乳鐵蛋白在臨床領域應用的研究進展

馬小梅，彭喬烽 綜述，張海霞，馬忠仁 審校

1.西北民族大學生物醫學研究中心生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅蘭州 730030；

2.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州 730030

乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）是乳液中的一種重要活性物質，屬于轉鐵蛋白超家族，是一種相對分子質量約80 000，約由700個氨基酸組成的哺乳動物非血紅素陽離子蛋白，呈對稱雙葉結構，其獨特的結構主要用于控制鐵離子的結合和釋放。LF等電點（pI）約為8.5，在機體正常pH值下呈正電荷，使其能夠通過靜電作用包覆在脂質體上［1］。LF在生物體內分布極為廣泛，在免疫調節、抗菌、抗腫瘤、抗炎和抗氧化等方面發揮重要作用［2］。有文獻報道，LF 能夠刺激免疫系統抵抗致病性抗原的入侵及其損傷，同時也能防止因免疫系統紊亂而對宿主產生傷害［3］。本研究就LF 在免疫調節、抗腫瘤、調節發胖機制、抗菌、抗阿茲海默癥（Alzheimer disease，AD）及骨再生機制等方面的臨床作用的研究作一綜述，為后續LF 的臨床應用及研究提供方向。

1 LF的結構、功能及其分布

LF 呈對稱雙葉結構，即N 和C 葉，其中每個葉包括2個結構域（N1、N2和C1、C2）和1個鐵結合位點［4］。使用Swissmodel 對GenBank 中登錄的序列號為M8-3202.1（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／nuccore／M8-3202.1／）的人LF 全cDNA 進行三維結構分析，在包含非血紅素鐵結合位點的葉裂隙內，每個葉在CO32-輔助下能夠結合1 個Fe3+，同時可與Cu2+、Mn2+和Zn2+低親和力結合［5］。LF 對鐵離子親和力非常高，不同于血清轉鐵蛋白（transferrin，TF），TF 會在pH 5.5 時丟失鐵離子，而LF 在pH 3.5 時依然緊密結合鐵離子，正常生理條件下LF 對鐵離子結合常數為1 020，表明它們具有類似封存鐵離子的能力。同時，不同于TF的轉運，LF可掠奪微生物中的鐵離子［6］。

LF 具有很強的生物學活性，除了能夠結合和調節體內分泌物中的鐵離子外，同時具有抗癌、抗菌、抗病毒、抗氧化、參與免疫調節等諸多功能［7］。近年的研究顯示，LF 在嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）感染中具有藥物治療價值。LF 的研究與開發在醫藥學、生物制品學、飼料添加等領域具有重要的應用潛力［8］。

不同來源的LF 具有高度的同源性，但大部分由黏膜上皮細胞分泌產生［9］。在哺乳動物體液中，如乳液、眼淚、唾液和陰道分泌液中均有表達，其中乳液含量最豐富，人初乳中LF的濃度為1 ～8 g／L［10］。

2 LF的免疫調節作用

LF 由嗜酸性粒細胞、巨噬細胞和中性粒細胞對機體出現感染時作出反應而產生［11］?？偘准毎麛?／2以上的中性粒細胞均表達LF 并將其儲存在胞漿中的次級顆粒中，被激活的內皮細胞黏附中性粒細胞后，將中性粒細胞激活，隨后在血液中釋放LF，尤其在炎癥組織中，其濃度可升至200 mg／L（正常情況下約1 mg／L）［12］。研究發現，LF 可降低抑制細胞比例，增加巨噬細胞和樹突狀細胞比例，促進抑制細胞向巨噬細胞和樹突狀細胞分化，而LF 對T 細胞的增殖則無直接影響，表明LF 對免疫抑制功能的影響是通過抑制細胞介導的［13］。

LF 作為先天免疫的關鍵分子，在炎癥過程中起主要作用。LF 能增強細胞毒性免疫及阻斷一些致瘤性炎癥介質的受體，因此可作為標準抗癌療法的候選佐劑［14］。LF 已被證明可增強適應性免疫反應，并可作為一種有效的抗炎劑［15］。即使相關分子機制仍存在異議，但已有研究闡明，LF 可能通過調節糖蛋白的基因表達從而發揮其抗炎活性機制［16］。李欣等［17］研究發現，LF 可改善慢性壓迫性損傷（chronic constriction of sciatic nerve injury，CCI）模型大鼠的疼痛行為學表現，并通過下調炎性細胞因子IL-6和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平抑制炎性反應，從而發揮鎮痛作用。

