單克隆抗體治療炎性腸病耐藥的研究進展

顧家博，韋平 綜述，王俊，金黑鷹 審校

1.連云港市中醫院肛腸科，江蘇連云港 222004；

2.南京中醫藥大學第二臨床醫學院，江蘇南京 210029；

3.江蘇省第二中醫院肛腸科，江蘇南京 210017

炎性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是一種由免疫介導的復雜性炎性疾病，包括潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩?。–rohn′s disease，CD），其典型特征包括腸上皮屏障功能障礙、腸道生態失調及腸黏膜免疫反應失調等［1］。IBD 病因復雜、病程長、難以治愈、易復發，治療上以維持疾病緩解和預防復發為目標。目前治療方案的選擇建立在對病情全面評估的基礎上，主要根據疾病的活動程度、病變累及范圍、既往治療方案及腸外表現等［2］。

隨著對IBD 發生發展分子機制的深入研究，發現了許多相關的靶點分子，應用于對應靶點的單克隆抗體（簡稱單抗）已應用于臨床治療，英夫利昔單抗（infliximab）等新的生物制劑為IBD 的治療提供了新的方法，但仍有10% ～15%的患者對這些藥物產生原發性耐藥，且在成功誘導和維持治療后，約40%的患者會隨著時間的推移失去臨床應答［3］。雖然單抗產生耐藥的機制尚未完全了解，但可從腫瘤治療的相關研究中汲取經驗，發掘出導致治療耐藥的眾多分子機制。其耐藥機制可能涉及目標蛋白下游信號通路中體細胞突變，宿主相關因素如腸道微生物菌群的改變或繞過靶向通路的代替信號通路的激活等［4-5］，克服耐藥仍是一個嚴峻的挑戰。本文對英夫利昔等單抗治療IBD 耐藥作一綜述，以期了解其可能的機理，探索有效的治療和預防措施。

1 單抗治療IBD耐藥發生的原因

1.1依賴抗抗體（anti-drug antibodies，ADAs）的原因使用生物制劑治療疾病時，藥物的免疫原性是重要問題。當藥物引起免疫反應時，可通過中和藥物的活性、增加藥物的清除率對療效產生影響［6］?？鼓[瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）英夫利昔單抗一直是治療中度至重度IBD的主要藥物，在誘導和維持緩解臨床癥狀、降低手術率及發生相關并發癥風險上，療效明確［7-8］。但仍有30% ～40%的患者可能對該藥產生以原發性耐藥為主的臨床失應答，隨著治療的持續進行，有30%～40%的患者發生繼發性耐藥或不耐受而停用該藥［9］。免疫原性是停止使用英夫利昔等單抗的最重要原因之一。免疫原性會導致對治療的反應喪失，從而降低或消除治療效果［10］，多體現在藥物谷濃度（trough level，TL）過低或抗藥抗體的產生［11］。ADAs 可中和連接到蛋白質Fab片段的抗TNF藥物或僅結合抗TNF分子，促進免疫復合物的形成，這二者均導致抗TNF 藥物通過網狀內皮系統的清除率增加，會導致藥物藥代動力學改變并降低治療效果。

ADAs 可能是通過T 細胞途徑產生的［12］。單抗被抗原呈遞細胞內化及加工后，通過MHCⅡ類分子與T 細胞受體的同源相互作用，以抗原的形式呈現給T 細胞。因為這種方式激活后的細胞因子環境將產生多種免疫應答反應［13］。當T輔助細胞（T helper，Th）分化為Th1 或Th2 表型時，會產生ADAs，并在它們與B 細胞相互作用后，誘導分泌ADAs 的漿細胞增殖，從而產生ADAs。如輸注英夫利昔單抗后，可檢測到特異性Th2 細胞，這些細胞與英夫利昔單抗特異性ADA 的存在相關［14］。ADAs 的產生還可能與HLADQA1*05（rs2097432）基因的遺傳變異有關，出現耐藥及其他相關并發癥的風險是未出現變異患者的6倍［15］。

