重組腺病毒5型-諾如病毒GⅡ.4型-VP1病毒樣顆粒的表達及鑒定

汪夢俊，孫楠，裴捷，劉睿倫，鄒文琪，熊宇，王文輝，于代冠，申碩

武漢生物制品研究所有限責任公司病毒性疫苗研究一室，湖北武漢 430207

諾如病毒（Norovirus，NoV）為杯狀病毒科（Caliciviridae family）諾如病毒屬（Norovirusgenus）的單股正鏈RNA 病毒［1］，根據其編碼主要衣殼蛋白VP1 的開放閱讀框2（open reading frame 2，ORF2）基因序列的差異可將其分為GⅠ～GⅦ7個基因型［2-3］。GⅠ、GⅡ、GⅣ基因型在人群中具有較強的傳播能力，感染人體后可引起腹瀉、嘔吐等癥狀，是全球范圍引起急性腸胃炎的主要病原體之一［4-6］，目前，GⅡ.4 基因型是優勢流行株［7-9］。針對NoV 的疫苗主要包括重組病毒樣顆粒（virus-like particle，VLP）疫苗、P 蛋白顆粒疫苗及腺病毒載體疫苗等［10-12］。其中表達NoV VP1 的腺病毒載體疫苗可誘導強烈的體液和細胞免疫反應，是具有較大潛力的候選NoV 疫苗之一［13-15］。NoV VLP 是由NoV 主要結構蛋白VP1 通過自主裝配而成［16］。VP1的相對分子質量約為58 900，包括S和P 2 個結構域，S 結構域由其前端225 個氨基酸組成，對二十面體的形成至關重要［17］；P 結構域可進一步分為P1 和P2 兩個結構域，P1 主要負責VP1 二聚體的形成，P2 負責顆粒與細胞受體的結合［18］，含有主要的中和抗原表位。有研究表明，VP1 通過90 個二聚體分子，共180 個亞基形成1 個直徑約40 nm 的二十面體VLP［19］，其形態及免疫原性與具有傳染性的病毒類似［20］。

本研究基于E1 缺陷的腺病毒Ad5，利用Recombineering 技術［21-22］，將GⅡ.4 基因型NoV 主要結構蛋白VP1基因的ORF2 插入至Ad5 原基因組的E1 部位，獲得復制缺陷型的重組腺病毒載體pAd5-NoVGⅡ.4-VP1，感染293T細胞后獲得含有NoVVP1基因的重組病毒rAd5-NoV-GⅡ.4-VP1，采用氯化銫密度梯度離心法純化VP1 組裝的VLP，并進行鑒定，以期為研發安全高效基于腺病毒載體Ad5 的口服黏膜免疫NoV疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1菌株、質粒及細胞E.coliDY380、重組質粒pAd5-eGFP、pAd5-NoV-GⅡ.4-VP1-1-6和pAd5-NoV-GⅡ.4-VP1-3-6 均由武漢生物制品研究所有限責任公司病毒性疫苗研究一室保存；239T 細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2樣本 14 份唾液標本（編號1～14）源自武漢生物制品研究所有限責任公司的志愿者。志愿者于采集樣本前5 min 漱口，吐去一部分唾液，采集未經刺激的唾液5～10 mL，置干凈的試管內，于100 ℃煮沸10 min，11 000×g離心5 min，取透明上清，于-80 ℃保存。

1.3主要試劑 兔抗NoV-GⅡ.4-VP1 血清及A、B 液均由武漢生物制品研究所有限責任公司病毒性疫苗研究一室制備；2×Phanta Max Master Mix（Dye Plus）購自南京諾唯贊生物科技有限公司；多聚賴氨酸購自北京碧云天生物技術有限公司；IPTG和X-gal溶液購自生工生物工程（上海）股份有限公司；限制性內切酶PacⅠ購自美國NEB公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司；DMEM 培養基、PageRuler Plus 預染蛋白marker（26619）及LipofectamineTM2000 均購自美國Thermo Fisher 公司；4 × Laemmli Sample Buffer 購自美國BIO-RAD 公司；HRP 標記的羊抗兔IgG購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.4rAd5的拯救

1.4.1rAd5-eGFP 將20 μg 質粒pAd5-eGFP進行PacⅠ單酶切，經NaCl沉淀法沉淀、風干后，得到線性化質粒，用10μL opti-MEM溶解，在LipofectamineTM2000的介導下轉染293T 細胞，轉染6 h；更換含1%胎牛血清的DMEM維持液，于37 ℃，5%CO2細胞培養箱中培養10 d，-20 ℃反復凍融3次后，6 500×g離心5 min，收集上清，標記為P0 代rAd5-eGFP，于293T 細胞上連續傳3 代，各代細胞均于37 ℃培養48 h，收獲病毒液，分別記為P1、P2、P3。熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況。

