殼聚糖及季銨化殼聚糖作為疫苗佐劑的研究進展

馬淑敏，項婷婷 綜述，沃恩康 審校

杭州醫學院檢驗醫學院生物工程學院，浙江杭州 310013

近年來，預防性疫苗接種對于應對各種流行性傳染病發揮了巨大作用。疫苗已從減毒活疫苗或滅活疫苗發展到亞單位疫苗。傳統疫苗的抗原物質被抗原提呈細胞處理后可引起免疫應答，但會出現一些副反應。亞單位疫苗通常只含有1 種或多種抗原成分，安全性大幅提高，但免疫原性較弱，因此需添加高效的佐劑［1］。目前最常用的疫苗佐劑為鋁鹽佐劑，研究顯示，鋁鹽佐劑能促進機體的Th2型反應［2］，不能誘導Th1 型免疫應答［3］，而Th1 型免疫應答對細菌和病毒等微生物感染的保護作用至關重要。其他佐劑如細胞因子佐劑，具有生產成本較高，注射部位易產生較嚴重毒副作用［4］，不能誘導黏膜免疫［5］等缺點。因此，研發新型疫苗佐劑十分必要。

殼聚糖是一種天然陽離子堿性多糖，是由氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖通過β-1，4-糖苷鍵連接而成的高分子化合物。其為甲殼類動物殼、真菌細胞壁和昆蟲的甲殼素在堿性條件下的脫乙?；a物［6］。殼聚糖生物降解性高、生物相容性好、黏附性強、無毒性，具有抑菌、抗癌等多種生理功能，但其溶解度受pH 條件的影響，只能在酸性條件下溶解，限制了其在生物醫學領域的應用［7］。通過對殼聚糖進行化學修飾，可不同程度地提高其溶解性，其中季銨化殼聚糖具有廣闊的應用前景。依據季銨鹽基團是否直接引入殼聚糖，可獲得季銨化殼聚糖，如N，N，N-三甲基殼聚糖（N，N，N-trimethyl chitosan，TMC）和羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖（hydroxypropyltrimethyl ammonium chloride chitosan，HACC）。在季銨化過程中，氨基和羥基中的H 被季銨鹽基因的其他基團部分取代獲得季銨化殼聚糖衍生物，如N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖（N-2-HACC）、2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖（2-hydroxypropyltrimethyl ammonium chloride chitosan，HTCC）、O-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖（O-2-HACC）等。由于季銨鹽基團具有較強的親水性，將季銨鹽基團引入殼聚糖分子鏈中，在一定程度上減弱了殼聚糖分子間的氫鍵，從而增加了殼聚糖衍生物的水溶性，有利于抗原加工和提呈，在疫苗研究領域備受關注。本文就殼聚糖及季銨化殼聚糖作為新型疫苗佐劑的應用前景及最新研究進展作一綜述。

1 影響殼聚糖及季銨化殼聚糖佐劑效應的因素

殼聚糖的佐劑效應與其攜帶的電荷、脫乙酰度、相對分子質量等因素相關，且這些參數對殼聚糖的黏附性、溶解性等生物學效應均有影響［8］。脫乙酰度越高，分子鏈上的游離氨基越多，在酸中的溶解性就越好，正電荷量增加。由于細胞表面帶有負電荷，二者會產生靜電吸引，使其黏附能力增強。有研究表明［9］，中間水平脫乙酰度的殼聚糖能與DNA 藥物結合緊密，保護其免于核酸酶降解，形成高穩定性的體內遞送復合物。而相對分子質量對于殼聚糖的溶解度及黏附性也有很大作用。相對分子質量越大，分子之間的纏繞程度越大，溶解度越小。一般來說，溶解性越好，誘導的細胞滲透程度越高，更有利于抗原的加工和提呈。有研究發現，與殼聚糖相比，相同相對分子質量的季銨化殼聚糖促進NO 生成方面更加有效，表明季銨鹽基團的引入改善了殼聚糖的免疫刺激作用。此外，季銨化殼聚糖刺激產生的NO活性表現出相對分子質量依賴性趨勢，相對分子質量高的季銨化殼聚糖顯示出較低的NO活性［10］。因此，更強的黏附力在很大程度上需要更高的脫乙酰度和相對分子質量［11］，二者之間具有協同效應。同時，季銨化殼聚糖的季銨化程度（degree of quaternization，DQ）對其佐劑效應也有影響。有研究使用不同DQ（12%～59%）的TMC 探討DQ 對吸收程度的影響，結果表明，TMC滲透率增強的效果取決于DQ，所有TMC在pH 6.20 時鼻黏膜吸收均增強，DQ 越高，吸收增強越好［12］。QINNA 等［13］發現，41%DQ 和60%DQ 的HACC 水凝膠可顯著激活免疫反應。此外，DQ 約為40%的TMC 誘導產生的IgG 和IgA 抗體滴度約為20%DQ 的5.25 倍，其具有鼻腔疫苗佐劑的潛力［14］。因此，具有較好佐劑效應的殼聚糖應選擇合適的脫乙酰度、季銨化等參數比例。

