淫羊藿基于CCNB1 誘導免疫細胞浸潤在膀胱癌中的作用及機制研究

單雄威，羅涵文，古熾明，甘 澍

膀胱癌（bladder cancer，BCa）是泌尿系統最常見的惡性腫瘤之一。近年來我國膀胱癌發病率呈逐年上升趨勢，其中1998—2008 年間膀胱癌發病率年均增長率高達4.6%[1-2]。經尿道膀胱腫瘤電切術是治療非肌層浸潤性膀胱癌的主要方法，但術后5年復發率約為50%～70%[2]。抑制膀胱癌增殖復發是臨床中亟待解決的關鍵問題。

淫羊藿屬于小檗科植物，其主要有效成分為黃酮類化合物，包括淫羊藿素、淫羊藿苷和槲皮素等，具有廣泛的生物學活性，可通過調節細胞周期和促進細胞凋亡等生物學過程抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移[3-4]。研究發現淫羊藿素能有效抑制膀胱癌細胞T24 和BT5637 的增殖和克隆形成，并且這種抑制作用呈劑量和時間依賴性；且淫羊藿素還能抑制表柔比星誘導的細胞自噬，協同表柔比星抑制T24和BT7637 細胞增殖[5]。雖然，淫羊藿能有效抑制膀胱癌細胞增殖，但其有效成分及作用機制尚不明確。本研究通過網絡藥理學及生物信息學技術探究淫羊藿基于CCNB1 誘導CD8+T 細胞浸潤在膀胱癌中的作用及機制，為淫羊藿治療膀胱癌提供理論基礎和依據。

1 材料與方法

1.1 靶點篩選 首先，應用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP)[6]，按藥物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug likeness,DL）≥0.18 篩選淫羊藿的有效活性成分。并利用TCMSP 檢索藥物活性成分作用靶點，將檢索到的靶點導入UniProt（https://www.uniprot.org/）數據庫進行標準化匹配，并過濾未驗證的靶點。其次，從基因表達綜合數據庫（gene expression omnibus，GEO）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds）下載基因表達譜數據集GSE13507（正常組織9 例，腫瘤組織165例）和GSE37815（正常組織5 例，腫瘤組織18 例），利用R 語言limma 包篩選出差異表達基因（｜logFC｜≥1或P<0.05）。最后，利用R 語言（R version3.6.2）將藥物活性成分靶點與差異基因取交集，獲得藥物-疾病共同作用靶點。

1.2 UALCAN 數據庫 利用UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/）[7]結合癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數據庫分析CCNB1 表達與膀胱癌臨床及病理資料的相關性。

1.3 CCNB1 表達對膀胱癌預后的影響 利用TCGA 和GEO 數據庫中膀胱癌臨床信息，交互印證分析CCNB1 表達對膀胱癌患者預后的影響。

1.4 免疫浸潤相關性分析 利用TIMER（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）[8]分析膀胱癌中CCNB1表達與B 細胞、巨噬細胞及CD8+T 細胞等6 種免疫細胞浸潤的相關性。并進一步探究腫瘤免疫浸潤與患者預后的關系。

1.5 統計學分析 所有數據用均數±標準差表示，組間比較采用t 檢驗或Mann-Whitney U 檢驗，預后的影響因素采用Cox 回歸分析，P<0.05 差異有統計學意義。

2 結果

2.1 淫羊藿有效活性成分及靶點 應用TCMSP 對淫羊藿有效活性成分及藥物作用靶點進行篩選，共檢索到有效成分130 個，根據OB≥0.30 和DL≥0.18 共篩選出23 個有效成分。利用Perl 軟件和UniProt 數據庫對TCMSP 檢索到的23 個有效成分作用靶點進行標準化匹配和過濾，得到390 個藥物作用靶點，而作用靶點最多的有效成分為槲皮素（60）、木犀草素（33）和山柰酚（19）（表1），提示槲皮素、木犀草素和山柰酚可能是淫羊藿治療膀胱癌的關鍵有效成分。

表1 3 組患者一般資料比較

2.2 藥物疾病共同靶點 將藥物有效成分作用靶點與GSE13507 和GSE37815 差異基因取交集，得到11 個共同靶點（圖1 A），對應活性成分為槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin） 和山柰酚（kaempferol）等共8 種（表1），其中活性成分作用最多的靶點為GSK3B（4）和CCNB1（2），提示GSK3B 和CCNB1 可能是淫羊藿治療膀胱癌的關鍵作用靶點。

圖1 藥物- 疾病共同靶點及在膀胱癌組織中表達情況

2.3 靶點基因在膀胱癌中的差異表達情況及與預后的關系 使用TCGA 數據庫中膀胱癌RNAseq 數據分析11 個靶點基因在膀胱癌中配對表達情況，結果表明GSK3B、CCNB1、TOP2A、E2F2 和IGFBP3在膀胱癌組織中表達顯著高于正常組織。BCL2、CCL2、VCAM1、F3 和MAOB 在膀胱癌組織中表達顯著下調，差異均有統計學意義（P<0.05）。VEGFA在膀胱癌組織與正常組織中表達無統計學差異（P>0.05，見圖1 B）。

