擬南芥磷脂酸熒光探針的構建及應用

馬疏言，鄭月萍,2，鄭志富,2

（1.浙江農林大學 現代農學院，浙江 杭州 311300；2.浙江農林大學 油料作物種質創新與利用研究所，浙江 杭州 311300）

磷脂酸(phosphatidic acid，PA)是一種常見的細胞甘油磷脂，也是最簡單的膜脂之一[1]。幾乎所有生物體內都會產生PA，包括酵母[2]、動物[3]和植物[4]等。在植物中PA 的合成主要包括2 種方式：第1 種是從頭合成途徑，3-磷酸甘油先后在3-磷酸甘油?；D移酶和溶血磷脂酸脂?；D移酶的作用下發生連續2 步?；磻蒔A，這也是PA 合成的主要途徑[5]；第2 種是磷脂的降解途徑，磷脂降解又可分為2 種，一種是磷脂酶D 通過水解某些結構磷脂直接生成PA[6-9]，另一種是磷脂酶C 通過水解磷脂酰肌醇生成二脂酰甘油[10]，繼而經二脂酰甘油激酶磷酸化生成PA[11]。PA 作為一種結構膜脂，磷酸基團頭部能夠以“靜電/氫鍵開關模型”的方式與蛋白質結合[12]。在該模型中，PA 結合蛋白中帶正電荷的堿性氨基酸殘基[13-17]，可以吸引磷脂雙分子層上的負電荷，并通過靜電作用影響膜環境，繼而與PA 頭部的磷酸基團形成氫鍵，產生一個穩定的蛋白質結合位點。PA 這種攜帶負電荷并且在生理條件下呈圓錐體的獨特分子構型[18]，使得PA 結合蛋白的結構域能夠特異性的與其結合，保證了生物膜結構的穩定和功能的發揮。除了作為膜脂的一個結構成分以及甘油脂合成的前體物質，PA 還是一個關鍵信號分子，在多種生物學過程中發揮重要作用。正常條件下，行使信號功能的PA 含量甚微；在植物應答各種生物與非生物脅迫過程中PA 水平則會迅速升高，但這種積累往往是短暫的。這說明生物體擁有一套嚴格控制信號分子PA 含量的機制，這對調節PA 信號傳遞強度、維持細胞物質與能量代謝的動態平衡至關重要[19-22]。

盡管PA 擁有多種功能，但目前對于細胞內PA 含量的動態變化仍知之甚少，這主要受PA 檢測手段的限制。過去主要采用諸如薄層層析、高效液相色譜和放射性同位素標記等理化手段對其含量進行測定[23]。近年來，質譜分析技術的應用使得對包括PA 在內的各種脂質的測定更準確和高效[24-25]。然而，這些理化手段都只能對組織器官中PA 總量與種類進行定量或定性分析，無法捕捉細胞內PA 的動態與瞬時變化信息。通常認為，內質網上的PA 含量相對較高，這有助于促進磷脂和三酰甘油的合成[26-27]；而質膜和細胞器中行使信號功能的PA 含量甚微。顯然，采用理化測定會掩蓋胞內PA 的真實變化。因此，亟需開發一種能可視化分析細胞內PA 的工具。

大量研究表明：生物體中PA 結合蛋白種類繁多，這些蛋白中的PA 結合域(phosphatidic acid binding domains，PABD)結構亦存在差異。其中一些PABD 因與PA 結合專一性強，被用來開發多種PA 探針[28-33]。酵母蛋白Spo20p 中的PA 結合域已被證實具有極強的專一性[33]，只結合PA 而不結合其他磷脂。目前基于這一PABD 所開發的PA 探針在醫學研究中應用廣泛，但在植物中的應用卻有限[34]。因此，本研究旨在構建基于Spo20p 中的PABD 的植物PA 熒光探針，為剖析植物早期應答逆境脅迫的細胞分子機制提供新工具。

1 材料與方法

1.1 植株培養

1.1.1 土壤基質的培養 將擬南芥Arabidopsisthaliana種子置于含有濕潤濾紙的培養皿中，4 ℃冰箱內避光放置3 d 后將其點播在濕潤的土壤基質上(V營養土∶V蛭石∶V珍珠巖=3∶1∶1)。將播種后的盆栽用透明塑料蓋覆蓋，置于24～25 ℃室溫、50%～60%濕度、14 h 光照/10 h 黑暗的植物培養箱中培養，7 d 后揭去塑料蓋間苗。