犢牛經大腸埃希菌K99 攻毒后，在飼糧中添加LF，發現LF 具有促進腸道健康、降低腹瀉、提高抗氧化能力的作用［18］。ESMAEILI 等［19］將哈維弧菌感染黃鰭金槍魚，同時向飼料中添加一定量LF，發現投喂含LF 飼料的治療組，能改善黃鰭金槍魚的生長性能，提高其自身免疫能力及抗哈維弧菌活性，從而提高存活率。同時研究發現，黃鰭金槍魚血清總蛋白和總補體活性（CH50）與飼料中添加LF成正比。

3 LF的抗腫瘤機制

據報道，人乳鐵蛋白（human lactoferrin，hLF）可顯著增加自然殺傷（natural killer，NK）細胞介導的對乳腺癌和結腸癌細胞系的細胞毒性［20］。NK 細胞或靶細胞經hLF 預處理，可分別增強NK 細胞毒性及使靶細胞被裂解。同樣，在表達hLF 的宮頸癌鼠模型中，hLF 處理組腫瘤生長減緩與外周血中NK 細胞活性誘導及CD4+、CD8+T淋巴細胞增加有關［21］。經hLF 處理的小鼠血清中IFNγ、IL-2 和TNF-α 上調，血清IL-4和癌組織血管內皮生長因子下調［22］。體外重組人乳鐵蛋白TNF-α 介導的腫瘤增殖抑制與NF-κB 信號上調，以及促炎和促轉移細胞因子，包括IL-8、IL-6、粒細胞、巨噬細胞集落刺激因子和TNF-α下調有關［23］。

LF 通過抑制VEGFR2／VEGFA／PI3K／Akt／ERK1／2 通路有效抑制人結腸癌細胞HT29 腫瘤生長，且LF 的抗腫瘤活性對熱處理有溫度依賴性，LF單獨或聯合熱處理（50、70 ℃）可顯著抑制細胞增殖、遷移和侵襲，而熱處理（100 ℃）對上述參數無明顯影響［24］。ZHANG等［25］研究發現，鐵飽和型LF（Holo-LF）具有催化H2O2轉化為O2的能力，從而緩解腫瘤的缺氧微環境；光聲成像進一步證實了LF-Liposome-Dox納米復合材料存在時氧的大量生成。在此基礎上，以LF-Liposome-Dox 作為治療劑進行體內聯合化療，取得了良好的腫瘤治療效果。進一步研究發現，Holo-LF可誘導乳腺癌細胞系MDA-MB-23鐵下降，促進輻射對缺氧性MDA-MB-231 細胞的損傷，使MDA-MB-231細胞對放療敏感性增強［26］。

4 LF對發胖的調節機制

20 世紀90 年代早期，就有關于LF 對發胖發病機制影響的相關論述，VANDIJK 等［27］描述LF可影響乳糜微粒殘體的清除，也可通過乙?；豌~氧化的低密度脂蛋白［（low-density lipoprotein，LDL），濃度介于1.025 ～1.055 g／mL 之間］介導巨噬細胞中膽固醇積累。隨后研究表明，LF 影響膽汁酸的循環，結合脂蛋白受體刺激脂蛋白與脂肪分解［28］；在成熟脂肪細胞中，LF 影響蛋白激酶A 活性、激素敏感脂肪酶、脂滴包被蛋白和環AMP 敏感轉錄因子（REB-環AMP 反應元件結合蛋白）的磷酸化以及脂肪細胞中的脂肪分解和脂肪酸氧化效率［29］。

