細菌外膜囊泡應用于腫瘤治療*

王云鋒 莊婉茹 馬憲彬 聶偉東 謝海燕

（北京理工大學生命學院，北京 100081）

細菌外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMVs）是一種由細菌分泌的脂質納米囊泡。不同于最初認為的細菌裂解產物，OMVs現今更多被看作一種獨特的細菌分泌物，細菌可通過分泌OMVs的方式維持其外膜穩定性或排出有害物質。不同細菌間能對OMVs進行識別與招募以獲取遺傳信息和營養物質［1-2］，此外，細菌通過分泌OMVs甚至能調節宿主免疫反應以逃逸免疫監測［3-6］。作為細菌分泌產物，OMVs表面富含細菌抗原，這使其可作為疫苗用于防治細菌感染［7-8］。除了激起針對細菌的適應性免疫反應外，OMVs還可激活廣泛的先天性免疫或作為佐劑增強機體對其他抗原的免疫反應，特別是促進抗腫瘤免疫反應的發生。

癌癥是現今死亡率最高的疾病之一，攻克癌癥將極大促進人類平均壽命的延長。由于腫瘤異質性高且易于復發與轉移，其治療問題一直是醫療領域的難點。目前臨床上已應用多種手段治療腫瘤，如手術切除、放射治療、化學治療、光動力治療（photodynamic therapy，PDT）與免疫治療等，它們各有優劣，適用患者類型也各不相同。盡管每年全球都會進行大量的基礎研究、藥物開發與臨床試驗以期攻克腫瘤治療，然而抗腫瘤藥物對非腫瘤組織的毒性始終是一個難以回避的問題。為此，開發具有腫瘤靶向性質的納米體系用于遞送抗腫瘤藥物具有很高的研究價值。通過納米體系對腫瘤組織的主動或被動靶向蓄積使藥物富集于腫瘤組織，提高了藥物的利用率并降低了藥物副作用。而細菌衍生的OMVs不僅具有一定腫瘤靶向性，可用于抗腫瘤藥物的遞送，其豐富的病原體相關分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）還可增強免疫反應以協同治療腫瘤。

1 OMVs的生物發生機理

與革蘭氏陽性菌不同，革蘭氏陰性菌有兩層結構高度異質的膜：細菌質膜與細菌外膜。兩層膜間為細菌周質空間，細菌細胞壁位于其中。位于細胞壁外層的外膜是革蘭氏陰性菌的標志性結構。與典型的生物膜不同，雖然同樣是脂質雙分子層結構，但細菌外膜具有極大不對稱性：其內葉主要由磷脂組成，而外葉則含有大量的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）。此外，外膜中含有兩大類蛋白質：跨膜的桶狀外膜蛋白（outer membrane proteins，OMP）與氨基端嵌入膜內的脂蛋白。細菌外膜的存在不僅為革蘭氏陰性菌提供了一個化學屏障，還為細菌提供了一部分機械支撐。革蘭氏陰性菌對洗滌劑和其他疏水毒素的抵抗力主要得益于外膜上LPS分子間的強橫向作用力及其飽和?；?，它們在維持細菌外膜結構穩定的同時極大阻礙了疏水分子的通過［9］。同時，外膜中部分脂蛋白通過與肽聚糖層的共價結合將細菌外膜與細胞壁連接，例如大腸桿菌外膜中最豐富的脂蛋白布勞恩脂蛋白（Braun’s lipoprotein，Lpp）的羧基端可與肽聚糖共價結合，這使得細菌外膜能承擔一部分機械力以彌補革蘭氏陰性菌肽聚糖層較薄的缺點［10-11］。

作為直徑在20~250 nm之間的天然脂質納米囊泡，OMVs始于細菌外膜凸起，因此其膜成分和細菌外膜類似，主要由磷脂、LPS和OMP組成，而其囊腔則富含細菌周質與胞質成分，如肽聚糖、蛋白質、核酸等。OMVs最早發現于1966年，研究人員觀察到在沒有發生細胞裂解的情況下，賴氨酸依賴的突變大腸桿菌（E. coli）12408產生了膜包被的“小球”［12］。次年，Chatterjee等［13］通過電鏡觀察到霍亂弧菌（Vibrio cholerae）的外膜出現不同程度的膨大現象，隨著膨大明顯隆起，其頸部被掐斷形成小泡釋放。1976年，Hoekstra等［14］發現E. coliJC411產生的囊泡含有脂質與蛋白質；1982年，Katsui等［15］發現E. coliW3110在55℃加熱下細胞表面釋放含有脂質、蛋白質和LPS的膜囊泡，成分類似于細菌外膜。近年來，隨著對OMVs的研究日益增多，雖尚不明確OMVs產生的分子機制，但一些已發現的遺傳和生化證據可以幫助人們探索這一過程。