1.4.2rAd5-NoV-GⅡ.4-VP1 將重組質粒pAd5-NoVGⅡ.4-VP1-1-6 和pAd5-NoV-GⅡ.4-VP1-3-6 經PacⅠ單酶切后，按1.4.1 項方法轉染293T 細胞，獲得P0代rAd5-NoV-GⅡ.4-VP1-1-6和rAd5-NoV-GⅡ.4-VP1-3-6，連續傳3 代，收獲病毒液，分別記為P1、P2、P3。取各代病毒收獲液15 μL，經4% ～20% SDS-PAGE分離后，轉移至NC 膜，用含2% BSA 的PBST 于37 ℃封閉1 h；加入兔抗NoV-GⅡ.4 血清（1∶5 000 稀釋），于37 ℃作用1 h；PBST洗滌5次，每次5 min，加入HRP標記的羊抗兔IgG（1∶10 000稀釋），37 ℃孵育45 min；PBST洗滌5次，每次5 min，ECL法顯色。

1.5rAd5-NoV-GⅡ.4-VP1的擴大表達 將2×108個293T細胞接種至10層細胞工廠中，用DMEM 培養基于37 ℃，5% CO2細胞培養箱中培養，待細胞融合度約達80%時，用滅菌PBS 洗滌3 次；將P3 代rAd5-NoV-GⅡ.4-VP1-3-6按MOI=0.01加至2 L的無血清DMEM維持液中，混勻，再接種至細胞工廠中；待細胞病變達80%時，置-80 ℃反復凍融3次，使細胞破碎。

1.6NoV-GⅡ.4-VLP的提取及純化 將凍融破碎后的病毒收獲液于10 000×g離心1 h；取上清，經100 Kd膜濃縮，采用25%（w／v）蔗糖墊底方式進行初步純化，于4 ℃，100 000×g離心3 h；取沉淀，PBS復溶后，用氯化銫（總密度為1.32 g／mL）進行密度梯度離心，于4 ℃，210 000×g離心20 h；根據蛋白濁光收集VLP（密度為1.313 1 g／mL）條帶和NoV-GⅡ.4-VP1（密度為1.344 9 g／mL）條帶，分別加至100 Kd Ultra-15超濾管中，加入6 mL GT101 buffer［5 mmol／L Tris，50 mmol／L NaCl，1 mmol／L MgCl2，6.8%（w／v）、0.005%PS-80］，于4 ℃，6 500×g離心30 min，棄流穿液，該步驟反復3 次，去除樣品中的氯化銫，即獲得NoV-GⅡ.4-VLP，按50μL／管分裝，于-80 ℃凍存。

1.7NoV-GⅡ.4-VLP的鑒定

1.7.1Western blot 檢測 Lowry 法檢測純化NoVGⅡ.4-VLP 的蛋白濃度，調節濃度為300 ng／μL，按1.4.2 項進行Western blot 檢測。分別以P3 代rAd5-NoV-GⅡ.4-VP1 及rAd5-eGFP 收獲液為陽性及陰性對照，同時設細胞對照（僅加入293T細胞）。

1.7.2ELISA 檢測 用0.05 mol／L 碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）按1∶1 000 的體積分數稀釋唾液樣本，加至96孔板，100μL／孔，每個樣品設3個平行孔，4 ℃包被過夜；用含1%BSA 的PBST 于37 ℃封閉1 h；加入2μg／mL的NoV-GⅡ.4-VLP，100μL／孔，同時以BSA為陰性對照，以NoV-GⅡ.4-VLP包被的孔為陽性對照，37 ℃孵育1 h；PBST洗滌5次，加入兔抗NoV-GⅡ.4-VP1血清（1∶5 000稀釋），37 ℃孵育1 h；PBST洗滌5次，加入HRP標記的羊抗兔IgG（1∶10 000稀釋），100μL／孔，37 ℃孵育1 h；PBST洗滌5 次，依次加入A 和B 液，各50μL／孔，37 ℃水浴15 min，加入2 mol／L H2SO4終止反應，用酶標儀檢測A450。

1.7.3電鏡觀察 將去除氯化銫后的NoV-GⅡ.4-VLP及NoV-GⅡ.4-VP1 稀釋至300 ng／μL，取20 μL，滴加至預先用0.3% formvar-氯仿鍍膜的銅網上，室溫孵育5 min；吸干樣品，滴加2%磷鎢酸染液，染色5 min；棄染液，用去離子水充分沖洗，干燥，置透射電鏡下觀察。

1.8數據采集及分析 應用GraphPad Prism 9軟件進行數據采集、分析及作圖。

2 結果

2.1rAd5的鑒定

2.1.1rAd5-eGFP 熒光顯微鏡下觀察，P1、P2、P3代rAd5-eGFP均可見綠色熒光，且亮度隨著代次的增加而增強，P0代未見綠色熒光，見圖1。表明在293T細胞中可成功拯救rAd5，且可正常表達插入的外源片段。

圖1 各代rAd5-eGFP的鏡下觀察（×100）Fig. 1 Microscopic observation of recombinant adenovirus rAd5-eGFP of various generations（×100）