2 殼聚糖及季銨化殼聚糖作為佐劑的主要類型

2.1納米顆粒 納米顆粒作為疫苗佐劑給藥系統有很大優勢，具有表面活性中心多、反應活性高、吸附和催化能力強等特點［15］。殼聚糖納米顆粒的表面具有大量的親水離子基團，可延長納米顆粒在體內的滯留時間，實現緩釋和靶向作用［16］。研究發現，利用殼聚糖包封滅活的H1N2 亞型流感病毒形成納米顆粒，包封率為76%，具有比常規疫苗更長的免疫持續時間，經鼻內免疫豬后，可誘導黏膜和全身免疫反應，IgA 抗體水平與接種可溶性滅活病毒蛋白的豬相比，高5 倍，對其他亞型病毒攻擊也有免疫保護作用［17］。雖然殼聚糖存在水溶性較差、不穩定等缺點，但其衍生物季銨化殼聚糖的溶解不受pH 限制，且保留了殼聚糖的優異性能。FARHADIAN 等［18］利用聚合物羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯與TMC 制備納米顆粒，評估納米顆?？诜笠倚透窝妆砻婵乖尼尫偶捌渖锘钚?，結果表明，TMC納米顆粒在酸性環境中穩定，可保護乙型肝炎表面抗原免受胃酸破壞。同時，基于殼聚糖納米顆?？赏ㄟ^被動、主動、刺激響應給藥的方法提高其靶向性［19］，控制藥物緩慢釋放，提高藥效，給腫瘤藥物靶向治療帶來了希望。

2.2水凝膠 水凝膠是由水溶性單體通過物理或化學方法進行自交聯形成的高含水量三維網絡結構凝膠，能提供各種治療藥物的持續局部遞送［20］。水凝膠藥物傳遞系統可很好地延長藥物滯留時間及增強藥物穿透性。有研究表明，將H5N1禽流感病毒的血凝素（hemagglutinin，HA）蛋白與HTCC 水凝膠按照體積比3∶7結合，通過鼻黏膜免疫BALB／c小鼠后，HTCC水凝膠可攜帶HA在鼻腔中停留6 h，同時還可促進黏膜IgA 免疫，誘導全身體液免疫，增加IgG1和IgG2a 滴度，而單獨的HA 約在2 h 內被迅速清除［21］。因此，殼聚糖水凝膠的遞送系統可局部傳遞抗原，提高免疫效率，誘導黏膜免疫。