1.1 蛋白質與OMVs的產生

作為OMVs的重要組成成分，蛋白質的缺乏或功能異?？赡艽龠MOMVs的分泌。在一種OMVs產生模型中，脂蛋白連接的缺失導致細菌外膜與肽聚糖層局部分離，分離區域的外膜持續生長致使外膜向外凸起并最終以OMVs的形式釋放［16］。這種模型的提出基于早期的觀察結果：外膜囊泡中脂蛋白較少且大部分不與肽聚糖共價結合［14，17］。1976年，Weigand等［18］揭示了OMVs生物發生的第一個分子證據：缺乏Lpp的LkyD缺陷型鼠傷寒沙門氏菌外膜鼓起大囊泡，這表明連接肽聚糖層與外膜的脂蛋白缺乏直接導致細菌外膜凸起（圖1a）。其后在1978年Suzuki等［19］在大腸桿菌lpo突變體上也觀察到了類似現象。與Lpp類似，細菌外膜蛋白OmpA也能連接肽聚糖層與外膜，因此多種OmpA突變型細菌表現出OMVs產量提升［20-24］。近年來，研究人員發現，細菌外膜結構重要的基因突變均會導致OMVs產量的提升，這些基因有的與外膜組成有關，有的與肽聚糖的生長交聯有關，有的則負責在外膜與肽聚糖間形成橋梁［25］。這些證據都證明了細菌外膜與肽聚糖層的分離有利于細菌OMVs的釋放。

Fig.1 OMVs biogenesis model圖1 OMVs生物發生模型

1.2 LPS與OMVs的產生

細菌LPS通常由疏水的類脂A、核心寡糖與O抗原組成［26］。作為細菌外膜主要成分之一，LPS不僅在細菌外膜屏障功能中發揮核心作用［27-28］，還是細菌表面最豐富的抗原。但由于帶負電的LPS間具有靜電排斥力，因此外膜中負電LPS的含量上升也會導致細菌外膜的凸起最終致使OMVs的釋放（圖1b）［29-31］，類似的，基因突變導致的LPS電負性增強也會導致細菌外膜膜曲率失衡，隨后致使外膜凸出并產生OMVs［32］。同時，由于OMVs中LPS組成的不同會導致與LPS相互作用的特定蛋白質發生含量變化，因此LPS電負性的改變不僅會影響OMVs的產生還會影響OMVs中蛋白質的包裝，已有研究表明，O抗原和核心寡糖的變化均會對OMVs產生影響［25，31］。

1.3 磷脂與OMVs的產生

同為細菌OMVs主要成分磷脂也會影響OMVs分泌。大腸桿菌外膜中磷脂含量從高到低依次為磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油和心磷脂［33］，而大腸桿菌OMVs具有與外膜相似的磷脂組成［34］。革蘭氏陰性菌的磷脂在質膜與外膜內葉間進行轉運，其中磷脂從外膜內葉到質膜的易位被稱為逆行轉運［35］。在逆行運輸中，脂質不對稱維持系統（maintenance of lipid asymmetry，Mla）將外膜外葉中的錯位磷脂運輸到質膜以維持外膜不對稱性。其中，MlaA脂蛋白與外膜OmpC蛋白的相互作用將錯位磷脂轉給MlaC蛋白，然后遞送到位于質膜中的MlaFEDB復合物，并最終整合到質膜上［36-37］。因此，Mla途徑蛋白質表達減少或缺失會導致細菌外膜外葉產生磷脂積累，由此帶來的外葉不對稱擴張會引發細菌外膜向外凸起，進一步的磷脂富集導致細菌外膜萌芽，最終夾斷形成OMVs（圖2）。在這種OMV產生模型中，細菌通過釋放OMVs維持其外膜不對稱性，進而維持外膜屏障功能［38-40］。

Fig.2 The wrong accumulation of phospholipids in bacterial outer membrane leads to the production of OMVs［39］圖2 細菌外膜中磷脂錯誤累積導致OMVs產生［39］

因此，OMVs的生物發生是一個復雜的過程，對這一過程的機制解析有利于對細菌分泌OMVs這一行為進行調控，包括提高產量、調整組分構成甚至控制OMVs粒徑大小，這將極大推動OMVs的實際應用。

2 OMVs對免疫系統的調節作用

作為一種獨特的細菌分泌物，OMVs在體液中的出現往往意味著細菌感染的發生，因此宿主模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）識別OMVs上PAMPs后會激發一系列下游免疫應答，導致促炎細胞因子白介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、IL-8和抗菌肽的產生，最終清除入侵機體的病原微生物［41-44］。本節通過OMVs對不同免疫細胞的調節來綜述OMVs對機體免疫系統的調節作用。

2.1 中性粒細胞

作為先天免疫系統的重要組成成分，中性粒細胞是抵御細菌感染的第一道防線，其能夠迅速識別、攻擊并消除大多數病原微生物［45-47］。其中，已有研究表明中性粒細胞在OMVs引發的免疫反應中發揮重要作用。在OMVs的刺激下，血管內皮細胞能以Toll樣受體4（Toll-like receptors，TLR4）和NF-κB依賴的方式釋放IL-8/CXCL1招募中性粒細胞［48］，中性粒細胞受OMVs刺激釋放促炎細胞因子（如TNF-α、IL-1β）與趨化因子導致炎癥的發生（圖3a）［49］。但值得注意的是，有研究表明低濃度LPS會誘導中性粒細胞在上調其趨化因子受體CXCR4表達的同時釋放中性粒細胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps，NET），這可能與過敏性哮喘的發生有關［50］；而由細菌外膜衍生的OMVs富含LPS，因此極大可能和LPS有著類似的效果。此外，部分OMVs可以抑制中性粒細胞的功能以幫助其親本細菌逃避中性粒細胞的攻擊［5］。例如，泌尿致病型大腸桿菌產生的OMVs可以將具有生物活性的1型細胞毒性壞死因子（cytotoxic necrotizing factor 1，CNF1）遞送到中性粒細胞內以抑制其趨化性和吞噬功能，最終降低中性粒細胞的抗菌活性?？傊?，已有研究表明，攜帶大量PAMPs的OMVs可以招募并激活中性粒細胞從而誘導抗菌免疫的發生，但OMVs攜帶的毒力因子也可能會抑制中性粒細胞的免疫活性以使親本細菌逃逸免疫監測。

