綠豆象成蟲對紅豆與綠豆種子揮發物的電生理和嗅覺行為反應

樊楠楠, 黃金遇, 劉 松, 張 凱, 張仙紅, 鄭海霞

(山西農業大學植物保護學院, 太谷 030801)

植食性昆蟲利用植物釋放的氣味物質可以準確找到寄主和產卵場所(欽俊德和王琛柱, 2001; Bruceetal., 2005)。如小菜蛾Plutellaxylostella對于十字花科植物中的芥子油苷有強烈的趨向產卵行為(朱經云, 2021);梨小食心蟲Grapholithamolesta寄主揮發物中的葉醇和己酸丁酯是引誘該蟲前來產卵的關鍵物質(李逸等, 2016);榆紫葉甲Ambrostomaquadriimpressum也可以對寄主植物榆樹揮發物產生趨向(Wangetal., 2017);棗樹揮發物棕櫚酸甲酯和壬醛對棗飛象Scythropusyasumatsui有顯著的引誘作用(閻雄飛等, 2020);中華弧麗金龜甲Popilliaquadriguttata的寄主揮發物中β-石竹烯、芳樟醇和2-乙基-1-己醇對其有一定的吸引作用(徐偉等, 2018);藍桉葉片中的α-水芹烯、α-蒎烯和α-法尼烯不僅能顯著增加棉鈴蟲Helicoverpaarmigera抱卵雌蛾在葉片上的著陸頻率,且產卵數量顯著提高(孫小旭等, 2018)。

不同植物的揮發物均以特定的成分和比例構成獨有的化學指紋譜,對昆蟲精準寄主定位非常重要(Bruceetal., 2005; 閻雄飛等, 2020)。隨著越來越多的植物揮發物有效成分被鑒定,植物源引誘劑也在多種害蟲的治理中得到廣泛應用,如蒎烯和蒈烯混合制成的誘芯對田間褐梗天牛Arhopalusrusticus有很高的誘集率(張霖等, 2016);肉豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚油酸和硬脂酸合成的混合物可作為四紋豆象Callosobruchusmaculatus的短程引誘劑(Adhikaryetal., 2016);單萜烯、松節油和乙醇等物質混配研制的M99-1型松墨天牛引誘劑對松墨天牛Monochamusalternatus有很好的引誘效果(趙錦年等, 2001);李曉峰等(2020)以7種植物揮發物單體設計篩選出了3種引誘劑配方對華北大黑鰓金龜成蟲Holotrichiaoblita具有顯著引誘效果;另外,華北大黑鰓金龜雄蟲后腸粗提物順-9-十八烯醛與榆樹揮發物2-乙基-1-己醇混合比例為3∶1時,對華北大黑鰓金龜雌雄成蟲均有極顯著的引誘作用(李雪等, 2018)。

綠豆象Callosobruchuschinensis是一種常見的豆類儲糧害蟲,尤其對紅豆和綠豆為害最重。成蟲既可以在田間嫩豆莢上產卵,也可以在倉儲豆類的種子表面產卵,幼蟲孵化后蛀入豆粒為害,被蛀食的豆粒一般呈中空,種內成粉末狀,破壞其發芽能力,對綠豆生產帶來巨大的經濟損失(鄧蕓等, 2008;曾琛和楊波, 2015)。不論是在田間還是倉儲,綠豆象在尋找寄主產卵為害過程中,其嗅覺起著關鍵作用,因此利用植物源引誘劑對其進行嗅覺識別干擾是目前對其防控的有效手段。本研究對紅豆和綠豆種子的揮發性化合物進行了收集、鑒定和分析,通過觸角電生理反應和嗅覺行為反應試驗篩選對綠豆象具有引誘活性的化合物及最佳配比,為開發綠豆象的植物源引誘劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試種子:所用種子品種為紅豆汾小豆3號和綠豆晉綠1號,均是在山西農業大學農作站種植收獲而來,將其脫粒自然曬干并保存,保持含水量在14%以下。