1.1.2 培養基的培養 將擬南芥種子進行消毒，加入適量滅菌過的蒸餾水，在4 ℃冰箱內避光放置3 d，點播在1/2 MS 培養基上，置于植物培養間中培養。

1.2 PA 熒光探針的構建

1.2.1 pSY06-GFP-PABD載體的構建 酵母蛋白Spo20p 中存在一個高度專一的PA 結構域(PABD)，該PABD 由40 個氨基酸殘基構成，只結合PA 而不結合其他磷脂[33-34]，因此，本研究選擇該PABD 與熒光蛋白融合，構建PA 熒光探針。根據PAPD 核苷酸序列[33]設計引物(表1)進行PCR 擴增，獲得與該PABD 相對應的DNA 片段；同時PCR 擴增獲得GFP基因編碼區序列。隨后，利用無縫克隆試劑盒(生工)，將GFP和PABD片段克隆至植物表達載體pSY06 的限制性內切酶位點KpnI 和PstI 之間，獲得重組質粒pSY06-GFP-PABD。PABD連接至GFP基因編碼區的3′端，構成GFP-PABD融合基因，該融合基因的表達由組成型啟動子UBQ10 驅動。重組質粒中的插入片段經菌落PCR、KpnI 和PstI 雙酶切以及測序驗證正確后，采用熱激法將質粒轉化至農桿菌AgrobacteriumtumefaciensGV3101，用于后續擬南芥遺傳轉化。

表1 相關引物序列Table 1 Sequence of related primers

1.2.2 擬南芥的遺傳轉化、篩選及鑒定 以哥倫比亞野生型擬南芥(WT)為植物材料，利用農桿菌花序侵染法轉化擬南芥。將獲得的T1代擬南芥種子進行表面消毒，均勻鋪在含有草銨膦(10 mg·L-1)和特美汀(50 mg·L-1)的1/2 MS 篩選培養基上進行篩選。將具有除草劑抗性的陽性苗移栽到土壤中繼續培養，3 周后提取葉片DNA 并設計引物(表1)進行PCR 鑒定，對T2和T3代轉基因株系進行除草劑抗性的遺傳分析，最終篩選得到純合單插入位點轉基因株系。

1.3 轉基因擬南芥中目的基因表達量分析

以在1/2 MS 培養基中生長7 d 的轉基因擬南芥根系作為測定材料，使用高純度RNA 提取試劑盒(全式金)提取RNA 并對其進行純度檢測和濃度測定。取等量RNA，使用反轉錄試劑盒(翌圣)進行單鏈cDNA 的合成。選擇擬南芥肌動蛋白基因Actin為內參基因，設計引物(表1)進行實時熒光定量PCR(RT-qPCR)，并對數據采用2-ΔΔCt法進行分析。

1.4 PA 熒光探針轉基因擬南芥的表型觀察

將野生型和轉基因株系種子點播在1/2 MS 方形培養基上，豎直培養6 d 后，挑選長勢均勻一致的幼苗(每個基因型，20 株)，分別轉移至含有0 和50 mmol·L-1NaCl 的1/2 MS 固體培養基中繼續豎直培養，7 d 后觀察表型。

1.5 PA 熒光探針靈敏度分析

將在1/2 MS 方形培養基上豎直培養6 d 的幼苗分別浸泡在含有0、2 和10 μmol·L-1PA 的1/2 MS 液體培養基中，依次處理5、10、15 和20 min 后，利用熒光顯微鏡(ZEISS，Axio Imager 2)對擬南芥根尖分生區PA 的分布進行觀察并拍照。

1.6 鹽堿脅迫下根尖PA 的檢測

將含PA 熒光探針的擬南芥轉基因株系種子點播在1/2 MS 方形培養基上，豎直培養6 d，選擇均勻一致的幼苗分別浸泡在含有100 mmol·L-1NaCl、10 mmol·L-1NaHCO3和兼含兩者的1/2 MS 液體培養基中，處理5、10 和15 min 后用熒光顯微鏡觀察根尖分生區PA 的分布。

2 結果與分析

2.1 PA 熒光探針的設計及其轉基因擬南芥的獲得

如圖1 所示：該載體以pSY06 為骨架，由35S 啟動子驅動植物選擇標記基因——草銨膦抗性基因(bar)的表達，而GFP-PABD融合基因的表達則由UBQ10 啟動子驅動。