Fig.3 Regulatory effects of OMVs on immune cells圖3 OMVs對免疫細胞的調節作用

2.2 巨噬細胞

與中性粒細胞類似，OMVs可以通過激活巨噬細胞受體來調節免疫反應。一方面OMVs可以激活巨噬細胞表面的TLR2以誘導有效的促炎反應，促進巨噬細胞分泌IL-6、IL-8、TNF-α和IL-1β（圖3b）［42-43，51］。另一方面，被巨噬細胞吞噬后，OMVs可以激活巨噬細胞胞內PRR受體引發炎性反應。研究發現，不同來源的細菌OMVs均可以激活巨噬細胞中的炎性小體信號轉導途徑誘導炎癥因子的釋放［52-54］。其中，牙周病原體OMVs可誘導強烈的NF-κB活化并刺激促炎細胞因子反應［53］，而鞭毛細菌OMVs則可以將細菌鞭毛蛋白遞送到巨噬細胞胞質中觸發NLRC4介導的典型炎癥小體活化［54］。通過將LPS遞送至巨噬細胞胞質，OMVs還可引發小鼠胱天蛋白酶（Caspase）-11介導的非典型炎癥小體反應［55-58］。其具體作用機制為，OMVs首先通過LPS激活TLR4與IFN-I信號通路，進而誘導鳥苷酸結合蛋白（guanylate-binding protein，GBPs）的產生，產生的GBPs與胞質中OMVs表面LPS結合促進LPS與炎性Caspase-11的相互作用［56，58］，活化的Caspase-11裂解GSDMD得到的氨基端片段促進Caspase-1依賴的細胞焦亡與NLRP3依賴的非典型炎癥小體的激活［56，58-59］。而在人源細胞中，研究發現，OMVs上LPS主要通過Caspase-5（Caspase-11的人類同系物）激活炎癥小體通路［60］。

2.3 樹突狀細胞（DC）

作為已知功能最強且惟一能活化初始T細胞的專職抗原提呈細胞，樹突狀細胞（dendritic cells，DC）是啟動、調控和維持免疫應答的中心細胞。DC可通過經典的主要組織相容性復合物（MHC I和MHC II）呈遞蛋白質類抗原、通過非經典的CD1分子呈遞脂類抗原。由DC呈遞的抗原可激活抗原特異性T淋巴細胞，包括CD8 T細胞、CD4 T細胞與NK T細胞，其誘導激活抗原特異性T細胞的能力遠超其他抗原提呈細胞［61］。早在2007年，研究人員就發現，OMVs能誘導DC分泌促炎因子TNF-α和IL-12，同時促進DC表達更高的抗原呈遞分子MHC-II與共刺激分子CD86（圖3c）；此外，OMVs可以作為佐劑，通過激活DC增強抗原特異性的B細胞與T細胞免疫反應［62］。OMVs對DC的激活主要依賴于DC TLR4通路的激活［63］。

同時，由于DC是適應性免疫反應的中心細胞，疫苗接種后需要DC將抗原提呈給T細胞或B細胞才能順利激活抗原特異性免疫反應，而OMVs即可作為佐劑激活DC又攜帶親本細菌的特異性抗原，因此以OMVs作為疫苗誘發適應性免疫抵抗細菌感染的研究由來已久。早在1987年，第一種基于OMVs的疫苗就在古巴獲準用于血清型腦膜炎奈瑟菌的治療［8］；隨后OMVs疫苗在挪威、新西蘭等地被成功用于預防B族腦膜炎球菌感染［7，64-66］；OMVs疫苗對多種病原體都可產生預防效果，包括霍亂弧菌、肺炎克雷伯菌等［67-70］。同時，多項動物實驗證明，以OMVs作為佐劑的疫苗能誘導比傳統疫苗制劑更強的免疫反應［71-75］。

3 OMVs的修飾改造策略

作為細菌分泌的納米囊泡，OMVs具有易于修飾改造的特性，這使其在抗腫瘤研究中有著巨大的應用前景。對OMVs進行修飾改造不僅可以加強其腫瘤靶向性、減弱其全身毒性還能根據需要賦予其特定功能。對OMVs的修飾改造根據修飾時間可初步分為分泌前修飾與分泌后修飾。

3.1 OMVs的分泌前修飾

與人工合成的脂質體等納米載體相比，OMVs制備簡單，且通過對其親本細菌進行功能化改造即可改變其分泌的OMVs功能?？煽紤]以基因工程、代謝工程或親本細菌膜工程的方法對親本細菌進行功能化以實現OMVs的分泌前修飾。