3 殼聚糖及季銨化殼聚糖作為佐劑在體液免疫和細胞免疫中的作用

3.1殼聚糖激活體液免疫和細胞免疫 在機體免疫反應中，CD4+T 輔助細胞依據產生的細胞因子分化為Th1 和Th2 細胞，且Th1 細胞在抗胞內病毒、細菌及寄生蟲等感染中發揮重要作用［22］。研究發現，用N-2-HACC 納米顆粒包裹滅活的豬細小病毒對母豬進行肌內注射后，血清抗體滴度在6 周后緩慢增加，且免疫后14 周仍維持在高水平，表明N-2-HACC 可激活免疫應答并長期維持較高的抗體水平［23］。同樣，PANDEY 等［24］采用離子凝膠法制備殼聚糖納米顆粒，并將結核分枝桿菌的培養濾液蛋白包裹在內，評估腹腔注射納米顆粒封裝的抗原蛋白對抗結核分枝桿菌氣溶膠感染的功效，結果顯示，與對照組相比，納米顆粒免疫的小鼠菌落數量減少95%，表明納米顆粒具有較好的抗感染作用。有研究證明，HACC和硫酸化殼聚糖用作滅活新城疫疫苗的佐劑，可誘導SPF 級實驗雞產生體液免疫和細胞免疫［25］。進一步證明殼聚糖及其衍生物是一種較強的免疫應答刺激物。

干擾素基因刺激蛋白（stimulator of interferon genes，STING）是細胞內DNA 的傳感器，可觸發Ⅰ型IFN 的產生。環磷酸鳥苷-腺苷酸合成酶（cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase，cGAS）可參與合成環二核苷酸，其為STING 的活化配體。殼聚糖通過激活cGAS-STING 通路促進細胞免疫。其可通過誘導線粒體損傷，產生活性氧和內源性DNA 的釋放，STING 被cGAS 與DNA 結合后激活，與TANK 結合激酶-1（TANK-binding kinase-1，TBK-1）結合，最終分別導致核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NFκB）和干擾素調節因子-3（interferon regulatory factor-3，IRF-3）的激活，從而促進Th1 反應和細胞免疫的產生［26］。同時，NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）炎性小體也參與了殼聚糖誘導的Th1反應［27］。

3.2殼聚糖激活樹突狀細胞和巨噬細胞成熟 樹突狀細胞能高效提呈抗原。其可通過其表面模式識別受體被激活，包括Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）［28］。殼聚糖可激活TLR4 后誘導樹突狀細胞成熟［29］。通過帶正電荷的HACC 和帶負電荷的N，O-羧甲基殼聚糖（N，O-carboxymethyl chitosan，NO-CMC）的靜電吸引，包裹卵清蛋白，制成納米顆粒，結果表明，相對分子質量為200 000 的NO-CMC-HACC 納米顆粒具有70.7%的抗原包封率，與空納米顆粒相比，NO-CMC-HACC 納米顆粒處理樹突狀細胞后，細胞因子表達和分泌量均提高2 ～4倍［30］。有研究用TMC分別包裹流感病毒HA2 蛋白和核蛋白制備納米顆粒，刺激原代人鼻內上皮細胞，檢測其免疫反應，證明納米顆?？烧T導細胞因子和趨化因子分泌，從而誘導人單核細胞來源的樹突狀細胞成熟［31］。TMC納米顆粒為流感疫苗佐劑的開發提供了思路。

巨噬細胞在動物體內參與非特異性免疫和特異性免疫，其主要功能是以固定細胞或游離細胞的形式對細胞殘片及病原體進行吞噬和消化，并激活淋巴細胞或其他免疫細胞，使其對病原體作出反應［32］。ZHANG 等［33］采用殼聚糖酶解法制備了殼寡糖，研究體內外免疫刺激反應及其介導機制，結果表明，殼寡糖顯著增強Raw264.7 巨噬細胞增殖，刺激促炎細胞因子NO 和TNF-α 分泌，且刺激作用是通過TLR4 介導的。同樣，HACC 對巨噬細胞也具有免疫刺激作用，導致TNF-α、IL-6 等促炎細胞因子的釋放。但其激活機制不同，HACC 主要通過JAK-STAT 信號通路和MAPK通路激活Raw264.7細胞［10］。

