基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術的百蕊顆粒入血成分研究

周思倩,方 艷,譚金桃,王雅靜,吳 娟,邵 樂,龍紅萍*

1湖南中醫藥大學第一附屬醫院;2湖南省兒童醫院藥學部,長沙 410007;3湖南中醫藥大學,長沙 410208

百蕊顆粒是由百蕊草單味藥組成的顆粒制劑,具有抗菌消炎、清熱解毒、止咳之功效,現代臨床上多用于治療小兒扁桃體炎、支氣管炎及各種呼吸道感染等癥[1,2]。中藥有效成分多以血液為介質輸送到靶點(腸道直接起作用及外用藥除外)從而發揮作用,因此分析口服中藥后體內活性成分對于中藥藥效物質基礎研究十分重要[3-5]。本課題組前期已采用液質聯用技術對百蕊草醇提物的化學成分進行系統性分析[6],發現百蕊草中存在許多有效成分,如黃酮類、生物堿類等化合物,既往的文獻研究多為單味藥的化學成分和質量控制研究,缺少對百蕊顆粒體內入血成分和體內代謝過程的研究,且藥效物質基礎尚不明確。

四極桿飛行時間質譜技術因其靈敏度高、分辨率高的特點,可以快速高效地對中藥中的化學成分進行分析,已廣泛運用在中藥藥效物質基礎研究等領域[7,8]。因此,本課題組在前期研究基礎上繼續采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜(UHPLC-Q-TOF-MS/MS)技術,對百蕊顆粒入血成分和代謝過程進行分析,為藥效物質基礎研究提供參考依據,對于中成藥的質量控制和開發利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 1290UPLC-6540 Q-TOF色譜-質譜聯用儀(美國Agilent科技公司);超聲波清洗機(上?？茖С晝x器有限公司),S-23高速臺式離心機(湖南湘儀儀器有限公司);電子分析天平(日本SHIMADZU公司);LABCONCO CentriVap型離心濃縮儀(Labconco,美國)。

1.2 材料

百蕊顆粒購于安徽九華華源藥業有限公司(批號為Z20090694);色譜級甲醇、質譜級乙腈均購于德國(Merck Millipore公司);蒸餾水(深圳屈臣氏蒸餾水有限公司);甲酸銨(質譜級,美國Fisher公司)。健康SPF級雄性SD大鼠,體質量(180～220)g,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,常規飼養于湖南中醫藥大學第一附屬醫院醫學創新中心動物中心,動物許可證號為SCXK(湘)2019-0004,經湖南中醫藥大學第一附屬醫院動物倫理審查,倫理審批號為ZYFY2021040701。

1.3 方法

1.3.1 灌胃藥液制備

將百蕊顆粒置于研缽研至粉末狀,準確稱量144 g百蕊顆粒粉末,加100 mL純水溶解,超聲溶解30 min后,配制成質量濃度為0.850 5 g/mL的混懸液(按照臨床劑量折算成大鼠灌胃給藥劑量每天8.50 g/kg),搖勻靜置,儲存至4 ℃冰箱中,備用。

1.3.2 供試品溶液制備

精密稱量百蕊顆粒粉末2 g,置25 mL容量瓶,加20 mL甲醇溶解,超聲提取30 min,取上清液離心5 min(8 000 r/min),用0.22 μm微孔濾膜過濾,待測。

1.3.3 血清樣品制備

大鼠隨機分為空白對照組和給藥組,每組各6只,給藥組灌胃百蕊顆粒灌胃液,空白組生理鹽水灌胃,每天2次,連續灌胃5 d,在最后一次給藥1 h后,對大鼠腹腔注射30 mg / kg 戊巴比妥麻醉,腹主動脈取血,靜置1 h后,4 000 r/min離心10 min分離血清。取大鼠空白和給藥血清各2 mL,分別加入3倍量甲醇沉淀蛋白,渦旋10 min后,置于冰浴中10 min,低溫離心10 min,5 000 r/min。吸取上清液,用離心濃縮儀揮干;殘渣加200 μL甲醇復溶,于12 000 r/min下離心5 min,取上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾,待測。

1.3.4 色譜條件

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(3.0 mm×100 mm,1.8 μm);流動相為0.1%甲酸水(A)-乙腈(B),梯度洗脫(0～5 min,5%→15%B;5～10 min,15%→35%B;10～20 min,35%→65%B;20～40 min,65%→85%B);進樣量:2 μL;流速:0.4 mL/min。

1.3.5 質譜條件

采用電噴霧離子化源(ESI),正、負離子模式同時檢測,掃描范圍m/z100～1 700;干燥氣溫度325 ℃,流速為6.8 L/min;鞘氣溫度為350 ℃;毛細管電壓為4.0 kV;Fragment電壓為150 V;二級質譜掃描檢測范圍:m/z50～1 000;Fragment電壓:10、20、40 V。