TCGA 膀胱癌數據預后分析結果顯示：VCAM1、F3、MAOB 及CCNB1 高表達患者總生存期（overall survival，OS）預后較差，其中CCNB1 高表達膀胱癌患者的OS、疾病特異性生存期（disease specific survival，DSS）及無進展間隔（progress free interval，PFI） 均較差（見圖2A-2L）。同時采用GSE13507 臨床數據再次印證CCNB1 高表達膀胱癌患者OS 及DSS 預后較差（見圖2M-2N）。上述結果表明CCNB1 在膀胱癌組織中表達情況與預后呈負相關。進一步采用ROC 曲線圖驗證CCNB1 在預測膀胱癌患者預后方面的診斷價值，結果顯示：CCNB1 在預測膀胱癌患者預后方面具有較好的診斷效能（AUC = 0.901，CI = 0.831～0.972，見圖2O）。

2.4 CCNB1 表達與膀胱癌患者臨床及病理因素的相關性 UALCAN 數據庫分析CCNB1 表達與種族、性別、年齡、體重、吸煙情況、腫瘤組織學類型、Stage 分期及淋巴結轉移的相關性，結果表明：除年齡21～40 歲亞組及Stage 1 期膀胱癌患者CCNB1表達與正常組織差異無統計學意義外，其余所有膀胱癌患者CCNB1 表達均高于正常組織（P＜0.05）。亞組分析結果顯示：白種人及非裔美國人膀胱癌患者CCNB1 表達兩者間無差異，但均高于亞洲人（P＜0.001），提示CCNB1 表達可能與種族相關。年齡亞組分析：41～60 歲亞組、61～80 歲亞組及81～100 歲亞組膀胱癌患者CCNB1 表達均高于21～40 歲亞組（P＜0.001），但三組間差異無統計學意義。組織學類型亞組分析：非乳頭狀膀胱癌患者CCNB1 表達較乳頭狀瘤患者明顯升高（P<0.001），提示CCNB1 表達與腫瘤組織類型相關。而性別、體重、吸煙情況、Stage 分期及淋巴結轉移亞組間差異無統計學意義（P> 0.05，見圖3）。

圖3 CCNB1 表達與膀胱癌患者臨床及病理因素的相關性

2.5 CCNB1 表達與免疫細胞浸潤及預后的相關性 利用TIMER 數據庫分析膀胱癌中CCNB1 表達與B 細胞、CD8+T 細胞、CD4+T 細胞、巨噬細胞、中性粒細胞及樹突狀細胞浸潤及預后相關性。結果顯示：CCNB1 表達與CD8+T 細胞（r=0.315,P<0.001）、中性粒細胞（r= 0.228,P< 0.001）及樹突狀細胞（r=0.397,P< 0.001）浸潤呈正相關（見圖4 A）。進一步利用TIMER 數據庫分析CCNB1 表達和免疫細胞浸潤對膀胱癌預后的影響，結果顯示：CCNB1 表達和CD8+T 細胞浸潤與膀胱癌預后相關，CD8+T 細胞浸潤水平越高患者預后越差（P= 0.006, 見圖4 B）。最后，本研究分析了膀胱癌中CCNB1 表達與T 細胞及CD8+T 細胞標志蛋白表達的相關性，結果顯示：CCNB1 與CD8A（r=0.186,P<0.001）及CD8B（r=0.13,P< 0.001）表達呈正相關（見圖4 C）。提示CCNB1 可通過調節膀胱癌組織中CD8+T 細胞浸潤影響患者預后情況。

圖4 CCNB1 表達與免疫細胞浸潤及預后的相關性

3 討論

本研究首次應用網絡藥理學和生物信息學技術分析淫羊藿治療膀胱癌的有效成分及作用靶點，共篩選出11 個藥物疾病共同靶點，作用靶點最多的有效成分為槲皮素、木犀草素和山柰酚，活性成分作用最多的靶點為GSK3B 和CCNB1，其中CCNB1 高表達于膀胱癌組織中，且CCNB1 高表達患者OS、DSS 及PFI 預后均較差，CCNB1 可通過調節CD8+T 細胞浸潤影響患者預后情況。

