生物制劑工藝特異性殘留宿主蛋白ELISA檢測方法的建立及驗證

田易曉，王新月，竇向雅，韓翠翠，高珂，邵東燕，段蘇楊，白岳丘，趙雯，黃慶生

西北工業大學生命學院空間生物科學與生物技術重點實驗室，陜西西安 710072

采用重組DNA 技術制備的生物制劑是現代醫藥領域的重要產品之一，已成為制藥業中發展最快、活力最強和技術含量最高的領域［1］。隨著越來越多基因重組藥物的出現，宿主細胞蛋白（host cell protein，HCP）及宿主DNA 殘留問題也愈發引起人們的關注［2］。

用于重組表達的宿主細胞是包含數百至數千種HCP的復雜系統，極易對重組蛋白藥物造成污染［3-4］?；蚬こ讨亟M生物制劑中殘留的HCP 作為外源蛋白，構成了生物制劑生產工藝過程中相關雜質的主要組成部分［5-6］，是產品的關鍵質量屬性（critical quality attribute，CQA）。由于HCP 可能會引起不可預測的免疫反應［7-8］，相關法規要求對HCP 進行鑒定和定量［9-10］，并通過有效的下游工藝開發策略來解決該問題［11-14］，以保障用藥安全。國際人用藥品注冊技術協調會的生物藥品標準規格（ICH Q6B）指出［15］，對于HCP，通常使用較為靈敏的測定方法（如能夠檢測多種蛋白雜質的免疫測定），使用的多克隆抗體是通過用除去產物編碼基因的生產用細胞、融合伴侶或其他合適的細胞系制品進行免疫接種而獲得的。歐洲藥品管理局（European Medicines Agency，EMA）指南CPMP／BWP／382／97指出，對于HCP，無論產品和生產工藝如何，均必須定期檢測殘余HCP［16］，因此，要求對HCP進行例行監測，采用適當的方法測定HCP的去除水平，批次之間的結果應保持一致并符合規定。最終制品中HCP 允許量根據具體情況確定，通常為1 ～100 ng／mg。依據宿主和表達產品的不同，HCP的允許量為0.01%～0.1%。

靈敏度高、重復性好的宿主蛋白檢測方法不僅是保證生物制品安全有效的關鍵，也是生產過程控制和工藝優化的重要參數。目前，檢測HCP 的主要方法有ELISA、SDS-PAGE 銀染法、HPLC、毛細管電泳、質譜等［17-22］，這些方法均存在一定的優缺點，其中ELISA 法作為一種經典方法，由于其特異性好、靈敏度高、可定量及終點判斷客觀而被廣泛應用，《中國藥典》三部（2020 版）［23］收載的HCP 檢測均采用雙抗體夾心ELISA法［24-25］，此法可為生物制品生產工藝中HCP 殘留的控制提供依據，以評價生物制劑生產工藝降低或去除非目的成分的能力，是一種國際通用的生物制劑HCP 檢測方法。但商用HCP 試劑盒檢測結果只代表通用的HCP 含量和比例［26-27］，而每個項目均有其特異的HCP 比例，而且各蛋白對HCP的檢測干擾程度不同，因此建立專屬的HCP 檢測方法十分必要。本研究采用工藝特異性免疫學檢測方法，即按產品生產、純化工藝處理宿主細胞獲得工藝特異的HCP，并用于制備標準品和檢測抗體，這種采用相同工藝及表達體系的HCP作為免疫原制備獲得的抗體具有更好的特異性，更能精確反映出產品中的殘留蛋白。工藝特異性HCP免疫學檢測方法越來越受到重視［28］，這種方法理論上可提高檢測的靈敏性和特異性，但同時對整個生產條件的控制和工藝穩定性也提出了更高的要求。

1 材料與方法

1.1菌株、細胞及蛋白原液大腸埃希菌（ATCC35218）、酵母及CHO 細胞均由本實驗室保存；大腸埃希菌重組表達的胰高糖素樣肽（glucagon-like peptide，GLP）蛋白制劑原液由西北工業大學微生物與免疫實驗室制備。