1.3.6 數據分析

采用Agilent MassHunter軟件(B.07.00版) 采集正、負離子模式下各組數據,使用Agilent Masshunter Qualitative Analysis工作站中的分子特征提取(MFE)功能提取主要成分相關的特征離子,比對空白組及給藥組血清的提取離子流圖,再結合前期所分析的體外成分二級質譜信息、裂解規律、文獻報道的分子式、保留時間等分析百蕊顆粒的入血成分。

2 結果

本研究通過比對分析百蕊顆粒含藥血清及空白血清的質譜圖信息數據,查閱數據庫和文獻報道,并結合分析質譜裂解規律,對大鼠口服百蕊顆粒后血清中的化學成分進行分析,在大鼠血清中共推測鑒定了30個成分,其中原型成分和代謝產物分別為20個和10個(見表1),其正、負離子模式下含藥血清和空白血清總離子流圖(total ion chromatogram,TIC)見圖1,入血成分提取離子流圖見圖2。

圖1 正、負離子模式下各樣品的TIC圖

圖2 百蕊顆粒20個原型成分在正、負離子模式下的提取離子流圖

表1 大鼠灌胃百蕊顆粒后血清中的原型成分及代謝產物

3.1 原型成分分析

采用液質聯用技術采集百蕊顆?？瞻籽搴秃幯鍞祿?與前期鑒定出的體外化學成分進行比對,共檢測到20個原型成分,包括6個生物堿類化合物和4個黃酮類化合物,3個有機酸類,2個糖苷類,2個萜類,1個內酯類,2個其他類,其原型成分結構圖見圖3。

圖3 百蕊顆粒20個原型成分化學結構

以化合物8和11為例來進行解析?；衔?(tR為6.186 min)在正離子模式下檢測到準分子離子[M+H]+為m/z205.132 2,其碎片離子包括[M+H-H2O]+(m/z186.995 8)、[M+H-C3H11N]+(m/z146.062 0)和[M+H-C6H7NO]+(m/z110.098 1),據文獻報道,m/z146是金雀花堿型生物堿的特征碎片離子,為金雀花堿型生物堿C環裂解產生,同時金雀花堿型生物堿B環裂解產生m/z110.098 1的碎片離子,根據其碎片離子信息和相關文獻報道[9],推測其為N-甲基金雀花堿(C12H16N2O),其MS/MS質譜圖和可能裂解途徑見圖4和圖5?；衔?1(tR為18.525 min)在負離子模式下檢測到準分子離子峰[M-H]-為m/z489.100 7,其二級碎片離子包括[M-H-C3H8O2]+(m/z412.249 3)、[M-H-C9H18O7]+(m/z284.035 8)和[M-H-C6H7NO]+(m/z266.726 0),m/z284.035 8分別失去H2O、CO基團得到m/z266.726 0和m/z256.036 2,根據其碎片離子信息和相關文獻報道[10],推測其化合物11為山奈酚3-O-(6′′-O-乙?；?葡萄糖苷(C23H22O12),其MS/MS質譜圖和可能裂解途徑見圖6和圖7。

圖4 N-甲基金雀花堿質譜圖

圖5 N-甲基金雀花堿可能質譜裂解途徑

圖6 山奈酚3-O-(6′′-O-乙?；?葡萄糖苷質譜圖

圖7 山奈酚-3-O-(6′′-O-乙?；?葡萄糖苷可能質譜裂解途徑

3.2 代謝產物分析

通過Agilent Masshunter軟件分析結合相關文獻報道,在原型成分的基礎上檢測到10個代謝產物,其中代謝途徑包括還原反應和水解反應、硫酸化反應和葡萄糖醛酸結合反應,見圖8和圖9。

圖8 體內10個代謝產物的提取離子色譜圖

圖9 百蕊顆粒中黃酮類化合物體內代謝途徑

代謝產物M1、M2(tR分別為16.242、16.590 min),正離子模式下其準分子離子峰分別為m/z271.060 1和463.087 3[M+H]+,代謝產物M1準分子離子峰相比山奈酚準分子離子m/z287.055 2[M+H]+少了16 Da,推測代謝產物M1可能為山柰酚去氧化產物;代謝產物M2準分離子離子峰相比山奈酚準分子離子m/z287.055 2[M+H]+多了176 Da,推測M2可能為發生葡萄糖醛酸反應的產物,根據軟件計算M1分子式為C15H10O5,M2分子式為C21H18O12。

代謝產物M3、M4(tR分別為19.157 min和15.608 min),正離子模式下準分子離子峰分別為m/z367.011 5和447.092 0[M+H]+,代謝產物M3準分子離子峰與山奈酚準分子離子m/z287.055 2 [M+H]+多了80 Da,推測M3為與硫酸鹽結合的產物,M4準分子離子峰與山柰酚準分子離子m/z287.055 2[M+H]+多了160 Da,推測M4可能為山柰酚發生還原反應后的糖基化產物,根據軟件計算該分子式為C15H10O9S和C21H18O11,推測M3、M4分別為山奈酚的硫酸酯和山奈酚丟氧后葡萄糖醛酸化產物。