1.1.2供試昆蟲:本試驗所使用的供試昆蟲來自山西農業大學害蟲防治重點實驗室,飼養溫度(26±1) ℃,相對濕度75%±5%,光周期16L∶8D。

室內測試前,將當天羽化的成蟲挑出,選擇個體大小基本一致、蟲體完整、健康活躍的綠豆象成蟲供試。

1.1.3供試揮發性化合物:基于固相微萃取(solid-phase microextraction, SPME)及氣相色譜-質譜(gas chromatography-mass spectrometry GC-MS)鑒定的結果,選用相對含量較高且已通過觸角電位(electroantennogram, EAG)初篩的8種紅豆和綠豆共有的揮發性化合物進行試驗。標準化合物如表1所示。

表1 供試8 種揮發性化合物的名稱、純度和來源

1.2 紅豆和綠豆種子揮發物的采集與鑒定

采用SPME裝置(50/30 μm DVB/CAR/PDM萃取纖維頭,美國Supel公司)收集揮發物。將20 mL頂空進樣瓶(美國安捷倫公司)用蒸餾水洗凈烘干,分別用75%酒精、正己烷依次進行潤洗,放入烘箱中40 ℃下烘干8 h。分別稱取3 g洗凈磨碎的紅豆和綠豆種子放入頂空進樣瓶中采集40 min,用空進樣瓶作空白對照,實驗重復3次。

采用美國Themo公司的Trace ISQ質譜聯用儀(gas chroatography-mass spectrometry, GC-MS)對兩種干豆子的揮發物進行分析鑒定,用 NIST譜庫進行檢索和匹配,結合標準品質譜圖和保留時間對揮發性化合物進行定性分析,用峰面積歸一法計算每種揮發性化合物的含量。氣相色譜條件:色譜柱型號為DB-5MS,無分流進樣,1 μL/次,載氣為高純氦氣,進樣口溫度230 ℃;升溫程序:初始值為75 ℃保持2 min,然后以5 ℃/min的速度升至280 ℃,保持5 min。質譜條件:電離方式EI,轟擊電壓70 eV,檢測器溫度300 ℃,離子源溫度為230 ℃,四級桿溫度150 ℃,接口溫度為230 ℃,掃描速度5 s,掃描范圍45～500 m/z。

1.3 觸角電位測定

EAG反應測試采用李廣偉等(2022)的方法,并做適當的改進。取健康活躍的綠豆象成蟲,將觸角用小刀從基部切下,并切去觸角端部的1節鞭節,供試觸角長度約為3 mm,然后將觸角兩端用導電膠(SpectraR 360)連接在兩個電極上,再將其連接到交/直流放大器(Syntech UN-06)上,用透明玻璃管罩住,保證其處于一個穩定環境,利用 Spike 軟件(Syntech 公司)進行數據采集和分析。用移液槍吸取10 μL測試樣品均勻滴到事先剪好的濾紙條(50 mm×40 mm),用鑷子將其裝入巴斯德管內,然后將巴斯德管口垂直對準試蟲觸角,其與觸角相距約為 1 cm。同樣取10 μL石蠟油滴加于濾紙上作為對照。檢測時,連續氣流(500 mL/min)吹向離體觸角,待基線平穩后開始測定。將待測質分別溶于石蠟油中,配制成濃度分別為10, 100, 250, 500和750 μg/μL的供試藥劑,以石蠟油為對照。按照對照與樣品循環刺激順序,樣品濃度依次增大進行試驗,重復3次,每個處理測定8根觸角,每個樣品刺激0.5 s,刺激間隔大于60 s,保證觸角完全恢復,減少誤差。