2.1.2rAd5-NoV-GⅡ.4-VP1 rAd5-NoV-GⅡ.4-VP1-1-6 和rAd5-NoV-GⅡ.4-VP1-3-6 的P0、P1、P2、P3 代病毒收獲液中均可見NoV-GⅡ.4-VP1 蛋白表達，相對分子質量約58 900，大小與預期相符，見圖2。表明轉染拯救獲得了具有感染性的病毒顆粒，均可正常表達VP1蛋白。

圖2 rAd5-NoV-GⅡ.4-VP1感染293T細胞后VP1的表達Fig.2 Expression of VP1 in 293T cells infected with recombinant adenovirus rAd5-NoV-GⅡ.4-VP1

2.2NoV-GⅡ.4-VLP的鑒定

2.2.1Western bot 檢測 NoV-GⅡ.4-VLP 及陽性對照均可與兔抗NoV-GⅡ.4-VP1 血清發生特異性結合，且于相對分子質量約58 900 處可見特異性結合條帶,陰性對照及細胞對照未見該結合條帶，見圖3。陰、陽性對照及細胞對照于相對分子質量約70 000處可見1 條較淺色條帶，可能是由于細胞培養基中添加胎牛血清導致的。

圖3 rAd5-NoV-GⅡ.4-VLP的Western blot鑒定Fig.3 Western blotting of rAd5-NoV-GⅡ.4-VLP

2.2.2ELISA檢測 14份唾液樣本與陽性對照A450高于陰性對照，見圖4。表明制備的NoV-GⅡ.4-VLP具有與天然的NoV 病毒顆粒相似構象，能有效識別唾液樣本中的NoV 受體，即組織血型抗原（histo-blood group antigens，HBGA），可用于NoV VLP 疫苗的相關研究。

圖4 rAd5-NoV-GⅡ.4-VLP與NoV受體的結合能力Fig.4 Binding ability of rAd5-NoV-GⅡ.4-VLP to NoV receptors

2.2.3電鏡觀察 NoV-GⅡ.4-VLP形態完整，呈球狀，直徑為43.5～58.3 nm，平均直徑為（50.6±4.63）nm，顆粒表面有少數突起，可能為VP1 自組裝時暴露于顆粒表面的P結構域。NoV-GⅡ.4-VP1直徑為（84.5±5.35）nm，形態較為完整。見圖5。

圖5 NoV-GⅡ.4-VLP形態的鏡下觀察（標尺：100 nm）Fig.5 ElectronmicroscopicobservationforrAd5-NoV-GⅡ.4-VLP（scale：100 nm）

3 討 論

阻礙NoV 疫苗研發的主要因素包括缺乏經濟有效的人類NoV體外細胞培養方法及動物保護模型［10］，因此，傳統的滅活疫苗或減毒活疫苗策略不適用于NoV 疫苗的研發。目前，NoV 疫苗的研發策略主要包括VLP、P 顆粒及重組腺病毒載體疫苗等［23］。以流感病毒HA 為抗原重組腺病毒載體口服黏膜免疫疫苗已進入臨床試驗階段［24］，表明以NoV VP1 為抗原的重組腺病毒口服疫苗也具有較強的臨床研究潛能。

前期研究主要依賴昆蟲桿狀、大腸埃希菌、畢赤酵母等系統表達VLP，如采用昆蟲細胞表達NoV VP1 時，受體結合部位的氨基酸存在O-連接的糖基化修飾，表明糖基化可能對NoV VLP 的免疫原性存在一定影響［25］。而采用哺乳動物細胞系統表達NoV VLP 卻鮮有報道。本研究將質粒pAd5-NoV-GⅡ.4-VP1-1-6和pAd5-NoV-GⅡ.4-VP1-3-6轉染293T細胞，拯救獲得2 株帶有NoV-GⅡ.4-VP1基因的復制缺陷型rAd5-NoV-GⅡ.4-VP1，將二者轉染293T 細胞后，由于帶有CMV 啟動子的VP1基因在rAd 的基因組中，因此二者在細胞中均可表達NoV-GⅡ.4-VP1蛋白，VP1于293T細胞中以自組裝的方式形成相應的NoVGⅡ.4-VLP。本研究結果還表明，rAd5 表達的NoVGⅡ.4-VLP 能與NoV 的HBGA受體相互作用，可用于NoV疫苗體外效力的評價。電鏡觀察結果表明，拯救得到的復制缺陷型腺病毒NoV-GⅡ.4-VP1顆粒直徑為（84.5±5.35）nm，NoV-GⅡ.4-VLP 直徑為（50.6±4.63）nm，有別于大腸埃希菌、酵母或昆蟲細胞系統所表達的NoV VLP［19］，可能是由于哺乳動物細胞表達系統所進行的糖基化修飾有別有酵母及昆蟲表達系統，修飾后的VP1 蛋白在自組裝過程中改變了病毒顆粒的形態。。

綜上所述，本研究獲得的NoV-GⅡ.4-VLP 具有正確的顆粒構象、形態完整，且與NoV HBGA 受體的結合能力較高，為后續NoV 腺病毒載體口服黏膜免疫疫苗的研發奠定了基礎。