的輔助治療中可能與IL-17信號通路密切相關，這一發現值得通過后續實驗研究進行更為深入的探究。

總而言之，卵巢癌的發生與發展往往涉及多靶點、多通路、多環節。臨床中，在使用靶向藥物治療時，逐漸發現了單靶點藥物的局限性，因此，多靶點的藥物治療成為研究者新的研究方向［39-40］?；诰W絡藥理學及分子對接技術，對三棱-莪術藥對在卵巢癌輔助治療中的作用機制的探討，充分體現了三棱-莪術所發揮的多成分、多靶點的作用特點，為后續進一步的研究提供了參考。