VASILYEV等［30］通過表面等離子體共振和ELISA技術得出由髓過氧化物酶修飾的低密度脂蛋白（myeloperoxidase-modified LDL，Mox-LDL）與LF 相互作用強烈，隨著LDL 氧化修飾程度的增加，Mox-LDL 對LF 的親和力增加，高濃度Mox-LDL 下，LF 可抑制巨噬細胞中膽固醇積累，由此證明LF 可作為抗動脈粥樣硬化藥物。研究表明，LF 抑制了脂肪生成酶中凋亡相關因子（recombinant factor related apoptosis，FAS）、固醇調節元件結合蛋白-1（sterol regulatory elementbinding proteins-1，SREBP-1）、乙酰CoA羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）蛋白的表達，上調了脂肪甘油三酯脂肪酶（adipose triacylglyceride lipase，ATGL）的表達從而減少脂肪生成，并增加了肝臟的脂肪分解速率以改善脂質代謝［31］。用LF 治療高脂飲食（high-fat diet，HFD）誘導的肥胖研究表明，LF可減輕肝臟脂質堆積，改善循環脂質狀況和調節葡萄糖攝入量的能力，提高p-AMPK／AMPK 值，從而調節細胞能量穩態，證實LF 可預防HFD 誘導的肥胖并改善脂質代謝［31-33］。

5 LF的抗菌機制

LF 具有的鐵清除能力使其直接參與抗菌和抗病毒防御的第一線，LF 能抑制甚至協助殺死多種微生物，具有明顯抗感染、抗氧化和抗炎癥效果［7］。LF的抗菌作用是由于LF水解后會釋放出Lfcin B（lactoferricin B），而Lfcin B 形成了兩親性的B 帶結構，并暴露正電荷，與細菌細胞膜結合。LF 與細菌脂多糖形成強復合物，在革蘭陰性菌外膜上形成1 個洞，從而殺死病原體。同時，LF 對鐵離子的螯合和結合阻斷了許多病原體生長和繁殖所需的鐵［34］。研究表明，LF、鐵和細菌之間的相互作用可能比最初想象的要復雜［35］。

BELLAMY 等［35］研究發現，通過豬胃蛋白酶水解牛乳鐵蛋白（bovine lactoferrin，bLF）產生了一種水解產物，該水解產物含有一種比完整蛋白質更具抗菌活性的陽離子肽，稱為牛乳鐵蛋白肽（bovine lactoferricin，bLfcin），其中基于bLfcin提出的殺菌活性可分為膜不穩定和由于其鐵螯合特性造成的環境鐵損耗兩種機制。bLF 由于具有兩親性N-末端結構域、高等電點、高陽離子凈電荷和脂多糖結合結構域等特性，使其能夠破壞細菌膜［36］。PADRAO 等［37］研究證實，bLF 能夠滲透無毒的細菌納米纖維素基質并執行其殺菌作用。

面對微生物威脅，中性粒細胞通過排泄胞外陷阱網（neutrophil extracellular traps，NETs）的方式來釋放抗菌素，這些陷阱網主要由一些抗菌劑組成，包括核染色質、組蛋白和LF 等抗菌蛋白［10］，其中無乳鏈球菌能誘導中性粒細胞排泄NETs，這些陷阱富含LF［38］。小鼠尿路感染（urinary tract infection，UTI）模型中，對其單次膀胱內注射hLF 可顯著降低膀胱細菌負載數和中性粒細胞浸潤，減少尿路致病性大腸埃希菌在上皮細胞的黏附，增強中性粒細胞的抗菌功能［39］。

6 LF對AD、帕金森病的臨床作用

LF 在人腦中的存在已被證實與衰老有關，特別是神經退行性疾病，如AD［40］。LF 在腦內少量表達，但可通過受體介導的胞吞作用以鐵結合或無鐵形式穿過血腦屏障，并協助納米顆粒藥物傳遞［41］。

LF 治療后的AD 患者體內氧化應激標志物水平顯著降低，這與研究認為的LF 通過清除NO、防止膜脂過氧化產物丙二醛（malondialdehyde，MDA）的積累、維持正常的谷胱甘肽含量從而抗氧化的作用相關［42］。唾液腺中的LF 在AD 診斷中具有較好的作用。唾液中的LF 可檢測出AD 的早期癥狀和患病情況，與額顳葉癡呆診斷標準相比，敏感性達87%以上，特異性達91%以上，這為AD 提供了一種新的非侵入性和成本效益高的生物標志物［43］。