OMVs的基因工程策略大多基于蛋白質或融合蛋白在細菌中的轉基因表達，這些蛋白質或融合蛋白往往跨膜結構域以保證目標蛋白在OMVs中的富集。早在2004年，研究人員就已成功利用基因工程向OMVs中摻入了外源蛋白［76］。其中，直接向大腸桿菌導入的異源外膜蛋白Ail（一種來自小腸結腸炎耶爾森菌（Yersinia enterocolitica）的外膜黏附素/侵入素）成功摻入大腸桿菌外膜，且在不影響大小的情況下增加了OMVs產量。對于不能定位于細菌外膜的蛋白質，可通過雙精氨酸蛋白轉運系統（twin arginine transporter system，Tat）將加有Tat信號序列的蛋白質轉入周質空間，且Tat信號序列可在周質空間被切除，研究人員利用這種方法成功將GFP蛋白和其他周質蛋白一起裝進了OMVs中?；蚬こ痰膽檬筄MVs在遞送蛋白質類分子方面相比于人工合成的納米載體或動物細胞的胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）極具優勢。這些異源蛋白或作為周質蛋白包裹在OMVs中，或通過與外膜蛋白（ClyA、OmpC等）連接表達在OMVs外膜上。其中，表達在OMVs腔體內的蛋白質要么本就是細菌周質蛋白［77-78］，要么就需要利用細菌轉運體系將目標蛋白從胞質轉運至周質空間［72，76，79］；對于表達在OMVs膜表面的蛋白質，根據需求的不同可使目標蛋白處于OMVs膜外葉［80-85］或內葉［86-87］。對OMVs的基因工程化改造可使其獲得多種功能。例如：通過基因工程敲除lpxL1基因在保留OMVs免疫活性的同時減輕了LPS毒性［88-90］；表面表達ClyA-Ag-Fc（Ag為腫瘤抗原）的OMVs作為腫瘤疫苗具有顯著的抗腫瘤效果［83］；表面表達靶向多肽LyP1提高了OMVs的腫瘤靶向能力，使其腫瘤內化率提升了10%［80］；腔內攜帶重組人腫瘤壞死因子相關細胞凋亡誘導配體（recombinant human tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）的OMVs則具有誘導黑色素瘤凋亡的能力［91］；表面表達捕獲因子SpC和SnC的OMVs可即時捕獲用SnT或SnP標簽標記的腫瘤新抗原，從而快速構建個性化抗腫瘤納米疫苗［85］。

通過干擾內源性代謝途徑對親本細菌進行代謝工程改造，也能賦予OMVs新的成分與功能。早在20世紀50年代，研究人員就通過將硒代甲硫氨酸加入到無甲硫氨酸的培養基中使大腸桿菌合成了含硒的蛋白質［92］。通過這種方法，研究人員向細菌或動物細胞蛋白質中摻入了各種生物正交基團，例如以甲硫氨酸替代物高丙炔基甘氨酸、高烯丙基甘氨酸和疊氮高丙氨酸向蛋白質中高效引入了炔烴、烯烴和疊氮化物［93-94］。包括腫瘤細胞在內的大量細胞會用唾液酸化聚糖修飾細胞表面，且在腫瘤外泌體中檢測出特定的含唾液酸的糖蛋白［95］，基于此，研究人員將腫瘤細胞與可以代謝為唾液酸的四?；疦-疊氮乙酰甘露糖胺（N-azidoacetylmannosaminetetraacylated，ManNAz）共培養，獲得了ManNAz修飾的EVs［96］。類似的，將四?；疦-疊氮乙酰半乳糖胺加入細菌培養基中，可通過糖綴合將疊氮基團（N3）引入細菌外膜，進而得到N3修飾的OMVs，N3與二苯并環辛炔基團（dibenzylcyclooctyne，DBCO）間的點擊化學反應可使連接在DBCO上的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）包覆于OMVs表面以掩蔽其免疫原性［82］。此外，細菌可通過OMVs的分泌緩解環境毒性，基于此，研究人員通過向大腸桿菌培養基中添加其無法代謝的磁性氧化鐵納米顆粒（magnetic iron-oxide nanoparticles，MNPs），最終得到了包裹著MNPs的OMVs，這不僅可以利用磁性吸附顯著提高OMVs的收貨量，還可以得到具有磁靶向能力的磁性OMVs［97］。相比于基因工程，代謝工程操作簡單，但同時代謝工程很難控制偶聯位點的特異性與效率。

除上述兩種策略，直接對親本細菌進行膜工程化也可能對OMVs膜進行修飾。研究人員發現，使用疊氮修飾的脂質體與親本細胞進行膜融合，能得到疊氮修飾的EVs以便利用點擊化學對其進行功能化［98］。與此策略相似，膜工程技術也被應用于細菌膜的改造。早在2000年，研究人員就通過脂質體與細菌膜融合的方式將妥布霉素遞送進細菌胞內克服了細菌耐藥性［99］，此后膜工程化技術廣泛應用于抗菌研究［100-102］。因此，類似于細胞衍生EVs的修飾策略，將脂質體與細菌進行膜融合可將脂質體上攜帶的功能性脂質或其他膜相關分子轉移到細菌膜上，最終得到功能修飾的OMVs。

3.2 OMVs的分泌后修飾

與分泌前修飾相比，分泌后修飾雖然需要更長的時間與進一步的純化步驟，但其適用面更廣，可用于各種分子與配體的修飾。另外，由于細菌菌株與菌種間差異較大，對其膜表面蛋白的研究遠不如哺乳動物細胞清晰［103］，這不可避免地給基因工程或代謝工程修飾帶來了一定阻礙，而分泌后修飾則避開了這個問題。OMVs的分泌后修飾多基于物理相互作用或化學改性的方法，部分修飾還會與分泌前修飾結合。

