SRT1720對對乙酰氨基酚誘導小鼠急性肝損傷的保護作用及其機制

鄒巧玲，袁秋林，宋銀宏

1.三峽大學腫瘤微環境與免疫治療湖北省重點實驗室，湖北宜昌 443002；

2.三峽大學感染與炎癥損傷研究所，湖北宜昌 443002；3.三峽大學醫學院，湖北宜昌 443002

藥物性肝損傷（drug induced liver injury，DILI）是臨床常見的藥物不良反應之一，也是新藥撤市的主要原因［1］。藥物超劑量服用可能會在機體內激活嚴重的氧化應激反應，引起肝細胞凋亡／壞死，導致DILI，診斷治療不及時甚至會誘發急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）［2］。目前，關于藥物誘發肝損傷的機制尚未明確，由于個體差異較明顯且無劑量相關性，使其檢測和預測難度極大［3-4］。據報道，多數DILI患者預后較好，但藥物引起的ALF病死率較高［5］。

沉默信息調節因子2-相關酶1（silent information regulator 2-related enzymes 1，SIRT1）是Sirtuins 家族成員之一，其可通過對底物進行去乙?；?，參與機體多種生物學活動，如基因沉默、細胞壽命調節、細胞應激反應及代謝調節等［6］。多項研究表明，激活SIRT1在多種因素誘發的肝損傷中具有保護作用，如膽汁淤積性肝損傷、缺血再灌注性肝損傷、酒精性肝損傷、微生物敗血癥所致肝損傷等［7-10］。另有研究表明，內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）在藥物誘導細胞死亡過程中發揮重要作用［11］。但SIRT1 在藥物誘發肝損傷中的保護作用與抑制ERS信號通路的相關性尚未明確。SRT1720 是SIRT1 的特異性激活劑，其藥理作用遠高于白藜蘆醇［12］。對乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）是臨床誘發急性肝損傷的常見藥物，因此，本研究以APAP 誘導小鼠急性肝損傷模型為研究對象，探討SRT1720在APAP誘發小鼠急性肝損傷中的作用及其與ERS中的PERKeIF2α-CHOP 信號通路的相關性，以期為研發治療APAP誘發肝損傷的新藥提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1藥物 APAP和SRT1720購自美國Sigma-AIdrich公司。

1.2主要試劑 RNA 逆轉錄酶購自中國Toyobo 公司；丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）及門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程有限公司；HE 染液購自上海碧云天生物技術有限公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；鼠抗葡萄糖調節蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）、蛋白激酶樣內質網激酶（protein kinase RNA-like ER kinase，PERK）、真核翻譯起始因子2α（eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α）、轉錄激活因子4（activating transcription factor 4，ATF4）、C／EBP同源蛋白（C／EBP homologous protein，CHOP）、Caspase12和β-actin 單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司；HRP標記的羊抗鼠IgG、BCA 蛋白質測定試劑盒及超敏型化學發光底物試劑盒均購自美國Pierce公司。

1.3實驗動物 SPF 級C57BL／6J 小鼠，雄性，8 周齡，體質量18～20 g，購自三峽大學SPF 級動物實驗中心，動物質量合格證號為：42010200001613。本實驗對小鼠的所有處理均以科研為目的進行養殖和使用，且按照湖北三峽大學實驗動物管理委員會動物倫理相關規定進行［文件號為：SCXK（鄂）2017-0012］。

1.4動物分組及處理 將C57BL／6J小鼠隨機分為對照、APAP、SRT1720 和APAP + SRT1720 組，每組10只。SRT1720和APAP+SRT1720組小鼠經灌胃給予SRT1720（30 mg／kg體質量），對照和APAP組經灌胃給予等體積生理鹽水，均每天給藥1 次，連續給藥5 d；第6 天，APAP 和APAP + SRT1720 組小鼠分別經腹腔注射APAP（325 mg／kg 體質量），對照和SRT1720組小鼠經腹腔注射等體積生理鹽水。24 h 后，將小鼠麻醉，摘除眼球取外周全血，分離血清；隨后將小鼠斷頸處死，無菌取肝臟組織，取部分肝臟組織固定于4%多聚甲醛中，剩余肝臟組織置-80 ℃保存。