代謝產物M5～M7(tR分別為11.222、5.327、4.530 min),正離子模式下的準分子離子峰分別為 [M+H]+m/z263.175 5、279.170 0和265.191 0。代謝產物M5準分子離子峰與槐果堿母離子相差16 Da,推測可能為槐果堿氧化反應的代謝產物;代謝產物M6準分子離子峰與槐果堿母離子相差32 Da,推測可能為槐果堿雙氧化反應的代謝產物;代謝產物M7準分子離子峰與槐果堿母離子相差18 Da,推測可能為槐果堿水解反應的代謝產物,根據軟件計算M5～M7分子式C15H22N2O2、C15H22N2O3和C15H24N2O3,推測M5為槐果堿羥基氧化物,M6為槐果堿羥基雙氧化物,M7為槐果堿水解產物。

代謝產物M8、M9(tR為13.027、14.435 min),負離子模式下準分子離子峰分別為m/z461.104 9和285.076 3 [M-H]-。代謝產物M8準分子離子峰與異鼠李素-3-O-葡萄糖苷母離子相差16 Da,推測可能為異鼠李素-3-O-葡萄糖苷氧化反應的代謝產物;代謝產物M9準分子離子峰與異鼠李素-3-O-葡萄糖苷母離子相差162 Da,推測可能為異鼠李素-3-O-葡萄糖苷發生去糖基化反應的代謝產物,根據軟件計算該分子式為C22H22O11和C16H14O5,推測M8和M9分別為異鼠李素-3-O-葡萄糖苷氧化物和脫糖產物。

代謝產物M10(tR為23.825 min),負離子模式下準分子離子峰為 [M-H]-m/z401.122 0,與百蕊草素I準分子母離子相差192 Da,推測可能為百蕊草素I發生葡萄糖醛酸反應后的氧化代謝產物,根據軟件計算該分子式為C21H22O8,推測M10為百蕊草素I葡萄糖醛酸化后氧化產物。

大鼠口服灌胃百蕊顆粒后,在其含藥血清的原型成分中發現苦參堿類和金雀花堿類生物堿均被檢測到,推測苦參堿類和金雀花堿類生物堿能直接入血發揮藥效作用;原型成分中黃酮類化合物主要以山柰酚苷元為主,然而在給藥后大鼠血清中原型成分未檢測到蘆丁等黃酮-O-雙糖苷類化合物的質譜信號,推測黃酮-O-雙糖苷類化合物可能在動物體內水解成苷元,導致其主要以代謝產物形式存在于體內;在代謝產物中,I相代謝產物主要以氧化產物為主,II相代謝產物尤以硫酸化、葡萄糖基化、葡萄糖醛酸化。

3 討論與結論

本研究采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術對百蕊顆粒吸收入血成分進行分析,從大鼠血清中共檢測到20個原型成分和10個代謝產物。其中分析出的體內原型成分主要為白金雀兒堿、槐果堿等生物堿類化合物以及山柰酚、百蕊草素I等黃酮類化合物;體內代謝產物主要是山柰酚經氧化、葡萄糖醛酸化反應生成和槐果堿經氧化、水解反應生成,表明生物堿類和黃酮類是進入體內的主要成分,也可能是發揮藥效的潛在活性成分。

現代藥理學研究表明黃酮類和生物堿類化合物具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化等藥理功能[11,12],先前研究報道百蕊草中山奈酚衍生物抗炎作用與有效抑制細胞內活性氧的產生以及p38 MAPK和活化蛋白1的激活有關[13],山柰酚作為一種天然黃酮醇,在抑制炎癥細胞功能以及抑制促炎細胞因子和趨化因子的表達方面有著強大作用[14]。百蕊草素I可以通過作用于NF-κB和MAPK通路抑制炎性細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β等的表達,從而改善感染肺炎的小鼠肺部的肺水腫[15,16]。生物堿類化合物能明顯抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等微生物的生長[17],槐果堿具有較強的抗炎鎮痛作用,可通過抑制NF-κB信號通路來減少炎癥的發生[18]。氧化苦參堿可通過抑制NF-κB信號通路,降低炎癥因子IL-6和IL-8的表達,從而發揮抗炎作用[19]。

綜上所述,本研究通過采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術闡明了百蕊顆粒的入血成分及代謝產物,這些化合物可能與百蕊顆?？寡卓咕人幮芮邢嚓P,對于明確中藥藥效物質基礎研究和中藥質量標準的提升具有重要意義,為進一步了解其作用機制和臨床應用提供參考依據。