1.2不依賴ADAs的原因

維得利珠單抗（vedolizumab）在治療IBD 時，一部分ADAs 陽性患者TL 偏低導致治療效果欠佳停止用藥，一部分ADAs 陰性或ADAs 短暫存在、濃度較低的患者仍有的因療效欠佳停止治療，表明不產生ADAs 或ADAs 濃度不高同樣會產生耐藥，免疫原性并不是治療失敗，發生耐藥的原因。對不依賴ADAs 的單抗治療IBD 耐藥的機理，尚缺乏統一的認識，其耐藥的原因可能是淋巴細胞運輸不足導致的機械性失敗和藥代動力學差異導致的藥物濃度不足［16］。

目前針對治療IBD 的單抗，如英夫利昔單抗、阿達木單抗、維得利珠單抗及烏司奴單抗（ustekinumab）等，其耐藥機制尚不明確，借鑒常見的腫瘤耐藥機制［17］，將耐藥機制分為以下幾類。

1.2.1PRSS絲氨酸蛋白酶切割單克隆抗體 有研究表明［18］，一種絲氨酸蛋白酶PRSS在單抗治療中產生耐藥的重要作用，PRSS 的表達水平與細胞對西妥昔單抗的敏感性呈負相關。PRSS可在體內和體外切割所有的單抗，可抑制西妥昔單抗介導的PI3K／AKT和MEK／ERK 信號通路的傳導，同時修飾過的單抗可避免PRSS 介導的切割作用。在體外試驗中，聯合使用PRSS 抑制劑減少了對單抗的切割作用，抑制了腫瘤細胞的生長。該研究揭示了PRSS 降低了單抗的療效，最終導致了耐藥的發生。

1.2.2抑瘤素M（oncostatin M，OSM）介導炎性相關成纖維細胞（inflammatory associated fibroblasts，IAFs）和炎性單核細胞對TNF屏障進行補償 IBD患者的腸道組織內大量表達細胞因子OSM及其受體（OSMR），OSM 在治療前的高表達與抗TNF-α 單抗治療失敗密切相關［19］。有研究對耐藥性和敏感性患者的基因特征進行分析［20］，發現耐藥性特征基因IL13RA2、TNFRSF11B和IL11在IAFs、炎性單核細胞和DC2中高度富集，這3 個與耐藥相關的基因是IAFs 的標記物，且在其他細胞中幾乎不表達；而敏感性特征基因則在上皮細胞中高度富集。IAFs中最豐富的基因之一是OSMR，該受體是預測抗TNF-α 單抗耐藥的細胞因子，OSM 在炎性單核細胞和DC2 中富集，OSMR 在IAFs中富集。經實驗證實，IAFs在耐藥患者中富集。研究通過驗證OSM 激活了IAFs 的下游靶點，對TNF屏障進行補償，證實了TNF 與OSM 信號傳導間存在相關性，從而導致了耐藥。因此推測，抗TNF-α 單抗治療IBD 的耐藥機制與OSM 介導的IAFs 和炎性單核細胞有關。

1.2.3調節性T 細胞亞群或α1 整合素亞基在T 細胞中表達異常 α1整合素亞基介導了抗TNF 治療的耐藥。實驗通過對IBD 患者的腸道活檢組織檢查進行了單細胞RNA 測序，分析并結合了公開可用的免疫細胞蛋白質組學數據，發現導致耐藥的細胞類型與α1 整合素亞基在T 細胞中表達有關［21］。抑制α1 整合素亞基增強了英夫利昔單抗在免疫細胞中的細胞因子抑制作用，增強了IBD 患者對抗TNF 治療的臨床應答。

針對抗α4β7 整合素抗體維多利珠單抗（vedolizumab）耐藥的機制，近期有研究表明，其與β1+PI16+調節性T 細胞亞群的富集有關［22］。研究通過單細胞RNA 測序法確定了β1+PI16+調節性T 細胞亞群對維多利珠單抗的抵抗，通過體外試驗結合臨床上收集的治療前后IBD 患者結腸活檢組織，驗證了該細胞亞群是維多珠單抗與調節性T 細胞和效應性T 細胞結合的底物，且降低了與維多利珠單抗的結合，導致了耐藥。