OMVs的物理修飾主要分為膜融合與脂質插入兩種方法。其中膜融合的對象可分為人工合成的脂質體與生物膜囊泡兩類。雖然有一些問題需要克服（包括如何提高脂質體與OMVs的融合效率以及如何分離純化融合產物），但是，與能夠大批量定制生產的脂質體融合來對OMVs進行表面改性是一種頗有前景的方法。熒光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）常被用于檢測膜融合是否成功，若成功，則脂質體膜中含有的互補配對親脂性熒光分子將被稀釋導致供體熒光可被檢測［104］。研究人員通過反復凍融法實現了脂質體與EVs的融合，并通過FRET實驗進行了驗證［105］；而PEG 8000誘導的膜融合則使超過60%的膜成分與可溶性內容物成功從脂質體轉移到EVs中且保留了EVs原有的內容物［106］。與脂質體融合既不影響OMVs完整性，又可根據需要對脂質體進行定制以對OMVs進行個性化表面修飾。除了脂質體，膜融合技術還可整合兩種或多種生物膜以獲得具有所需特性的雜化膜囊泡［107］?；贠MVs優秀的佐劑性，已證明在OMVs表面修飾腫瘤抗原以誘導抗腫瘤免疫反應是一種行之有效的策略，而通過膜融合技術將腫瘤細胞膜與OMVs融合得到的具有腫瘤全抗原的疫苗可引發比單一抗原更強的免疫反應。例如，通過超聲和擠壓將黑色素瘤膜囊泡與大腸桿菌或沙門氏菌的OMVs融合，得到的雜合囊泡繼承并整合了兩種母體成分的免疫功能，不僅有效激活了DC免疫反應，還誘導了基于細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）的強大抗腫瘤特異性免疫，表現出出色的腫瘤預防與治療效果［108-110］。類似的，與植物類囊體膜融合的OMVs不僅繼承了類囊體膜的光動力效果以有效殺傷腫瘤細胞，還表現出增強的免疫刺激與免疫重編程能力，PDT釋放的腫瘤抗原與具有佐劑性質的融合囊泡一起誘導了全身性抗腫瘤免疫反應，這不僅進一步對原位腫瘤產生了殺傷還有效抑制了腫瘤轉移的發生［111］。

脂質插入是通過與PEG-脂質膠束共孵育將PEG化的脂質插入囊泡中，這項技術最初被用于對脂質體進行表面功能化。其中PEG-脂質膠束中的脂質多指磷脂和膽固醇，二者區別在于插入條件與插入后穩定性不同。而由于相變溫度較高，磷脂插入需要更高的活化能，膽固醇插入溫度更適用于生物囊泡，但其插入穩定性較差［112］。盡管如此，脂質插入已被用于對生物囊泡進行功能化修飾，因為比起與脂質體膜融合，脂質插入可以使功能分子不必暴露于常規脂質體合成的有機溶劑中。研究人員在EVs表面插入了表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）抗體-PEG-磷脂，其中EGFR抗體的修飾增強了過表達EGFR的腫瘤細胞對EVs的攝取，而PEG的修飾則延長了EVs的血液循環時間［113］。在這項研究中，40℃是平衡插入效率與穩定性后的最佳溫度，雖然60℃能獲得更高的插入效率，但會對EVs造成損傷。類似的，37℃條件下共孵育3 h將甘露糖-PEG-磷脂插入EVs表面，基于DC表面甘露糖受體對EVs表面的甘露糖的特異性識別成功增加了DC對EVs的攝取，這增強了EVs在小鼠引流淋巴結處的蓄積［114］。與磷脂類似，用膽固醇修飾siRNA能使其插入EVs中，進而利用EVs的藥物遞送能力實現了對特定基因（如亨廷頓基因、CD45基因或RNA結合蛋白HuR基因等）的沉默［115-117］。與EVs類似，OMVs同樣能用脂質插入技術進行修飾。例如，與二硬脂?；字Ｒ掖及罚?,2-dioctadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，DSPE）-PEG-生物素或DSPE-PEG-葉酸膠束的共孵育成功實現了對OMVs的表面修飾。但值得注意的是，區別于動物細胞，脂質插入技術僅能對OMVs進行修飾，并不能修飾細菌外膜［118］?？赡艿脑蚴羌毦饽ご罅刻腔闹|屏蔽了細胞表面，而高曲率的OMVs往往有著脂質堆積缺陷便于插入［119］。脂質插入技術雖然可以避免功能分子暴露于脂質體合成過程中的有機試劑，但穩定性不足與插入效率低等問題仍需解決。