1.2實驗動物 SPF 級新西蘭白兔（雌性，2 月齡，體質量為2.0 ～2.5 kg）和SPF 級昆明小鼠（雌性，5 ～6周齡，體質量為25 g）購自西安交通大學醫學部實驗動物中心，實驗動物使用許可證號：SYXK（陜）2020-005。本實驗均以科研為目的對實驗動物進行養殖和使用，且按照《國家實驗動物管理法規》（國務院令第676號）動物倫理相關規定進行。

1.3主要試劑及儀器 大腸埃希菌宿主蛋白殘留檢測試劑盒購自美國Cygnus technologies 公司；弗氏完全佐劑購自美國Sigma-Aldrich 有限公司；HRP 標記的山羊抗小鼠IgG（H+L）購自北京中杉金橋生物技術有限公司；TMB 底物溶液購自上海麥克林生化科技有限公司；ELISA 終止液購自北京索萊寶生物科技有限公司；一步法細菌／酵母／動物細胞活性蛋白提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；微量紫外分光光度計購自賽默飛世爾科技公司；多功能酶標儀購自美國Bio-Rad公司。

1.4溶液配制A液（0.06 mol／L NaAc）：取無水NaAc 0.492 2 g，加蒸餾水至100 mL；B液（0.06 mol／L HAc）：冰醋酸0.344 mL 加水至100 mL；0.06 mol／L 醋酸鹽緩沖液（pH 4.8）：取上述A 液59 mL，與B液41 mL混合，用5 mol／L NaOH調pH至4.8。

1.5工藝特異性大腸埃希菌殘留蛋白免疫血清的制備

1.5.2動物免疫 將空載大腸埃希菌截留液（不表達重組蛋白的標準大腸埃希菌按照表達重組蛋白大腸埃希菌培養和純化獲得的蛋白）用0.22 μm 濾膜過濾除菌，作為抗原，分別于第1、14、28、52 天免疫新西蘭白兔1 只：取1 mg 抗原+1.5 mL 弗式完全佐劑混合至油包水狀態，經背部皮下分4 點注射；分別于第1、14、30、65 天免疫昆明小鼠6 只：初次免疫每只0.08 mg 抗原+0.5 mL 弗式完全佐劑混合至油包水狀態，經背部皮下分2 點注射，后續免疫每只0.08 mg抗原+0.7 mL生理鹽水混勻，經腹腔注射。

1.5.3兔、鼠抗工藝特異性大腸埃希菌殘留蛋白免疫血清的純化 采用辛酸-硫酸銨沉淀法純化免疫血清IgG抗體。家兔耳緣靜脈采血，4 262×g離心10 min，取1份血清與2份0.06 mol／L醋酸鹽緩沖液（pH 4.8）混合，室溫攪拌下逐滴加入正辛酸33μL／mL 血清，室溫混合10 min，4 ℃靜置2 h，使其充分沉淀；4 ℃，9 590 ×g離心30 min，棄沉淀，上清經砂芯漏斗或125μm尼龍網過濾后，加入1／10體積的0.1 mol／L PBS（pH 7.4），用2 mol／L NaOH 調pH 至7.4，冰浴下于30 min 內加入0.277 g／mL 硫酸銨，使成45%飽和度，4 ℃靜置1 h以上；4 ℃，6 660×g離心30 min，棄上清，沉淀用適量0.1 mol／L PBS（pH 7.4）溶解，于50倍體積的上述PBS中4 ℃，4 500×g超濾20 min，得到兔抗殘留蛋白免疫血清。取少量樣品適當稀釋后，使用紫外分光光度計檢測蛋白含量，并進行12%SDS-PAGE 鑒定。6 只小鼠分別經眼球采血，合并后4 262×g離心10 min分離血清，取血清用生理鹽水按1∶1 000稀釋備用，得到鼠抗殘留蛋白免疫血清。