1.2.4p53 通路突變阻斷凋亡信號通路 p53 通路的表達異?；蛲蛔兣c耐藥性有關［23］，包括順鉑、烷化劑（替莫唑胺）、蒽環類藥物（多柔比星）、抗代謝藥（吉西他濱）、抗雌激素（他莫昔芬）和表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）抑制劑（西妥昔單抗）等。研究表明，突變的p53通路增加與Nrf2 啟動子的結合而上調Nrf2，并激活NF-κB 信號通路導致Nrf2 表達增強［24］。在耐替莫唑胺的治療中［25］，突變的p53通路和O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）之間存在相關性，替莫唑胺通過烷基化鳥嘌呤殺死細胞，而MGMT 反過來修復烷基化。因此推測耐藥性可能與MGMT 高表達相關。突變的p53 通路誘導突變靶基因細胞周期蛋白依賴性激酶1（cyclin dependent kinase 1，CdK1）和有絲分裂特異性細胞周期蛋白-B1（cyclin B1，CCNB1）的表達，二者均參與有絲分裂和細胞增殖，導致吉西他濱的治療耐藥［26］。p53通路影響ERK和ERK介導的早期生長反應因子-1（early growth response-1，Egr-1）轉錄，反過來又增加了EGFR 的分泌，導致EGFR 信號傳導增強，從而使西妥昔單抗等EGFR抑制劑治療無效［27］。

1.2.5細胞自噬調控耐藥 細胞自噬是一種高度保守的細胞過程，細胞質材料被降解和回收以維持能量穩態。借鑒單抗在腫瘤治療中耐藥與自噬的關系，自噬可調節耐藥的進展［17］。細胞自噬表現出細胞保護功能時，自噬抑制劑的使用可增強生物制劑的敏感性，表明自噬可能在耐藥細胞中起到保護作用［28］；相反，自噬表達細胞毒性功能時，可誘導耐藥細胞的死亡。mTOR 通路是自噬的負調節因子，mTOR 的抑制劑通過抑制細胞自噬通路，誘導小鼠胚胎成纖維細胞NIH3T3、耐藥株LoVo／ADR 結腸癌細胞和順鉑耐藥宮頸癌細胞死亡，耐藥細胞缺乏凋亡能力或表現出凋亡抵抗時，誘導細胞自噬的藥物也可阻止耐藥的產生［29］。mTOR 復合體介導MAPK 和PI3K／AKT 信號通路導致腫瘤治療產生耐藥，如肺癌順鉑耐藥、乳腺癌PI3K 抑制劑耐藥和黑色素瘤TORC1 抑制劑耐藥，均受mTOR 復合體的影響［30］。鑒于mTOR 為治療耐藥性的廣泛驅動因素，使腫瘤細胞對生物制劑產生耐藥性，同時抑制自噬的表達，在IBD 的治療中，可嘗試基于細胞自噬，尋找合適的自噬抑制方法，降低單抗的耐藥。

2 單抗治療IBD耐藥的監測

目前，耐藥的產生不可避免，確定并量化評估耐藥的指標，及時優化調整現有的治療放方案顯得尤為重要。目前尚缺乏針對耐藥敏感度和特異性均理想的預測手段，但在治療IBD 方面，可能存在相關預測因子，并可指導臨床治療方案的優化。研究表明，治療藥物的監測（therapeutic drug monitoring，TDM）、檢測藥物TL和ADAs的表達可能有益于針對抗TNFα治療失去臨床應答的患者［31］。藥物TL與臨床活動指數（clinical activity index，CAI）比值是預測治療結果的獨立因子，可能預測出對英夫利昔單抗治療失去臨床應答的發生［32］。使用阿達木單抗治療時，ADAs的產生和低藥物TL 是存在的，ADAs 陽性被確定為臨床失應答的預測因子［33］，但低藥物TL 對耐藥的產生是否是獨立影響因素并無統一的結論［34］，需要多中心、大樣本的數據支持。在使用烏司奴單抗治療時，血清藥物濃度與臨床緩解存在相關性，但其ADAs形成率很低，只有不足5%［35-36］，而有超過近4 成的患者仍存在臨床失應答，表明ADAs的產生可能不是產生耐藥的預測因子。治療IBD 的耐藥機制與OSM 介導的IAFs 和炎性單核細胞有關，那么OSM 也可是IBD的預測因子［37］。