對OMVs的化學改性主要通過功能基團與OMVs膜組分間形成化學鍵來實現。例如，OMVs表面的酸性殘基可與Ca2+發生螯合反應，并作為成核位點促進磷酸鈣成核礦化，最終磷酸鈣晶體覆蓋OMVs表面，礦化的OMVs生物毒性顯著降低，克服了血液循環中OMVs的抗體依賴性清除，并且酸敏感的磷酸鈣殼可以在腫瘤酸性微環境中溶解釋放OMVs抑制腫瘤生長［120］。此外，研究人員利用OMVs表面蛋白上的氨基與活性酯（NHS）的反應抗原將馬來酰亞胺（maleimide，Mal）-PEG4-NHS接枝到OMVs表面得到OMV-Mal，OMV-Mal能利用Mal與蛋白質形成穩定的硫醚鍵（圖6a），這使OMVs具備了抗原捕獲的功能［121］。在腫瘤原位捕獲抗原的OMVs能作為腫瘤原位疫苗激活DC，誘導強效的抗腫瘤免疫反應。類似的，Peng等［91］利用棕櫚酸將αVβ3整合素特異性肽RGP與OMVs進行偶聯，實現了對表達αVβ3的侵襲性黑色素瘤的特異性靶向。除了OMVs表面自帶的可結合位點，還可利用分泌前修飾向OMVs添加結合位點。例如，研究人員利用基因工程技術構建了一種基于OMVs的多功能疫苗平臺，該平臺通過由標簽/捕獲蛋白對構成的即插即顯示系統來快速在OMVs表面展示多種腫瘤抗原［85］。通過基因工程技術在OMVs表面表達了捕獲蛋白SpC/SnC，捕獲蛋白可與抗原上連接的標簽蛋白SpT/SnT形成共價連接，從而將抗原展示在OMVs表面（圖4）。此外，也有研究利用代謝工程向OMVs表面引入可與DBCO發生點擊化學反應的N3，然后通過化學修飾將DBCOPEG/Se接到OMVs表面，PEG對OMVs免疫原性的掩蔽增加了其靜脈注射的安全劑量［82］。

Fig.4 Schematic illustration of OMVs system for antigen display［85］圖4 用于抗原展示的OMVs平臺［85］

基于上述對OMVs的修飾改造方法已得到廣泛驗證，目前的修飾方法中基因工程、膜融合與化學修飾是最具潛力的3種方法?；蚬こ绦揎棾杀镜?、穩定性高、無需額外的分離提純步驟有利于大規模生產，但基因工程局限于蛋白質或多肽，不適用于小分子或脂類的修飾；膜融合效率高、能兼顧表面修飾與載藥，然而由于膜結構的差異，與OMVs的膜融合較難；化學修飾主要作用于OMVs表面蛋白質的氨基，適用面廣，且通過基因工程等方法在分泌前修飾上化學結合位點較EVs更易操作，另外化學修飾的共價鍵連接可以避免目標分子與OMVs的輕易分離?？偟膩碚f，通過修飾改造賦予OMVs特定功能有利于其實際應用與臨床轉化。

4 OMVs應用于腫瘤治療

目前，臨床試驗中OMVs主要作為疫苗應用于細菌感染的防治，且已進入臨床應用階段［7-8，64-66］。在抗腫瘤研究中，OMVs既能作為載體用于抗腫瘤藥物的遞送，也能作為免疫調節劑重塑腫瘤免疫微環境、激活機體自身免疫反應以協同化療/PDT等療法抑制腫瘤生長；而在腫瘤疫苗領域，OMVs可同時作為疫苗納米載體和佐劑以激起強效的腫瘤特異性免疫反應。更重要的是，僅OMVs自身就能通過誘導腫瘤細胞死亡、調節免疫等手段起到一定抑制腫瘤生長的作用。因此，本節將對OMVs的載體優勢，OMVs對腫瘤的殺傷作用，OMVs作為載體、免疫調節劑、佐劑等在腫瘤治療中的應用進行綜述。

4.1 OMVs的載體優勢

易于修飾的特點及自身性質使OMVs被廣泛作為抗腫瘤藥物遞送載體研究。首先，尺寸效應使OMVs本身就具有一定腫瘤靶向能力；其次，靶向修飾可進一步的增加OMVs對特定細胞的靶向性；最后，表面PAMPs分子與納米級的粒徑使得OMVs兼具佐劑性與淋巴滯留能力，這可以極大地協同抗原增強抗腫瘤免疫反應。

與表面修飾類似，對OMVs進行藥物裝載同樣可分為分泌前裝載與分泌后裝載兩類方法。分泌前加載是對細菌進行處理以得到封裝有藥物的OMVs，這種方法主要用于易變性的生物分子。例如，研究人員在細菌培養過程加入慶大霉素，利用細菌會通過OMVs排出有害物質的性質，得到了封裝有慶大霉素的OMVs［122］，而利用基因工程則可使OMVs高效加載蛋白質類藥物［91］。分泌后加載是將藥物封裝入已分離提純的OMVs中，脂雙層結構使OMVs既可封裝疏水藥物又可封裝親水藥物。通過與藥物共孵育，疏水性小分子藥物可封裝在OMVs膜內，同時帶正電的小分子藥物可利用靜電吸附作用封裝在OMVs膜上；而通過電穿孔、超聲處理、物理擠出或滲透處理等方法可使OMVs封裝親水性藥物分子［80-81，123］。

作為載體，OMVs可靶向腫瘤部位（圖5）：OMVs表面富集的PAMPs使其易被血液循環中的中性粒細胞吞噬，而由于中性粒細胞具有炎性靶向能力，因此OMVs可利用中性粒細胞靶向炎性腫瘤組織。值得注意的是，到達炎性腫瘤后，OMVs可通過中性粒細胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps，NETs）形成過程中被釋放出來且不影響活性，這使得OMVs具有天然的腫瘤靶向能力［124］。同時，20~250 nm的粒徑使OMVs可以自由循環至淋巴結，表面富集的PAMPs使其易于被DC攝取滯留淋巴，并誘導Th1型免疫反應［125-126］?；诖?，研究表明隨插隨顯示的OMVs抗原展示平臺在小鼠體內有明顯的淋巴蓄積現象，激活了有效的抗腫瘤免疫反應［85］。此外，OMVs可以通過毛囊途徑和表皮滲透兩種途徑穿過角質層到達真皮層，這賦予了其獨特的優勢作為透皮藥物遞送載體［127-130］?；诖?，研究人員利用OMVs將光敏劑吲哚菁綠（indocyanine Green，ICG）與TRAIL以經皮給藥的方式遞送至黑色素瘤，成功抑制了腫瘤的生長［91］。