利用含有腦靶向配體LF 并負載芍藥苷（paeoniflorin，PAE）的黑磷納米片（black phosphorus，BP）設計制備的能夠高效穿越血腦屏障的新型LF-BPPAE 給藥納米平臺表現出優異的近紅外響應電壓互感器（photothermal，PT）效果。在光熱效應激活LF-BPPAE 后，這些LF-BP-PAE 顆粒能夠穿透血腦屏障，具有良好的生物相容性和抗帕金森病治療效果，能夠有效地靶向治療帕金森?。?4］?；加休p度認知障礙和散發性AD 的患者唾液LF 水平降低，對攜帶人類AD基因突變的轉基因小鼠的唾液LF 調節和功能的研究可證實這種早期的影響。

7 LF對骨再生作用的機制

LF 可促進成骨細胞增殖分化，抑制破骨細胞形成［45］。INUBUSHI等［46］通過分析Smads和有絲分裂激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信號分子的表達，對小鼠顱骨進行離體器官培養，以評估bLF對骨再生的影響。結果表明，bLF通過激活Smad2／3 和p38 MAPK 促進間充質干細胞向成骨細胞分化，從而提高Runx2 的轉錄活性，證實bLF 是一種強有力的成骨因子。bLF 治療不僅加速了由成骨細胞增殖因子（osteoblast proliferation factor，OPF）介導的早期骨生長，還縮短了ORF 愈合過程中的重塑時間［47］。謝銀丹等［48］研究表明，LF 能夠促進骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的增殖，使BMSCs 向成骨方向分化，更好地促進新骨形成，且對三唑酮所誘導的BMSCs 損傷具有修復作用。通過胃蛋白酶消化LF，從水解物中鑒定出1種具有成骨活性的LFP-C肽段，該肽段可促進小鼠細胞系MC3T3-E1增殖，表明LFP-C 可促進成骨細胞的增殖和分化，這可能是LF 發揮成骨作用的主要作用區域［49］。LI等［50］的研究證明，與對照組相比，口服LF（500 mg／g）可使兔的骨再生性增強84%。然而，口服LF 通常需要大量給藥，并會導致副作用，如非預期的組織骨化［51］。

骨再生領域的研究提出，可通過物理和化學固定技術，在納米纖維的表面引入骨誘導分子，如成骨肽或蛋白質［52］；將固定有骨形態發生蛋白2（乳酸-羥基乙酸）的聚納米纖維移植至大鼠的缺損臨界股骨中時，與未修飾的纖維相比，其體內骨再生增強了2倍［53］。PAL 等［54］發現了1 種LF 模擬肽LP 2，由hLF N 葉N-末端的18 個殘基片段組成，比全長蛋白能夠更有效地促進成骨細胞分化以及骨保護素（抗破骨細胞生成因子）的成骨作用，其效果強于特立帕肽，證明LP 2是一種可通過全身給藥方式治療難以愈合的骨折的新型肽。

8 小結及展望

LF在免疫調節、抗腫瘤、抗菌、發胖發病、AD、骨再生等領域均具有重要作用，對研究各類疾病的發生、發展意義重大［3］。隨著對LF的深入研究，其功能機制逐漸清晰。LF 廣泛的生理功能與其對哺乳動物細胞上各種異質受體的活性有關［28］。研究證明，鐵結合的LF 可通過受體介導的信號通路，調節細胞因子穿透血腦屏障和腎小球基底膜的滲透，使LF 可在體內任何區域直接或間接（如修飾載體）作用于腫瘤［25］，使LF 在抑制腫瘤生長與輔助化療等方面發揮了重要作用。

目前雖有幾種抗菌抗炎藥可用于治療臨床感染，但對耐藥微生物（尤其是抗生素）的濫用和現有化合物療效有限性的擔憂日益加?。?4］。因此，急需尋找和開發更有效的藥物，從而克服耐藥性問題，也可在與其他治療方法結合時發揮協同作用［40］。由于可用的骨移植選擇的內在局限性，以及超過身體再生能力的骨缺損發生率不斷上升，尋找改進骨移植材料的需求強烈，LF 已被證實為一種成骨因子，其介導的促成骨應用極好地緩解了這種情況［54］。

LF 在免疫調節上的作用機制已經較為成熟，因此近年來其在腫瘤、AD 和骨再生的治療中發揮的作用越來越受到關注，并且是常用的抗癌藥物配體與運載介質。盡管LF 在抗菌、骨再生等方面的作用效果已經達到預期，可作為良好的抗感染和骨損傷治療藥物，但LF 在發胖發病上的作用機制尚需進行更深入的研究。