4 殼聚糖及季銨化殼聚糖作為佐劑在黏膜免疫中的作用

黏膜免疫系統是人體免疫系統中的重要組成部分，也是抵抗感染的第一道防線，可引起黏膜局部反應和全身免疫應答。對于呼吸道感染疾病來說，是一個有效的預防屏障。殼聚糖作為黏膜佐劑有很大潛力，與其具有黏附性以及使細胞緊密結合的蛋白發生結構改變，開放跨膜通道，“打開”細胞之間的緊密連接有關。有研究表明，殼聚糖的黏附性可使其在免疫部位的滯留時間延長，且在鼻腔中降解較慢，保證了給藥的殼聚糖不會被黏液纖毛運動清除［34］。此外，通過結腸癌細胞Caco-2 單分子層模型驗證了含卵清蛋白的殼聚糖納米顆?？伞按蜷_”上皮細胞之間緊密連接的能力［35］，同時也可增強抗原滲透性［36］。ZHANG 等［37］制備了包裹卵清蛋白的硫酸凝膠多糖-O-（2-羥基）丙基-3-三甲基氯化銨殼聚糖納米顆粒，對小鼠進行鼻內免疫，結果顯示，卵清蛋白易被上皮吸收，且誘導陰道灌洗液中sIgA 的分泌，表明納米顆?？梢疬h端黏膜的免疫應答，殼聚糖可能作為有效的黏膜佐劑。

相比傳統的疫苗接種途徑，通過黏膜途徑接種有很大優勢：在黏膜部位會產生額外的sIgA 抗體來保護機體；易給藥，同時減輕接種疫苗給兒童造成的恐懼［38］；針對免疫力低下的老年人，也保證了其安全性［31］。黏膜免疫最主要的途徑是鼻黏膜，其次是胃腸道。殼聚糖及其衍生物由于獨特的優勢作為黏膜佐劑被廣泛研究［39］。納米顆粒作為抗原遞送系統具有在局部淋巴結捕獲和保留抗原的能力，由于其攜帶正電荷，易被抗原提呈細胞識別并吞噬，從而產生體液免疫和細胞免疫反應，同時，將抗原配制成納米顆?？墒蛊涿馐芪改c道黏膜水解酶或低pH 的影響，從而有效解決了黏膜免疫過程中存在的障礙［40］。

有研究發現，以N-2-HACC和NO-CMC 納米顆粒為遞送載體的新城疫病毒DNA 疫苗經鼻內免疫雞后產生的IgG 和sIgA 抗體水平比免疫PBS 緩沖液陰性對照組的雞高4 倍，且刺激淋巴細胞增殖，誘發了較高水平的IL-2、IL-4和IFNγ［41］。HAHAM 等［42］以殼聚糖納米顆粒包裹HA2、M2emRNA 為核，HA2、M2e蛋白質為殼共同使用模擬流感病毒的結構，經鼻給藥檢測其保護性，結果顯示，該殼聚糖納米顆粒極易被抗原提呈細胞識別，并能有效穿透黏膜屏障到達黏膜相關淋巴組織，刺激機體產生局部黏膜免疫反應和細胞免疫反應。因此，殼聚糖是通過鼻腔給藥誘導黏膜免疫應答的有前景的佐劑。

5 小結及展望

殼聚糖具有價格低廉、生物相容性好、黏附性強、安全性高、緩釋等優點，可減少抗原用量，延緩抗原釋放，誘導黏膜免疫應答，是理想的黏膜佐劑。殼聚糖通過一些化學修飾與納米技術結合，增強其在疫苗佐劑中的應用。但殼聚糖及季銨化殼聚糖的相關研究目前多處于實驗室階段，一些關鍵問題尚待解決，如殼聚糖及季銨化殼聚糖在化學改性中如何確保批次間的一致性，如何確定納米顆粒和水凝膠兩種佐劑形式在制備過程中是否具有潛在毒性以及在臨床應用中的劑量，殼聚糖及季銨化殼聚糖在體內發揮局部和全身免疫反應的作用機制、轉運機制尚不明確。氣凝膠是由含高化學活性組分的化合物制備成凝膠，再采用一定的干燥方式使氣體取代凝膠中的液體而形成的一種納米級多孔固態材料，可作為藥物遞送系統，可增加載藥量和藥物的溶解度，控制釋放，且不會影響藥物生物活性，因此，其具有作為疫苗佐劑的潛質。隨著研究的深入，殼聚糖氣凝膠與蛋白質和多肽類物質的結合有望在疫苗佐劑方面提供新的應用可能性，殼聚糖及季銨化殼聚糖有望成為一種有發展潛力的新型免疫佐劑。