Fig.5 Schematic illustration showing the chemotaxis-driven delivery of NPNs for complete eradication of tumors post-phototherapy［124］圖5 炎癥趨向的中性粒細胞遞送納米顆粒，用于PTT治療后腫瘤的根除［124］

綜上所述，OMVs的佐劑性與淋巴蓄積能力有利于其在腫瘤免疫治療中作為藥物或抗原的載體，而其腫瘤靶向能力與角質層穿透能力使得OMVs也可用于遞送化療藥、光敏劑等藥物進行腫瘤治療。

4.2 OMVs對腫瘤的直接殺傷

在抗腫瘤研究中，OMVs自身就對腫瘤具有一定的殺傷效果。PAMPs的富集使OMVs可通過受體激活的死亡途徑在細胞層面可誘導細胞發生焦亡或凋亡。首先，有研究表明，OMVs通過內吞途徑進入宿主細胞后可在早期內體階段將LPS釋放到胞質中，繼而在GBPs的幫助下激活Caspase-11，引起細胞焦亡并釋放炎性因子IL-1β，修飾后的LPS則不具有激活Caspase-11的能力［55，57-58，60］。其次，細菌OMVs可誘導細胞線粒體膜電位降低，引發線粒體功能障礙，進而導致線粒體凋亡、炎癥小體激活，最終觸發細胞凋亡［131］。最后，致病菌OMVs可遞送毒力因子誘導細胞死亡，例如：致病型大腸桿菌OMVs上攜帶的細胞質酶HlyF可通過阻斷細胞自噬體與溶酶體的融合阻斷自噬，激活非經典炎癥小體途徑，誘導細胞死亡［132］。值得注意的是，細胞可通過多種途徑抑制由OMVs誘導的細胞死亡［133-135］。因此，OMVs誘導的細胞死亡受多種因素影響，包括OMVs的組分構成、PAMPs分子的相對濃度以及宿主細胞敏感度等。

此外，OMVs在活體層面也有一定的腫瘤抑制效果，這主要歸功于OMVs對機體免疫系統的激活。首先，OMVs可以誘導腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophage，TAM）向促炎M1型巨噬細胞極化［82，120］；其次，OMVs可招募包括NK細胞、T細胞在內的多種免疫細胞，這既能逆轉腫瘤區域免疫抑制性的微環境也能在腫瘤區域誘導γ干擾素（IFN-γ）的產生以介導腫瘤凋亡［136］。然而，IFN-γ在介導腫瘤細胞凋亡的同時會上調腫瘤細胞程序性死亡配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1）的表達，這抑制了T細胞活性并最終降低了抗腫瘤效果［137-140］。針對這個問題，研究人員通過基因工程化修飾得到了程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD-1）修飾的OMVs，在保留OMVs腫瘤殺傷能力的同時通過對腫瘤細胞表面PD-L1的封閉解除了腫瘤細胞對T細胞的功能抑制，顯著提高了腫瘤抑制效果［80，84］。類似的，通過基因工程得到的表面表達CD47抗體的OMVs不僅能封閉腫瘤表面CD47分子以解除其對巨噬細胞的吞噬抑制，還能作為橋梁連接巨噬細胞與腫瘤細胞以增強吞噬，該工程化的OMVCD47nb在小鼠體內重塑了腫瘤微環境且激活了腫瘤特異性免疫反應，在有效抑制腫瘤生長的同時誘導了對腫瘤的長期免疫記憶［82］。

總之，OMVs對機體免疫系統的激活使其具有一定抗腫瘤效果，當OMVs作為載體時，這種效果能很好地增強其他腫瘤治療方法的療效。

4.3 OMVs激活免疫協助增強抗腫瘤效果

OMVs對機體免疫系統的調節作用使其在抗腫瘤研究中大有可為。首先，OMVs對免疫細胞的強烈刺激可對免疫抑制性的腫瘤微環境進行重編程，這可增強化療、光動力等對腫瘤的抑制效果。其次，OMVs的佐劑性及淋巴靶向性使其在腫瘤疫苗的應用中有著廣泛應用前景。因此，OMVs主要作為遞送載體、免疫調節劑、佐劑等應用于臨床前抗腫瘤研究（表1）。

Table 1 Application of OMVs in tumor treatment表1 OMVs應用于腫瘤治療

在腫瘤治療中，OMVs不僅可作為納米遞送載體增加抗腫瘤藥物的利用率并降低藥物副作用，還可以作為免疫調節劑激活機體免疫反應以協同增強化療、PDT等抗腫瘤療法的療效。早在2014年，研究人員利用基因工程化的接有腫瘤靶向肽的減毒OMVs向腫瘤部位遞送了小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），有效抑制了腫瘤生長［141］。此后，OMVs被廣泛用于抗腫瘤藥物的遞送。例如，載有光敏劑二氫卟吩e6（chlorin e6，Ce6）和化療藥阿霉素（doxorubicin，DOX）的OMVs作為治療平臺，通過光動力、化療與免疫療法的有機協同實現了對小鼠三陰性乳腺腫瘤的完全抑制，并成功防止了腫瘤轉移的發生［142］。負載黑色素的OMVs有著良好的光熱轉換效率，其不僅可在近紅外激光的照射下對腫瘤進行局部加熱以殺死腫瘤，還可利用多光譜光聲斷層掃描技術（multispectral optoacoustic tomography，MSOT）對腫瘤組織進行光聲成像［143］?？傊?，OMVs不僅能作為載體將光敏劑、化療藥等抗腫瘤藥物遞送至腫瘤部位，還能激活免疫反應以增強抗腫瘤效果［144-147］。

