宏基因組二代測序在耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌醫院感染暴發中的應用

范鵬超,劉 賀,巴婧翀,劉文芝

(大連醫科大學附屬第二醫院疾病預防與醫院感染控制部,遼寧 大連 116023)

鮑曼不動桿菌是一種非發酵的革蘭陰性桿菌,可定植于人體皮膚、呼吸道、泌尿道及自然環境中,常引起血液、泌尿道及下呼吸道等多部位感染,是醫院感染的主要病原菌之一[1]。碳青霉烯類藥物是治療鮑曼不動桿菌感染的推薦藥物,但隨著碳青霉烯類藥物使用量逐年增加,免疫抑制劑等廣泛使用,以及感染防控措施落實不到位,耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌(carbapenem-resistantAcinetobacterbaumanii, CRAB)的檢出率與感染率逐年增加[2]。重癥監護病房(intensive care unit, ICU)收治的患者普遍免疫力低下,是發生醫院感染的高危人群[3],同時多數患者需要接受氣管插管、泌尿道或中心靜脈置管等高風險性侵襲操作,一旦發生CRAB醫院感染暴發事件將產生嚴重影響。近年來,宏基因組二代測序(metaganomic next-generation sequencing, mNGS)技術逐漸發展成為檢測病原體的新手段,此方法快速精準,陽性率高,可準確客觀且快速高效地檢測多種病原微生物,已在多個領域廣泛應用[4-5],但mNGS應用于疑似醫院感染暴發事件調查的報道較少。2023年6月8—22日某院ICU 5例患者的標本檢出CRAB,此5例患者入院時間存在交叉,床位分布存在空間關聯,本研究利用mNGS技術分析此次疑似暴發事件,為CRAB感染的預防與控制提供科學依據,現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 病例資料 2023年6月8—22日該院ICU共收治16例患者,其中病例1、2、3、4查體時,肺部聽診有啰音,影像學表現為片狀高密度陰影,病例5出現惡心、頭痛,且磁共振顯示腦內彌漫性水腫,3例患者的痰標本、1例患者的肺泡灌洗液標本及1例患者的腦脊液標本培養結果回報為CRAB。為進行精準抗感染治療及采取醫院感染防控措施,6月14—22日ICU陸續采集上述5例患者標本進行mNGS檢測。本研究通過該院倫理委員會批準(No. 2023—1061),所有患者均知情并簽署知情同意書。

1.2 病原學檢測方法

1.2.1 病原菌培養 參照《全國臨床檢驗操作規程(第四版)》[6]進行標本采集與送檢,使用VITEK 2 Compact分析儀及配套鑒定卡、藥敏卡片進行細菌種屬鑒定及藥物敏感試驗。

1.2.2 mNGS檢測 (1)標本采集:使用無菌干燥的潔凈凍存管(PMseq檢測采集管)采集3例患者的痰標本(患者均使用生理鹽水等進行口腔護理,用力排咳留取深部痰3 mL),1例患者的肺泡灌洗液(棄去前端可能污染的部分,收集其余部分3 mL)及1例患者的腦脊液標本(為減少污染,采集第2管腦脊液);(2)送至中國華大基因進行mNGS檢測,分析標本中微生物并與數據庫原核酸序列進行比較、鑒定。

1.3 調查方法

1.3.1 現場流行病學調查 2023年6月22日該院感染控制專職人員使用眾智醫院感染監測預警系統v10.2,顯示5例CRAB感染,醫院感染控制部立即成立調查小組,利用HIS系統查閱病例并第一時間進行床旁調查,與主管醫生、護士、藥學部等進行討論,進行風險評估后并立即采取醫院感染控制措施。

1.3.2 結果判定 根據衛生部2001年頒布的《醫院感染診斷標準(試行)》[7]對以上患者進行醫院感染診斷。根據《醫院感染暴發控制指南》[8],短時間內發生3例以上臨床癥候群相似,懷疑有共同感染源的感染病例的現象,綜合患者癥狀、病原體分離情況、時間及空間分布等,考慮為醫院感染暴發。

1.3.3 環境衛生學監測 醫院感染控制部對可疑污染的ICU床單元、病區環境設備及醫務人員手等115個點位進行環境微生物采樣,用浸有中和劑(卵磷脂吐溫胰蛋白胨大豆培養基復方中和劑,購自貝瑞特生物技術有限責任公司)的無菌拭子進行涂抹,并接種于耐碳青霉烯腸桿菌目檢測用培養基(CRE顯色培養基,購自沈陽彥程生物制品有限公司),立即置于37℃暖箱培養48 h后觀察菌落情況,對可疑菌株進行鑒定及藥敏試驗。