1.5血清中AST和ALT水平的檢測 采用ALT及AST檢測試劑盒檢測小鼠血清中AST和ALT水平。

1.6組織病理學觀察 將4%多聚甲醛固定過夜的小鼠肝組織經脫水、包埋、切片處理后，進行HE 染色，于顯微鏡下觀察小鼠肝組織的病理改變情況，并拍照。

1.7ERS信號通路相關分子基因mRNA轉錄水平的檢測 采用RT-qPCR法。根據GenBank中登錄的GRP-78、PERK、eIF2α、ATF4、CHOP、GAPDH基因序列（登錄號分別為：AK004578、AK003226、AK009934、AK003001、AK028120、AK002273），應用Primer-BLAST 軟件設計引物，引物序列見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。用Trizol試劑提取各組小鼠肝細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA，以其為模板進行PCR反應。PCR 反應條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40 個循環。以GAPDH為內參，采用2-△△CT法計算各基因mRNA的轉錄水平。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.8ERS信號通路相關分子蛋白相對表達水平的檢測采用Western blot 法。用RIPA 裂解液提取各組小鼠肝組織總蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白濃度。取0.2 g蛋白，經10%SDS-PAGE 分離后，轉移至PVDF 膜上，用5%脫脂牛奶于室溫封閉1 h；加入鼠抗GRP78、PERK、eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase12 和β-actin 單克隆抗體（均1∶2 000稀釋），4 ℃孵育過夜；TBST 洗滌3次，加入HRP標記的羊抗鼠IgG（1∶5 000稀釋），室溫孵育1 h；PBS洗滌3次，ECL法顯影。應用Image Pro Plus 6.0軟件分析條帶積分光密度（integral optical density，IOD）值，以β-actin 為內參蛋白，計算蛋白相對表達水平。

1.9統計學分析 應用GraphPad Prism 8.02 軟件進行統計學分析，所有數據均采用均值±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1血清中AST 和ALT 水平 與對照組比較，APAP組小鼠血清中ALT 和AST 水平均明顯上升（t分別為55.21 和34.29，P均＜0.01），SRT1720 組差異無統計學意義（t分別為2.78 和1.17，P＞0.05）；與APAP組比較，APAP + SRT1720 組小鼠血清中ALT 和AST水平均明顯降低（t分別為42.92和18.02，P均＜0.01）。見表2。表明SRT1720 可有效降低APAP 誘發急性肝損傷過程中轉氨酶的活性。

表2 SRT1720對APAP誘導肝損傷小鼠血清中ALT和AST水平的影響（IU／L，x±s，n=10）Tab. 2 Effect of SRT1720 on serum ALT and AST levels in APAP-induced liver injury mice（IU／L，x±s，n=10）

2.2組織病理學觀察 對照和SRT1720 組小鼠肝組織中肝細胞在中央靜脈周圍呈放射狀，排列整齊，肝小葉組織形態結構正常，未見明顯病理改變；APAP組小鼠肝組織中可見明顯大片狀肝細胞壞死，且肝小葉結構發生顯著改變，部分區域肝細胞發生腫脹變形較嚴重；APAP+SRT1720 組小鼠的肝細胞損傷程度則明顯減輕，發生腫脹變形的細胞也顯著減少。見圖1。

圖1 各組小鼠肝組織的病理變化情況（HE，×100）Fig. 1 Pathological changes of liver tissues of mice in each group（HE staining，×100）