槲皮素、木犀草素和山柰酚均屬于天然黃酮類物質，具有抗腫瘤作用。槲皮素通過調節細胞存活信號通路（如：PI3K/AKT 和FOXO1 等）、凋亡調節分子（如：caspase 和Bcl-2 家族等）、細胞周期調節蛋白（如：p21、cyclinB 和p27 等）和活性氧自由基（ROS）形成等，抑制腫瘤細胞生長、增殖和侵襲，促進腫瘤細胞凋亡[3,9]。體外實驗表明槲皮素可通過作用多個靶點和通路（如：增強AMPK 磷酸化水平，DNA 損傷等）抑制膀胱癌細胞生長增殖，誘導細胞凋亡，從而抑制腫瘤侵襲和遷移[3,10]。此外，槲皮素能夠協同順鉑抑制膀胱癌細胞生物活性，誘導細胞凋亡[11]。木犀草素通過調節ADP 核糖聚合酶水解、DNA 碎片化和多聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶（PARP）斷裂，誘導膀胱癌RT112 細胞凋亡[4]。木犀草素亦可通過上調p21 表達及抑制mTOR 信號通路，使細胞阻滯在G2/M 期，抑制膀胱癌細胞增殖并誘導細胞凋亡[12]。山柰酚通過抑制AKT、CyclinD1、CDK4、Bid、Mcl-1、Bcl-xL 磷酸化，并促進p53 信號通路活化，使細胞滯留S 期并誘導細胞凋亡，從而抑制膀胱癌生長[13]。

細胞周期蛋白B1（cyclin B1，CCNB1）是細胞成熟促進因子（maturation promoting factor，MPF）調節亞單位，與細胞周期蛋白依賴性激酶1 結合啟動有絲分裂，在調節細胞周期G2/M 轉換中發揮關鍵作用[14]。研究發現CCNB1 在胰腺癌[14]、肺癌[15]及肝癌[16]等多種腫瘤呈高表達狀態，通過調節細胞增殖和周期分布參與腫瘤發生發展，且與患者預后不良密切相關。近年來研究發現CCNB1 高表達于膀胱癌組織中，且高表達患者預后較差[17-18]。體外實驗研究發現，抑制CCNB1 表達能夠顯著抑制膀胱癌細胞增殖及生長[19]。本研究發現CCNB1 高表達膀胱癌患者OS、DSS 及PFI 均較差，CCNB1 在腫瘤組織中的表達情況與患者預后呈負相關，與上述研究結果基本一致。診斷ROC 曲線圖提示CCNB1 在預測膀胱癌患者預后方面具有較好的診斷效能，提示CCNB1可作用膀胱癌藥物治療的新靶點。

研究發現肝癌中CCNB1 mRNA 表達與患者種族顯著相關[20]。本研究中白種人及非裔美國人膀胱癌患者CCNB1 表達均高于亞洲人，可能與歐洲及北美地區膀胱癌患者發病率較高相關[21]。吸煙是膀胱癌發生的危險因素，然而本研究中CCNB1 表達與患者吸煙情況無統計學差異，提示吸煙可能不是通過介導CCNB1 表達影響膀胱癌患者預后情況。研究發現CCNB1 表達增加可作為非肌層浸潤性膀胱癌復查的標志，提示CCNB1 表達可能與膀胱癌病理類型及腫瘤惡性程度相關[18]。本研究中非乳頭狀膀胱癌患者CCNB1 表達較乳頭狀瘤患者明顯升高，表明CCNB1 表達與腫瘤病理類型及惡性程度相關，與上述研究結果基本相符。

腫瘤微環境免疫細胞浸潤與腫瘤免疫逃逸密切相關。研究發現肝癌組織中CCNB1 表達與CD4+T細胞、CD8+T 細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞的浸潤水平呈正相關，表明CCNB1 參與腫瘤微環境中免疫細胞浸潤調控，從而導致腫瘤細胞發生免疫逃逸[16]。本研究發現CCNB1 表達與CD8+T細胞、中性粒細胞及樹突狀細胞浸潤呈正相關，且CD8+T 細胞浸潤與膀胱癌預后相關，CD8+T 細胞浸潤水平越高患者預后越差，表明膀胱癌中CCNB1高表達通過誘導CD8+T 細胞浸潤實現腫瘤免疫逃逸，從而導致患者預后較差。與上述研究結果基本一致。

綜上所述，本研究結果表明槲皮素及木犀草素和山柰酚可能是淫羊藿治療膀胱癌的關鍵有效成分。CCNB1 是淫羊藿的主要作用靶點，高表達于膀胱癌組織中，并且與膀胱癌患者預后呈負相關。CCNB1 表達與CD8+T 細胞浸潤呈正相關，CD8+T細胞浸潤水平越高患者預后越差。提示淫羊藿可通過靶向CCNB1 調節CD8+T 細胞浸潤，從而影響膀胱癌患者預后。盡管本研究對淫羊藿治療膀胱癌的有效成分及分子機制進行了初步探究，但由于藥物篩選條件過濾了部分活性成分，使結果具有局限性，同時CCNB1 調控CD8+T 細胞浸潤詳細分子機制還有待基礎實驗進一步驗證。