EAG反應相對值計算公式:V=R-(V1+V2)/2,R代表待測樣品的EAG反應相對值,V1和V2代表待測樣品刺激前、后2次石蠟油引起EAG反應相對值。

1.4 室內嗅覺選擇行為反應測定

根據 EAG 測試結果,選擇反應強烈的4種揮發性化合物,配制成濃度分別為10, 100, 250, 500和750 μg/μL的供試藥劑,以石蠟油為對照,利用Y型嗅覺儀進行室內單組分行為反應。Y型嗅覺儀由玻璃管制成,主臂長為25 cm,側臂均為15 cm,兩側臂夾角為60°。用自制紙板箱將Y型嗅覺儀包圍,紙板箱后部設置有昆蟲入口和觀察口,在紙箱頂部放置一個7 W的LED燈管(32 cm長),保證Y型嗅覺儀兩臂光照相同。將Y型嗅覺儀、味源瓶、氣體流量計、蒸餾水加濕瓶、活性炭過濾瓶和大氣采樣儀利用硅膠管依次連接,將氣體流速控制在250～300 mL/min。測試前,分別將滴有10 μL待測樣品和石蠟油的濾紙條(50 mm×40 mm)置于兩個味源瓶中。每測試30 min更換一次味源瓶中和對照瓶的濾紙條。每次將綠豆象成蟲釋放到主臂的同一起始位置,讓其自由爬動,通過觀察口觀察其行為。每次釋放1頭成蟲,當綠豆象成蟲第1次爬過 Y 型嗅覺儀的左臂或右臂超過1/3處并停留30 s以上視為作出選擇;若試蟲5 min后沒有做出選擇,則視為無反應。每個處理綠豆象雌、雄成蟲各20頭,試蟲不重復使用,雌雄成蟲分開測試,防止性別之間產生影響。每個處理重復3次。

根據單組分室內行為反應結果,剔除對綠豆象具有驅避效果的組分,將其余3種具有引誘作用的化合物進行混配試驗,混配時根據單體化合物在GC-MS結果中所占的比例將3種化合物配成三元、二元混合物,其中每個單體化合物的含量按照比例放大10, 100, 250, 500和1 000倍進行觸角電位實驗篩選(另文發表),結果顯示放大100和250倍時反應較強烈,因此選擇放大200倍作為每個單體化合物的含量,混配方案如表2。

表2 引誘劑配方的組分及含量

Y型嗅覺儀的測試中行為反應的計算公式:反應率(%)=[(選擇味源總蟲數+選擇對照總蟲數)/測試總蟲數]×100;選擇率(%)=[選擇味源總蟲數/(選擇味源總蟲數+選擇對照總蟲數)]×100。

1.5 數據分析

利用SPSS 24.0軟件對實驗數據進行統計分析;利用獨立樣本t檢驗分析兩種豆子中同一揮發物相對含量的差異性;采用單因素方差分析結合Duncan氏多重比較法分析同一物質不同濃度之間的EAG反應相對值的差異顯著性;利用χ2檢驗分析成蟲選擇氣味源和選擇對照的差異顯著性。

2 結果

2.1 紅豆和綠豆種子揮發物分析鑒定

GC-MS分析結果顯示,紅豆和綠豆兩種豆類種子中共有揮發物18種(相對含量均>0.5%),主要包含4種醇類、3種醛類、3種烷烴類、2種芳香烴類、2種酮類、1種酯類、1種烯烴類、1種萘和1種肟,共有成分在兩種豆子中的相對含量均沒有顯著差異(P>0.05)(表3)。

表3 紅豆和綠豆種子共有揮發性化合物成分及相對含量

表中數據為平均值±標準誤;同行數據后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05,t檢驗);2種樣品相對含量均低于0.5%的化合物未列入表中。Data in the table are mean±SE. Different small letters following the data in the same row indicate significant difference (P<0.05,t-test). The compounds present in the two samples with a relative content of less than 0.5% are not listed in the table.