圖1 pSY06-GFP-PABD 載體圖Figure 1 Vector diagram of pSY06-GFP-PABD

采用農桿菌花序侵染法將GFP-PABD融合基因轉入擬南芥，獲得T1代轉基因種子。對T1代幼苗進行草銨膦(10 mg·L-1)抗性篩選與PCR 鑒定，獲得56 個含融合基因的獨立轉基因株系。隨后，對相應株系的T2代幼苗(每個株系約300 株)繼續進行草銨膦除草劑抗性篩選?？ǚ綔y驗顯示：符合3(陽性苗數)∶1(陰性苗數)分離規律的株系共8 個，這些株系為含單插入位點的轉基因株系。再對T2代各個株系不同植株的自交后代(T3代)進行除草劑抗性篩選，最終獲得7 個純合、單插入位點轉基因擬南芥株系，分別為8-1、11-1、13-12、25-5、42-4、48-1 和53-1。

2.2 不同轉基因株系PA 熒光探針表達量的分析

為了明確不同轉基因株系PA 熒光探針表達量的差異，對上述7 個轉基因株系進行了目的基因的表達量測定。RT-qPCR 結果(圖2)顯示：當將轉基因株系8-1 中融合基因的相對表達量設為參考值“1”，其余6 個株系(11-1、13-12、25-5、42-4、48-1 和53-1)的相對表達量分別為1.74、15.91、0.72、1.06、1.69 和1.52。株系13-12 的PA 探針的表達量最高，是其他株系的9～22 倍，為PA 探針高表達轉基因株系；相應地，將株系48-1 作為PA 探針低表達材料。

圖2 不同轉基因擬南芥株系中GFP-PABD 融合基因的相對表達量Figure 2 Relative expression level of the GFP-PABD fusion gene in transgenic A.thaliana lines

2.3 PA 熒光探針對擬南芥生長發育的影響

為了明確PA 熒光探針的表達是否會對植物生長發育產生影響，比較分析了野生型擬南芥和不同轉基因株系在整個生長發育周期的表型差異。土培生長實驗顯示：野生型與轉基因擬南芥株系的葉片生長無明顯差異，高表達轉基因株系(13-12)與低表達轉基因株系(48-1)之間亦無可見表型差異(圖3A)。另外，在含有0 和50 mmol·L-1NaCl 的1/2 MS 培養基中生長時，野生型與不同轉基因株系之間也未表現出生長速率的差異(圖3B)。這些結果說明：在一定范圍內PA 熒光探針的表達不會影響擬南芥的正常生長發育，這一特性有助于合理解釋特定條件下胞內PA 變化對植物生長發育產生的影響。

圖3 野生型擬南芥與3 個PA 熒光探針轉基因株系的表型比較Figure 3 Phenotypic comparison between wild type and three transgenic lines of A.thaliana bearing PA fluorescent probe

2.4 熒光探針監測PA 的靈敏度

隨著熒光探針表達量的增加，細胞內的熒光強度也會增強，這會導致PA 檢測的信噪比下降；相反，熒光探針表達量過低則會影響PA 檢測的靈敏度。為了獲得檢測靈敏度和信噪比都較高的PA 熒光探針，用不同濃度的外源PA 處理熒光探針表達量存在差異的轉基因株系，進而在熒光顯微鏡下觀察根尖PA 的積累情況。結果(圖4～6)顯示：野生型擬南芥在有、無外源PA 處理下，根尖細胞自發熒光的強度無明顯差別。另外，在不同濃度外源PA 處理下，熒光探針低表達的轉基因株系(48-1)的根尖分生區的PA 含量變化未能被捕捉到。相反，對于熒光探針高表達的轉基因株系(13-12)，2 和10 μmol·L-1PA 分別處理10 和5 min 后，其根尖分生區細胞的胞內或質膜上的PA 積累清晰可見(圖5)。當外源PA 濃度低時，隨著處理時間延長，細胞中PA 積累減少(圖5)，這很可能是因為作為甘油脂合成前體物質的PA 已被轉化為其他物質。而當外源PA 濃度升至10 μmol·L-1時，處理10、20 min 后依然可見細胞中的PA 呈點狀分布(圖6)。這些結果說明：熒光探針表達量較高的轉基因株系(13-12)可被用于監測細胞中PA 含量的變化。

圖4 無外源PA 處理下PA 探針在野生型和2 個轉基因擬南芥株系根尖中熒光強度的差異分析Figure 4 Analysis of discrepancy in fluorescent intensity of PA probe between wild type and two transgenic lines of A.thaliana