1.3.4 醫院感染控制措施 結合環境微生物學結果,通過RCA根因分析等方法,組織流行病學調查小組聯合行政、醫療、護理管理人員展開分析討論,制定以下感染控制措施:(1)立即進行徹底的環境衛生清潔消毒工作,將目前CRAB患者按區域收治,護理人員不得交叉;(2)規范合理使用隔離衣,隔離衣一人一用一換;(3)對全科人員開展手衛生培訓及考核;(4)同期所有患者全部送檢微生物標本;(5)護理操作時盡可能使用密閉式吸痰器,防止氣溶膠噴濺操作。

1.4 統計學方法 應用SPSS 23.0對所有數據進行統計學分析,定性資料比較采用χ2檢驗,兩組間定量資料比較采用t檢驗,P≤0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 流行病學特征

2.1.1 人群分布 2023年6月8—22日ICU共收治16例患者,其中男性10例,女性6例,年齡23～91歲,平均年齡(68±2.23)歲,其中3例患者痰標本、1例患者肺泡灌洗液標本及1例患者腦脊液標本檢出CRAB,以上患者均接受氣管插管輔助通氣。5例檢出CRAB患者的基本情況見表1。

表1 ICU 5例檢出CRAB患者的基本情況

2.1.2 時間分布 病例1首次于6月14日檢出CRAB,病例2～5于6月16—22日陸續檢出,結合臨床癥狀病例1～5于6月14—22日進行第二次微生物培養送檢并進行mNGS檢測,見表2。

表2 5例患者微生物培養送檢時間及結果

2.1.3 空間分布 ICU開放床位28張,6月8—22日在院患者16例,病例3、病例4檢出CRAB后床位分別調整至22、27床,便于分區域集中管理。見圖1。

2.2 mNGS與傳統病原學檢測對比 5例患者標本培養結果均為CRAB。mNGS檢測結果顯示,5例患者標本均檢出OXA-23耐藥基因,見表3。mNGS結果回報所需時間短于培養所需時間[(3.92±1.05)d VS (6.24±0.25)d,t=-13.420,P<0.001)]。

表3 5例患者標本mNGS檢測和傳統培養結果比較

2.3 環境衛生學監測結果 共采集115份環境標本,59份檢出CRAB,檢出率為51.30%,以呼吸機按鈕、移動護理車檢出率最高(均為80.00%),其次為呼吸機外殼(75.00%)、呼吸機屏幕(70.00%),與患者藥敏結果均一致,除替加環素敏感外其余檢測抗菌藥物均耐藥,59份檢出CRAB的標本中,呼吸機表面、移動護理車和醫務人員手分別占50.85%(30份)、20.34%(12份)、13.56%(8份)。見表4。

表4 ICU環境衛生學監測結果

2.4 感染控制措施與效果評價 6月23日—7月1日感染控制措施實施情況統計結果顯示,感染控制措施執行均有明顯提高,見表5。5例患者預后較好,陸續于6月28日、6月30日、7月1日轉出ICU。

表5 感染控制干預措施落實率(%)

3 討論

該院為省級三級甲等醫院,編制床位3 000張,ICU常收治病情較重的患者,患者攜帶多重耐藥菌的概率較大。本研究中5例患者經過專家組會診,給予如下結論:(1)病例1由外院轉入,但無證據表明入院時攜帶且在入院48 h后檢出CRAB,結合臨床表現判定為醫院感染;(2)病例3首次腦脊液培養陽性,第二次培養陰性,且患者血常規、顱內影像學等指標不支持感染,考慮為標本污染或定植,mNGS結果顯示該患者標本檢出OXA耐藥基因,需嚴格防控CRAB定植轉為感染的風險;(3)病例2、4、5考慮為患者機體免疫力下降、碳青霉烯類藥物使用等原因造成的CRAB醫院感染。根據專家會診結論及《醫院感染暴發控制指南》中醫院感染暴發定義,考慮此次事件為CRAB醫院感染暴發。