2.2 綠豆象成蟲EAG反應

綠豆象成蟲觸角對紅豆和綠豆種子中8種共有揮發物的EAG反應見表4。從表中可以看出甲基庚烯酮、己醛、正壬醛和癸醛均能引起綠豆象強烈EAG反應,而正癸烷、反式石竹烯、2-甲基萘和環己基苯引起的EAG反應相對微弱。綠豆象雌成蟲在濃度為500 μg/μL甲基庚烯酮的刺激下EAG反應相對值最大,為1.620 mV,顯著高于其他低濃度引起的EAG反應相對值(P<0.05),但與750 μg/μL時引起的EAG反應相對值差異不顯著(P>0.05),而雄成蟲在750 μg/μL時EAG反應最為強烈,最大值為1.366 mV,極顯著高于10 μg/μL時引起的EAG反應相對值(P<0.01),但與其他濃度引起的EAG反應相對值差異不顯著(P>0.05);雄成蟲對750 μg/μL己醛的EAG反應相對值最大,為2.020 mV,但雌成蟲達到最大EAG反應相對值的濃度為500 μg/μL, 最大值為1.380 mV。癸醛和正壬醛在濃度750 μg/μL均能引起綠豆象雄成蟲表現出強烈EAG反應。在500 μg/μL時,雌成蟲對癸醛和己醛的EAG反應相對值達到最大,繼續增加濃度達到750 μg/μL時EAG反應相對值卻有所減小。

表4 綠豆象雌雄成蟲對紅豆和綠豆種子不同濃度的8種揮發性化合物的觸角電位(EAG)反應

2.3 綠豆象成蟲對揮發物的室內嗅覺選擇行為反應

2.3.1綠豆象成蟲對單組分物質的嗅覺選擇行為反應:選取EAG反應相對值較高的揮發物對綠豆象進行室內行為反應,結果見圖1所示。4種化合物不同濃度對綠豆象雌雄成蟲的行為反應存在差異,在濃度為10和100 μg/μL時,4種化合物對綠豆象兩性成蟲均無明顯定向作用。500和750 μg/μL時甲基庚烯酮對綠豆象雌、雄成蟲有顯著的引誘作用,而250 μg/μL時僅對雌成蟲表現出顯著的引誘作用(P<0.05)(圖1: A, B);癸醛在濃度為250, 500和750 μg/μL時對綠豆象雌成蟲的引誘效果表現出顯著差異(P<0.05),僅在濃度為750 μg/μL時對綠豆象雄成蟲有顯著的引誘效果(P<0.05)(圖1: C, D); 500 μg/μL正壬醛對綠豆象雌、雄成蟲均有顯著的引誘作用(P<0.05),但是,在濃度為250 μg/μL時僅極顯著地吸引綠豆象雌成蟲(P<0.01),在濃度為750 μg/μL時極顯著地吸引綠豆象雄成蟲(P<0.01)(圖1: E, F);己醛對綠豆象兩性成蟲具有明顯的驅避效果,且濃度越高驅避效果越明顯(圖1: G, H)。

圖1 綠豆象成蟲對不同濃度4種揮發性化合物的嗅覺行為反應率

2.3.2綠豆象成蟲對多組分物質的嗅覺行為反應:多組分物質的室內行為反應表明,配方A, B和D對綠豆象兩性成蟲的引誘蟲數均顯著高于對照(石蠟油)(P<0.05),其中配方B有極顯著的引誘效果(P<0.01),而配方C與對照的引誘作用無顯著差異(P>0.05)(圖2: A, B)。綠豆象雌雄成蟲對4個配方的反應率均高于80%,其中綠豆象雌成蟲對配方B的選擇率為90.51%,顯著高于對其他配方的選擇率(P<0.05),而綠豆象雄成蟲對配方B的選擇率為75.88%,顯著高于配方A和C(P<0.05),但與對配方D的選擇率無顯著差異(P>0.05)(表5, 6)。