1.6大腸埃希菌殘留蛋白雙抗體夾心ELISA法的建立將上述得到的兔抗殘留蛋白免疫血清純化IgG 抗體包被酶標板，每孔5 μg（50 μg／mL），4 ℃包被過夜；用ELISA 洗滌液（1 mL Tween-20 加入1 000 mL 1×PBS 中,混勻）洗板，加入空載大腸埃希菌截留液標準品及待測樣品，37 ℃孵育50 min；洗板3 次，加入鼠抗殘留蛋白免疫血清（1∶1 000 稀釋），37 ℃孵育50 min；洗板3 次，加入HRP 標記的山羊抗小鼠IgG（H+L）（1∶40 000稀釋），37 ℃孵育50 min；洗板5 次，加入TMB 底物溶液顯色，37 ℃孵育10 min；加入ELISA終止液，于450 nm波長下測定吸光度值。

1.7標準曲線的繪制 將空載大腸埃希菌截留液標準品梯度稀釋（338 pg／mL ～5 280 ng／mL），以濃度（ng／mL）為橫坐標，A450值為縱坐標，利用四參數擬合繪制標準曲線，根據標準曲線計算待測樣品中大腸埃希菌殘留蛋白的含量。

1.8方法的驗證

1.8.1特異性 用一步法細菌／酵母／動物細胞活性蛋白提取試劑盒分別提取大腸埃希菌、酵母及CHO 細胞蛋白，采用建立的雙抗體夾心ELISA 法進行檢測，以5 000 和50 ng／mL 空載大腸埃希菌截留液標準品作為陽性對照，樣品稀釋液作為陰性對照。

本試驗過程中，小鼠各腸段腸黏膜SIgA呈現動態變化趨勢，前3周逐漸上升，但在第4周的時候出現了全群下降，之后又恢復上升趨勢，說明小鼠的免疫能力隨著年齡的增長逐漸發展和完善，第4周的全群變化可能與氣候突變導致應激所致。

1.8.2準確性 將大腸埃希菌重組表達的GLP 蛋白制劑原液分別與5、50 和100 ng／mL HCP 標準品等體積混合，作為低、中、高濃度樣品，采用建立的雙抗體夾心ELISA法重復測定3次，計算回收率及CV。

1.8.3檢測限 采用建立的雙抗體夾心ELISA 法平行測定10 份0 ng／mL 空載大腸埃希菌截留液標準品的A450，計算x±2SD，根據標準曲線計算得到相應的殘留蛋白含量，即為該方法的檢測限。

1.8.4精密性 將濃度為5、50 和100 ng／mL 的空載大腸埃希菌截留液標準品作為低、中、高濃度樣品，在1 次試驗內每個濃度平行檢測10 次，每份設3個復孔，計算測定結果的CV，驗證方法的試驗內精密性。由兩名實驗員分別對上述3 個濃度的樣品進行檢測，計算測定結果的CV，驗證不同人員的試驗間精密性。

1.9樣品測定 將大腸埃希菌重組表達的GLP 蛋白稀釋至1 mg／mL，同時采用建立的方法和市售大腸埃希菌宿主蛋白殘留檢測試劑盒測定殘留蛋白濃度。

1.10統計學分析 應用Graphpad prism 8.2.1軟件處理數據，采用t檢驗進行顯著性分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1工藝特異性大腸埃希菌殘留蛋白免疫血清的鑒定

2.1.1工藝特異性大腸埃希菌殘留蛋白的制備 空載大腸埃希菌按照表達GLP 肽大腸埃希菌工程菌株生產藥用GLP 相同的純化工藝流程，收集到了本工藝特異的HCP溶液，經5 K超濾濃縮后，獲得1 mg／mL的工藝特異性大腸埃希菌HCP 10 mL。

2.1.2兔抗工藝特異性大腸埃希菌殘留蛋白免疫血清的鑒定 經紫外分光光度計檢測蛋白含量，測得兔抗殘留蛋白IgG 抗體濃度為1.6 mg／mL；經12%SDS-PAGE分析，可見重鏈、輕鏈兩條條帶，相對分子質量分別約為50 000 和25 000，大小均與預期相符，見圖1。

圖1 兔抗殘留蛋白IgG抗體的SDS-PAGE鑒定Fig.1 Identification of rabbit anti residual protein IgG antibody by SDS-PAGE

2.2標準曲線 空載大腸埃希菌截留液的濃度在338 pg／mL ～5 280 ng／mL 范圍內，與A450值的四參數曲線呈良好擬合關系，擬合方程為：y=（A-D）／［1+（x／C）B］+D，其中A=0.928 39，B=-1.029 91，C=780.474 98，D=0.274 47，r2=0.998 46。見圖2。