2.3ERS 信號通路相關分子基因mRNA 轉錄和蛋白相對表達水平 與對照組比較，APAP 組GRP78、PERK、eIF2α、ATF4和CHOP基因mRNA 轉錄及蛋白相對表達水平均明顯增高（t =9.85～33.89，P均＜0.05），SRT1720 組差異均無統計學意義（t= 0.10～2.95，P＞0.05）；與APAP 組比較，APAP + SRT1720組GRP78、PERK、eIF2α、ATF4、CHOP基因mRNA 轉錄和蛋白相對表達水平均明顯下降（t=6.19～22.43，P均＜0.05）。見圖2、表3 和表4。表明APAP 可誘發肝細胞中ERS 反應，SRT1720 可有效降低PERKeIF2α-CHOP 軸中各分子的轉錄及蛋白翻譯水平，抑制APAP誘發肝細胞中的ERS。

圖2 Western blot 法檢測各組小鼠肝組織中ERS 信號通路相關分子蛋白的表達Fig. 2 Western blotting of protein expression of ERS signaling pathway related molecules in liver tissues of mice in each group

表3 各組小鼠肝組織中ERS信號通路相關分子基因mRNA的轉錄水平（x±s，n=10）Tab.3 Gene mRNA transcription level of ERS signaling pathway related molecules in liver tissues of mice in each group（x±s，n=10）

表4 各組小鼠肝組織中ERS信號通路相關分子蛋白的相對表達水平（x±s，n=10）Tab. 4 Relative protein expression level of ERS signaling pathway related molecules in liver tissues of mice in each group（x ± s，n=10）

2.4ERS信號通路中Caspase12蛋白的相對表達水平對照、SRT1720、APAP、APAP+SRT1720 組小鼠肝組織中Caspase12 蛋白相對表達水平分別為（0.91 ±0.11）、（1.06±0.22）、（2.69±0.25）、（2.80±0.33）。與對照組比較，APAP 組小鼠肝組織中Caspase12 蛋白相對表達水平顯著升高（t= 11.78，P＜0.01），SRT1720 組差異無統計學意義（t=0.33，P＞0.05）；與APAP 組比較，APAP+SRT1720 組Caspase12 蛋白相對表達水平未發生明顯下降，差異無統計學意義（t=0.34，P＞0.05）。見圖3。

圖3 Western blot法檢測小鼠肝組織中Caspase12蛋白的表達Fig. 3 Western blotting of expression of Caspase12 protein in liver tissues of mice

3 討論

藥物引起的急性肝損傷是遺傳、非遺傳和環境因素相互作用的復雜結果，藥物過量引發的健康與安全問題是長期困擾臨床醫生的難題［13］。多項研究表明，除了藥物及其中間代謝產物的直接毒理作用外，其對肝細胞的損傷機制是多重因素、多條途徑共同作用的動態發展過程，如ERS信號、肝細胞凋亡和壞死、線粒體自噬等因素有關［14-16］。APAP 是臨床常用的解熱鎮痛藥物，有研究證明，細胞過度死亡是APAP 誘導肝損傷的核心機制［17］。除死亡受體途徑與線粒體死亡途徑外，ERS 反應是誘導細胞凋亡的另一重要途徑，該途徑在APAP誘發的肝損傷中具有重要作用。研究表明，過量APAP可導致內質網管腔的氧化還原位移，激活內質網依賴的信號轉導和細胞凋亡，減弱ERS 信號通路，可緩解APAP 引發的小鼠肝細胞損傷［18-19］。