圖2 綠豆象雌(A)雄(B)成蟲對不同配方的嗅覺行為反應

表5 綠豆象雌成蟲對4種配方的嗅覺行為反應

表6 綠豆象雄成蟲對4種配方的嗅覺行為反應

3 討論

本研究對綠豆和紅豆種子揮發物進行了分析鑒定,在兩種豆類的共有揮發物中篩選獲得甲基庚烯酮、正壬醛、癸醛和己醛4種物質均能引起綠豆象強烈電生理反應,且總體隨濃度增大反應呈增強趨勢,說明 4種物質對綠豆象成蟲有引誘或驅避活性(表4)。在這4種揮發性化合物中有3種屬于醛類化合物,分別是己醛、壬醛和癸醛,研究表明3種醛類物質均能引起多種昆蟲的電生理反應,據唐睿等(2012)報道,壬醛和己醛能夠引起重大林業入侵害蟲美國白蛾Hyphantriacunea雌、雄成蟲較高電生理反應;相會明等(2020)研究發現梨小食心蟲雌蛾對壬醛的 EAG 反應值較高;又如王延來等(2020)發現正癸醛能夠引起花椒窄吉丁Agriluszanthoxylumi雌蟲和雄蟲最大的 EAG 反應值,以上研究與我們研究結果一致。在兩種豆類揮發物中同時存在且相對含量較高的甲基庚烯酮同樣能夠引起綠豆象成蟲較高的 EAG反應,龍登隆(2019)也研究發現該物質能夠引起中華蜜蜂Apiscerana強烈電生理反應,且隨著濃度增高而增強;董喆(2011)從亞洲小車蝗Oedaleusdecorusasiaticus的末齡蝗蝻體表揮發物中提取到甲基庚烯酮,并對其引誘效果研究發現,該物質對雄性幼成蟲均具有顯著吸引作用。另外,本研究還發現綠豆象雌成蟲相對于雄蟲 EAG 反應值更高,推測可能是雌蟲需要尋找適合產卵場所以滿足自身及后代營養需求,對植物揮發物化學信息更加敏感,而性信息素才會對雄蟲有強烈的引誘作用,這種差異在鞘翅目(Ballhornetal., 2013)、雙翅目(Hern and Dorn, 2004)和鱗翅目(Corneliusetal., 2001)等植食性昆蟲上均有報道。

昆蟲的觸角電位反應僅表示昆蟲對揮發性物質的敏感程度,行為實驗才能確定揮發性物質的具體作用(Cooketal., 2007)。本研究行為趨性試驗結果表明,綠豆象對甲基庚烯酮、正壬醛和癸醛有明顯的引誘作用,對己醛具有顯著驅避效果(圖1)。類似的研究報道也較多,如陳艷萍等(2016)通過行為試驗發現正壬醛對槐綠虎天牛Chlorophorusdiadema有明顯的引誘作用;賈小儉等(2017)發現壬醛對甘薯蟻象Cylasformicarius有較好的引誘作用;劉永梅等(2020)研究表明癸醛能夠顯著引誘飛蝗Locustamigratoria雌蟲;毛祥忠等(2020)發現己醛對西藏簇角纓象天牛Caciacretifera雌、雄成蟲有驅避作用。以上研究結果說明這些醛類化合物是屬于廣譜性的引誘或驅避物質,在眾多植食性昆蟲的寄主定位過程中發揮重要作用。

昆蟲一直生活在多種氣味背景的化學環境中,對特定組合的植物揮發物感受相對于單一化合物的感受更加敏感(蔡曉明等, 2020)。在室內多組分行為反應試驗中,配方A, B和D相比較單一組分都表現出顯著的引誘效果,其中配方B對綠豆象的引誘效果最佳(圖2; 表5,6)。這對研究開發綠豆象植物源引誘劑有一定的參考價值,但今后還需進行倉儲引誘實驗進一步驗證和篩選。另外,本研究證實癸醛是具有引誘活性的單組分物質,但在有癸醛的配方中引誘效果不佳,可能的原因需要進一步分析。

研究表明寄主植物揮發物中微量的化學物質也可能對植食性昆蟲的行為起關鍵作用(Pieroetal., 2008),本研究只選擇含量較高的揮發性化合物進行測試,可能有一些含量較低但非常重要的組分未被發現,在今后的研究中將針對這些微量物質進行篩選,同時結合實驗室前期篩選的豆莢揮發物活性物質對綠豆象進行聯合倉儲引誘實驗,為開發綠豆象行為調控劑提供理論依據。