圖2 標準品的擬合曲線Fig.2 Fitting curve of standard

2.3方法的驗證

2.3.1特異性 大腸埃希菌裂解蛋白、陽性對照和陰性對照A450的P／N 值均＞2.88，CHO 和酵母細胞裂解蛋白的A450值與陰性對照接近，無交叉反應，見表1。表明該方法專屬性良好。

表1 方法的特異性驗證結果Tab.1 Verification for specificity

2.3.2準確性 采用建立的方法測定低、中、高3 個濃度樣品的回收率分別為90.9%、93.5%和107.9%，均在80% ～120%范圍內；CV分別為7.3%、2.5%和5.7%，均小于15%，符合驗證要求。見表2。

表2 方法的準確性驗證結果Tab.2 Verification for accuracy

2.3.3檢測限 用建立的方法平行檢測10份0 ng／mL空載大腸埃希菌截留液標準品的A450值，根據標準曲線計算x± 2SD的A450值對應的殘留蛋白濃度為338 pg／mL，即為該方法的檢測限。已知濃度的工藝特異性殘留蛋白進行系列梯度稀釋后，本ELISA方法檢測的靈敏度可達338 pg／mL。

2.3.4精密性 采用建立的方法測定低、中、高濃度空載大腸埃希菌截留液標準品的試驗內CV分別為4.0%、4.7%和5.8%，試驗間CV分別為12.0%、8.5%和9.1%，見表3。表明該方法精密性良好。

表3 方法的精密性驗證結果Tab.3 Verification for precision

2.4樣品測定 大腸埃希菌重組表達的GLP 蛋白通過建立的ELISA法能檢出（17.11±0.96）ng／mL的殘留蛋白，而市售試劑盒只能檢出（6.58±0.18）ng／mL的殘留蛋白，二者差異有統計學意義（t=18.67，P＜0.000 1），約有62%的殘留蛋白未被市售非工藝特異性ELISA 試劑盒檢出，這些殘留蛋白應為本工藝特異的殘留蛋白。

3 討論

本研究以重組GLP 大腸埃希菌的發酵、提取、純化工藝為特定生產工藝，對空載大腸埃希菌（不表達GLP 的大腸埃希菌）進行模擬GLP 的提取純化過程，獲得工藝特異的HCP，并以其為免疫原，制備了特異性的抗HCP 多克隆抗體，建立了具有工藝特異性的大腸埃希菌殘留蛋白雙抗體夾心ELISA 法，為GLP多肽藥物的生產質控體系提供了特異、精確的HCP定量檢測方法。檢測結果表明，建立的ELISA 法可檢測到的HCP 最低濃度達338 pg／mL；針對同一GLP制劑樣品，分別采用非工藝特異性的市售ELISA 試劑盒和本研究建立的的工藝特異性ELISA 法進行殘留蛋白檢測，與工藝特異性ELISA 法所檢出的制劑中殘留蛋白總量相比，約有62%的殘留蛋白未被市售非工藝特異性ELISA 試劑盒檢出，這些殘留蛋白應為本工藝特異的殘留蛋白。建立的工藝特異的HCP檢測方法是近年來基因重組生物制劑質控體系中HCP 定標的新方法，其更具針對性，能更精確地反映出產品的HCP 殘留量。法國Pierre Fabre 免疫中心報道了一種基于ThresholdTM系統且工藝特異的檢測疫苗中大腸埃希菌HCP 的方法，該方法用不含目的基因的大腸埃希菌蛋白制備羊多克隆抗體，采用免疫印跡法檢測其產品生產過程中的HCP，獲得了良好的效果［31］。與HCP相關的風險通常通過下游工藝能力、殘留HCP水平、最大劑量、給藥途徑、給藥頻率、毒理學數據和臨床數據相結合進行評估。HCP 殘留是工藝穩定性監測的重要評價指標，是重組疫苗和藥物的重要質控指標，隨著生物技術的發展，HCP 檢測方法將得到進一步完善，并在生物制品檢測中發揮重要作用。