有研究表明，糞便鈣衛蛋白是IBD 內鏡下活動情況的預測因子［38］。對疾病監測、生物治療療效、黏膜愈合及黏膜組織學愈合評估有意義。相比于傳統的炎癥標志物，糞便鈣衛蛋白具有高敏感性和高特異性，對潰瘍性結腸炎活動性預測準確率更高，總體內鏡下疾病活動性識別率高達近90%。鈣衛蛋白在糞便中分布相對均勻，抗酶降解，存活時間長，不受多次凍融循環的影響，且易于測量、價格低廉，被證明是腸道炎癥的有效標志物，可預測復發和臨床療效［39］。除了糞便鈣衛蛋白外，血清二肽基肽酶4 也被認為是IBD 疾病活動和預后的預測因子［40］。因此，預測指標的選擇，可使臨床醫生以預防的方式優化治療方案，從而避免疾病進展。

3 單抗治療IBD緩解耐藥的策略

失去臨床應答產生耐藥時，生物制劑不同的作用機制使更換新的藥物后，患者可重新獲得臨床緩解，新靶點的發掘也有利于新興生物制劑的研發。但由于初期高昂的治療費用，頻繁更換靶向藥物似乎不適用于大部分患者。產生耐藥時，可考慮增加劑量或縮短間隔時間，或添加、調整免疫抑制劑的選擇，以重新獲得臨床應答，避免停藥。一些學者建議在使用生物制劑的同時聯合使用免疫抑制劑，達到增加臨床療效，緩解耐藥的目的。已有研究表明，英夫利昔單抗與硫唑嘌呤（azathioprine，AZA）聯合應用是治療IBD 更優選的方案［41-42］。因為免疫抑制劑減少了針對抗TNF-α 藥物的抗體的形成，從而防止抗體降低或消除［43］。同時，免疫抑制劑的聯合使用可增加生物制劑治療的持久性。更重要的是，有明確證據表明，早期接受免疫抑制劑的患者在生物治療上停留的時間更長。潛在的原因除了減少ADAs的形成外，還可能增加了抗炎作用［44］。但同時，聯合使用免疫抑制劑會增加感染和患淋巴瘤等風險［45］，出于安全考慮，聯合療法的使用需要豐富的臨床經驗。

抑制自噬可預防耐藥并改善抗腫瘤治療療效［46］。自噬是真核生物進化過程中的一個保守過程，通過該過程，細胞質材料在溶酶體內被降解，在腫瘤發展的早期階段發揮保護作用，調節正常細胞中的致癌基因和分子，有證據表明，自噬能抑制腫瘤轉化［47］?；A研究和臨床試驗表明，抑制細胞自噬可提高抗腫瘤藥物的療效及腫瘤相關抗原的單抗有效性。擴大細胞自噬抑制劑的使用，如檢查點阻斷抗體和其他生長受體抑制劑，并聯合現有免疫治療藥物，為新的療法打開了前景。同樣是使用單抗治療時產生的耐藥，細胞自噬抑制劑的應用是否可抑制IBD 的發展，提高治療效果仍需進一步研究。

4 小結及展望

多年來，抗TNF-α單抗是唯一批準用于治療IBD的生物制劑。近幾年，也有針對α4β7 整合素的人源化單抗維多利珠單抗［48］及針對IL-12 和IL-23 的p40亞基的烏司奴單抗［49］用于臨床治療，在誘導和維持中重度潰瘍性結腸炎患者癥狀緩解上均有效。但在不斷擴大的新型靶向生物療法中，無論是抗TNF-α抗體、抗α4β7 整合素抗體或抗IL 抗體，原發性或繼發性耐藥問題均成為除臨床療效及安全性外最重要的關注點之一［50］。越來越多的基層醫院選擇生物制劑治療IBD，隨著生物制劑使用的普及，多中心、大樣本的臨床實驗會為更好地應用生物制劑治療IBD提供數據支持。