內質網是真核生物維持細胞內環境穩態的重要膜細胞器，細胞內外多種不良刺激，如缺血、缺氧、各種病毒感染及鈣離子水平降低等均可引發細胞內質網內環境穩態失衡，誘發ERS，為維持內環境穩定，細胞會通過激活未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）減少蛋白質沉積［20］。當ERS 持續存在時，UPR 將啟動其分支PERK-eIF2α 通路，大量未折疊蛋白與GRP78結合，導致PERK 與GRP78解離，從而激活PERK 信號傳導通路。發生ERS 時，PERK自身發生磷酸化，激活eIF2α，促進ATF4的選擇性翻譯和表達，使ATF4 靶蛋白CHOP 表達增高，最終導致細胞調亡［21］。有研究證明，ERS 和UPR 信號途徑的激活是APAP 誘發肝毒性反應中的后期事件［18］，其中GRP78 表達上調可作為UPR 被激活的標志［22］。有研究發現，從細胞中敲除PERK基因或采用PERK-／-細胞，不能引起eIF2α 磷酸化，證明缺失PERK基因的細胞對ERS 呈高反應性［23］。CHOP 是ERS 反應過程中特異的促凋亡因子［24］，正常情況下幾乎不表達，其表達升高是發生ERS的標志，也是UPR激活PERKeIF2α軸的后期事件［25］。因此，抑制ERS可降低細胞凋亡，從而達到保護肝細胞的作用。研究表明，SIRT1可抑制ERS 反應的PERK-eIF2α-CHOP 軸，改善體內心力衰竭的發展［26］；在生長板軟骨形成和縱向骨生長中也發揮重要作用［27］。

ALT 及AST 是反應肝功能最特異、敏感的指標，檢測小鼠血清中ALT 和AST 水平可有效評估肝細胞損傷的程度。本研究結果顯示，大劑量APAP可引發小鼠肝小葉大片的肝細胞凋亡／壞死，并導致小鼠血清中ALT及AST水平明顯升高（P＜0.05），同時可明顯提高GRP78、PERK、eIF2α、ATF4、CHOP基因mRNA轉錄和蛋白相對表達水平（P＜0.05）；經SRT1720處理后，可顯著降低小鼠血清中的ALT 及AST 水平（P＜0.05），并減輕小鼠肝組織中肝細胞的壞死／凋亡程度。為闡明SRT1720 在APAP 誘發小鼠肝損傷中的保護機制與ERS 信號通路的相關性，本實驗采用RT-qPCR 和Western blot 法檢測各組小鼠肝細胞中ERS 信號通路PERK-eIF2α-CHOP 軸中GRP78、PERK、eIF2α、ATF4、CHOP基因mRNA轉錄和蛋白相對表達水平，結果顯示，SRT1720可明顯抑制PERK、GRP78、eIF2α、ATF4和CHOP基因mRNA 轉錄和蛋白翻譯水平（P＜0.05）。上述結果表明，PERK-eIF2α-ATF4-CHOP 通路參與了APAP 誘導的毒性反應，而SRT1720 對APAP 誘導小鼠肝損傷的保護作用部分機制是通過抑制PERK-eIF2α-CHOP信號通路，減少CHOP 促凋亡蛋白的表達水平實現的。Caspase12是發生ERS 信號反應中特有的凋亡蛋白，其僅與ERS 信號反應誘導的細胞凋亡相關，在外源性死亡受體通路和內源性線粒體凋亡通路中不被活化，ERS 的持續能夠激活Caspase12，活化的Caspase12可激活后續一系列的效應Caspases，進而引起細胞凋亡［28］。本研究結果表明，SRT1720 未能顯著降低其蛋白表達水平（P＞0.05），推測其可能通過降低其他Caspase 蛋白的表達影響Caspase 凋亡級聯反應，該推測仍需深入研究。PERK-eIF2α-CHOP 信號通路介導的細胞凋亡在多種物質誘導肝損傷中發揮著作用［29-30］，本研究結果表明，SIRT1 激活劑SRT1720 對APAP 所致的肝毒性的保護機制可能是通過抑制APAP 毒性代謝產物激活ERS 中的PERKeIF2α-CHOP 信號通道相關分子的轉錄和翻譯，從而保護肝細胞。

綜上所述，SRT1720 可能是改善APAP 誘導肝細胞凋亡／壞死的有效藥物，激活SIRT1 抑制ERS可能成為治療APAP 誘發肝損傷的一種有效的新方法。