近年來,CRAB聚集或暴發事件較為常見,多地均有報道[9-10],但由于普通醫療機構缺乏同源性鑒定手段,當感染病例較少時無法判定為暴發事件。本研究中于6月14—22日陸續對5例患者標本進行mNGS檢測,結果回報均早于傳統微生物檢測[(3.92±1.05)d VS (6.24±0.25)d,P<0.001],mNGS檢測具有檢出率高、耗時短、精準性強的優勢。檢出病原微生物是判定醫院感染的重要依據,傳統的微生物檢測主要通過免疫、生化以及培養等試驗方法檢測標本中微生物種類與定量信息[11],但由于標本采集不規范、送檢時機不合理及某些病原微生物常規下難以培養等原因,存在培養周期長、假陰性率高及效率較低等問題?；趍NGS技術對標本進行完全測序,具有靈敏度高、時間快等特點,在感染性疾病的早期診斷中,對于混合菌種的檢出更具優勢,從而可以采取干預措施,及時阻斷傳播途徑,保護高危人群,降低醫院感染風險。本研究中5株CRAB藥敏結果顯示,對亞胺培南和美羅培南兩種藥物的耐藥率均為100%,mNGS檢測均檢出OXA-23耐藥基因型,其序列數、相對豐度均較高,且未檢出OXA-24、OXA-58等其他耐藥基因,提示攜帶OXA-23基因是造成本次CRAB耐藥的主要原因。研究[12]顯示,只有同時攜帶OXA-51和OXA-23基因的鮑曼不動桿菌才對抗菌藥物高度耐藥,只攜帶OXA-51的鮑曼不動桿菌對抗菌藥物則趨向敏感。因此,對于醫院感染防控尤其ICU可借助mNGS技術,在目標菌感染暴發途徑追蹤及耐藥基因研究時具有重要作用[13-14]。同時mNGS可以檢測未知微生物包括病毒、真菌等,完善傳統微生物檢測上的不足,為臨床診療及醫院感染控制措施的制定提供可靠的決策依據[15],但mNGS檢測結果受宿主背景微生物構成的影響,對標本要求高,極易被污染,且病原微生物的檢出很大程度上依賴數據庫的全面型與特異性,因此,存在假陽性、部分病原菌檢出率低、成本高等問題,臨床分析mNGS結果同時應結合患者臨床癥狀及其他輔助診斷方法及檢測結果,從而進行感染或定植的判定。

本次事件中,呼吸機表面、移動護理車及醫務人員手均分離出CRAB,提示手衛生與環境清潔消毒的重要性。陳學斌等[16]研究指出,呼吸機外表面消毒不當是導致醫院感染的重要原因。分析可能因為ICU收治的患者病情重、醫務人員工作量較大,導致清潔消毒工作落實不足,還可能由于某些產生氣溶膠噴濺的操作如吸痰、氣道插管拔管等導致呼吸機外表面污染。中國研究型醫院學會危重醫學專委會護理研究學組研究提出,對多重耐藥患者進行吸痰護理時,應盡可能使用密閉式吸痰器以防止氣溶膠噴濺[17];ICU醫護人員手衛生依從率較低也是本次傳播鏈條的重要原因,感染控制措施干預前醫生、護士手衛生依從率分別為40.83%(49/120)、67.96%(70/103),遠低于其他地區的相關報道[18-19]。當進行與CRAB患者接觸面積比較大的操作時,如翻身、拍背、康復治療等,操作人員應穿隔離衣。隔離衣可以避免因接觸導致病原體床單元等傳播,本事件中隔離衣正確使用率僅為45.65%(21/46),可能與患者較多工作繁忙、醫務人員對隔離穿衣的作用認識不足及隔離衣儲備不足等有關,這些都有可能導致CRAB的進一步傳播。通過多學科聯合感染控制培訓等PDCA質量控制,不僅手衛生依從率及相關措施落實率均有明顯上升,對于患者預后起到重要作用,同時醫院感染管理部也將此次指標定為每月質量控制基礎數據,開展持續性監測提升感染控制意識。

綜上所述,mNGS技術可以快速鑒別醫院感染患者病原微生物特征,對于耐藥基因可以開展分型研究,對多重耐藥菌感染患者的抗感染治療以及醫院感染防控措施制定具有重要意義,針對性的加強消毒隔離工作與提高手衛生依從率是防控CRAB的重要手段。本研究也存在一定局限性,由于成本及技術原因無法對環境中的CRAB進行耐藥基因檢測,因此僅能對醫院感染傳播途徑進行推測。本次事件發生后感染管理部門予以高度重視,采取積極干預措施,應用mNGS技術配合感染控制措施取得較好效果,故總結經驗,以期為感染的預防與控制提供參考。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。