圖5 外源PA(2 μmol·L-1)處理下PA 熒光探針對PA 監測靈敏度的分析Figure 5 Sensitivity analysis of PA fluorescent probe monitoring PA under treatment with 2 μmol·L-1 exogenous PA

圖6 外源PA (10 μmol·L-1)處理下PA 熒光探針對PA 監測靈敏度的分析Figure 6 Sensitivity analysis of PA fluorescent probe monitoring PA under treatment with 10 μmol·L-1 exogenous PA

2.5 熒光探針檢測鹽堿脅迫下擬南芥根尖PA 的含量變化

為了進一步驗證 PA 熒光探針的實用性，利用熒光探針表達量較高的轉基因株系(13-12)檢測鹽堿脅迫條件下根尖細胞中PA 含量的變化。結果顯示：鹽、堿單獨或混合處理轉基因株系，5 min 后即可在根尖分生區細胞中觀察到PA 的點狀分布(圖7)。因此推斷，本研究構建的PA 熒光探針可用于監測逆境條件下植物細胞中PA 含量的變化。另外，鹽堿脅迫可快速誘導PA 積累這一現象表明在植物早期逆境響應中PA 發揮某種重要作用。

圖7 單獨或混合鹽堿脅迫下PA 在轉基因擬南芥根尖分生組織中的分布Figure 7 Distribution of PA in the root tip meristem of a transgenic A.thaliana line bearing PA sensor under saline and alkaline stresses, alone or in combination

3 討論

已知PA 在植物生長發育與逆境響應過程中發揮重要作用，但由于缺乏PA 的可視化分析工具，對細胞中PA 含量動態變化的了解十分有限。這一方面限制了PA 作用機制的研究，另一方面給評估基因工程手段操控植物細胞PA 含量變化所產生的實際應用效果帶來困難。因此，本研究將酵母蛋白Spo20p 中對PA 高度專一的結合域與熒光蛋白融合，成功構建了可對細胞內PA 進行可視化檢測的熒光探針。

為了使熒光探針適用于監測整個生長周期不同組織細胞中的PA 水平，選擇組成型表達啟動子UBQ10 驅動GFP-PABD融合基因的表達。研究發現：植物細胞中PA 的檢測靈敏度與PA 熒光探針的表達量密切相關，表達量較高的熒光探針可有效檢測到外源PA 處理帶來的胞內PA 水平的變化，而表達量較低的探針檢測效果則相反。如13-12 株系中PA 熒光探針的表達量高于其他株系，該株系經2 μmol·L-1外源PA 處理10 min，其根尖細胞中PA 的點狀分布即可被觀察到，這也說明外源PA 能夠被擬南芥根尖快速吸收，繼而與PA 熒光探針結合。鑒于已有研究中常用濃度高于10 μmol·L-1的外源PA 檢測PA 探針的靈敏度[35]，本研究中構建的熒光探針可有效監測到2 μmol·L-1外源PA 處理所帶來的細胞內PA 含量的變化，推測基于13-12 轉基因株系的PA 熒光探針具有較高的PA 檢測靈敏度。

需要指出的是，PA 熒光探針使用過程中，樣品處理時間的延長和觀察光源的增強均會使植物細胞造成某種損傷，導致細胞產生自發熒光，從而降低PA 檢測的信噪比。因此在實驗過程中，需盡量縮短植物樣本的制片時間及熒光觀察的時間，以提高觀察結果的真實性。

鹽堿地中鹽和堿是2 種共存但不同的非生物脅迫，共同影響植物的正常生長發育。利用本研究構建的PA 熒光探針發現：鹽脅迫處理5 min 就會造成PA 在細胞中的積累，這與已有的研究結果一致[22,36]。同時，堿脅迫和鹽堿混合脅迫也會快速誘導PA 的積累。因此，為了全面了解植物早期逆境響應機制，有必要監測早期細胞中PA 含量的動態變化。本研究開發的PA 熒光探針為這些方面的研究提供了重要技術支撐。

4 結論

本研究成功構建了一種基于酵母蛋白Spo20p 中PA 結合域的熒光探針，可有效監測植物細胞中PA 含量變化。應用該探針發現鹽堿脅迫可快速誘導擬南芥根尖細胞質膜上和胞內PA 的積累，這一結果表明PA 在植物對鹽堿脅迫早期應答過程中發揮重要作用。