在腫瘤疫苗研究中，OMVs同時作為疫苗納米載體與免疫佐劑來增強由針對腫瘤抗原的特異性免疫反應。作為載體，工程化的OMVs既可以快速捕獲多種腫瘤抗原，又可以靶向淋巴結并增強DC對抗原的攝取，同時OMVs能作為佐劑進一步增強腫瘤特異性免疫反應，強效的免疫反應消除了小鼠皮下腫瘤并抑制了腫瘤的轉移［85，148］。類似的，利用OMVs向DC遞送抗原mRNA能引起有效的抗腫瘤免疫反應，成功實現了對腫瘤的抑制并誘導了長期免疫記憶的產生［149］。然而由佐劑誘導的DC快速成熟會導致其攝取能力降低，這種現象被稱為成熟誘導的攝取阻塞（maturation-induced uptake obstruction，MUO）。對此，研究人員通過在OMVs修飾上葡萄球菌蛋白A的結構域B（domain B of staphylococcal protein A）以結合αDEC205抗體的Fc端，而αDEC205抗體的Fab端與DC表面DEC205（CD205，一種具有抗原呈遞功能的內吞受體）的結合使OMV-DEC能通過異位攝取途徑突破MUO的限制。因此，DC對OMV-DEC表現出比OMVs更強的攝取能力，這增強了OMV-DEC對抗原的呈遞能力，激活了更強的抗腫瘤免疫反應，成功抑制了黑色素瘤的生長與轉移［150］。作為細菌分泌物，OMVs可由腸道細菌原位產生，因此，研究人員開發了一種阿拉伯糖誘導型基因工程化大腸桿菌作為口服型腫瘤疫苗。大腸桿菌在小鼠腸道原位產生負載腫瘤抗原的OMVs，其可穿過腸上皮細胞屏障，刺激DC成熟，并進一步激活腫瘤特異性免疫反應以殺傷腫瘤細胞。在小鼠模型中，該疫苗不僅實現了對腫瘤的抑制，原位產生的方式還使其避免了分離提純的繁瑣步驟，有效降低了生產成本［83］。而為了實現個性化治療，可將OMVs與腫瘤細胞膜或腫瘤外泌體融合，得到的雜化囊泡作為個性化腫瘤疫苗能誘導強烈的適應性免疫反應，提高小鼠生存率并提供對腫瘤的長期防護［109-110，146，148，151-152］。進一步的，OMV-Mal可在腫瘤原位捕獲PTT后釋放的腫瘤抗原，并將之遞送至DC以引發腫瘤特異性免疫反應（圖6b）。這種策略不僅通過增強抗原攝取、刺激DC成熟等手段增強了免疫反應，還實現了免疫療法與PDT、PTT、化療等治療方法的協同［121］。綜上所述，在腫瘤疫苗研究中，OMVs作為具有內在免疫佐劑性質的納米載體被廣泛用于遞送腫瘤抗原，引發強效的抗腫瘤特異性免疫反應。

Fig.6 Schematic illustration of preparation of 1-MT@OMV-Mal and in situ vaccine after PTT［121］圖6 1-MT@OMV-Mal的制備與光熱治療后原位疫苗作用示意圖［121］

5 總結與展望

綜上所述，易于修飾、強佐劑性的細菌OMVs在腫瘤治療中有著廣大前景。作為載體，OMVs在提升藥物腫瘤蓄積的同時還能通過激活免疫反應對腫瘤進行一定殺傷；作為疫苗組分，OMVs不僅可作為佐劑激活DC還能增強DC對抗原的攝取。并且，OMVs易于修飾改造的特性也有助于構建多功能OMVs體系以更好地抑制腫瘤生長。

盡管OMVs在腫瘤治療領域有著許多優勢，但仍有一些臨床應用上的困難需要克服。首先，OMVs的具體成分難以控制且產量較低。其次，OMVs本身具有一定生物毒性，這限制了其使用劑量。最后，在腫瘤疫苗研究中，腫瘤抗原表達量較低以及針對OMVs自身產生的免疫反應可能會影響腫瘤疫苗的效力。

雖然如此，目前，研究人員已通過多種手段對OMVs產量及毒性問題進行了優化，比如，通過敲除Lpp基因可以有效提高OMVs產量，而敲除msbB基因或者對OMVs進行表面修飾則可以得到低毒性的OMVs。未來，隨著對OMVs生物發生機理、OMVs與免疫系統的相互作用等研究的不斷深入，將有望解決機體產生OMVs特異性免疫反應干擾抗腫瘤效果的問題。同時，細菌易于基因修飾的特性使得人們能通過基因工程的手段同時克服上述問題。因此，未來OMVs將很可能作為具有免疫調節作用的藥物載體或者具有佐劑作用的抗原載體應用于腫瘤的臨床治療。