纖維二糖水解酶在乳酸乳球菌中的表達

黃凱,何啟杰,陳櫻,歐陽康,黃偉堅,彭昊,韋祖樟,李軍*

(1.廣西獸醫研究所廣西獸醫生物技術重點實驗室,廣西 南寧 530005; 2.廣西大學動物科學技術學院動物傳染病與分子免疫學實驗室,廣西 南寧 530005;3.農業農村部中國(廣西)-東盟跨境動物疫病防控重點實驗室,廣西 南寧 530005)

乳酸菌 (Lacticacidbacteria,LAB) 是人體及動物體內天然存在的對機體有益生作用的一種重要菌種,具有多種生物學功能,如調節機體胃腸道微生態平衡、降低血液膽固醇以及控制內毒素等,因此被稱為益生菌[1, 2]。乳酸乳球菌(Lactococcuslactis,L．lactis)是一種達到了食品級的乳酸菌,在乳酸菌屬中最為重要[3],近年來在食品加工及保健品行業被廣泛應用,主要作用是參與調節機體胃腸道正常菌群生態平衡[4]。21世紀以來分子生物學飛速發展,乳酸乳球菌的全基因組序列也逐步完成測定,對于乳酸乳球菌的研究取得了重大進展,一些外源基因已被報道在乳酸菌中成功表達。例如,Renye等[5]通過乳酸鏈球菌素Nisin誘導表達系統獲得片球菌素;Abdullah等[6]在乳酸乳球菌NZ9000這一常用乳酸菌種中表達了大腸桿菌的熱休克蛋白DnaK。

纖維素酶(Cellulase)是一種可催化纖維素分解的酶類物質,廣泛存在于自然界的微生物及動植物體內。一般用于生產的纖維素酶來自木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)和青霉屬(Penicillium)的真菌。纖維素酶是由內切葡萄糖苷酶(又稱葡聚糖內切酶)、外切葡萄糖苷酶(又稱葡聚糖外切酶、纖維二糖水解酶CBH)、 β-葡萄糖苷酶(又稱纖維二糖酶)3種不同催化功能的酶組成的多組分酶系,這三種酶互相協同作用增強了降解纖維素的效率[7]。纖維素酶的獲取主要來自動物和微生物,這之中真菌類的木霉屬(Trichoderma)應用最為廣泛,因為其產生的酶量較大、活性較高且遺傳性狀穩定。與此同時,康寧木霉、綠色木霉、里氏木霉等真菌也在生產中應用較廣。在20世紀80年代,DNA重組技術就已經應用在纖維素酶基因的克隆及其鑒定方面了,近年來關于真核表達系統的酵母表達系統研究較多,如劉澤寰等[8]將綠色木霉CBH Ⅱ基因表達于釀酒酵母,無須誘導即可產生分泌到胞外的纖維二糖水解酶。陳士華等[9]也成功通過畢赤酵母表達康寧木霉的CBH Ⅱ基因。隨后人們又將目光轉向了原核表達系統,通過植物乳桿菌來表達纖維素酶[10]。如趙瑩等[11]構建了重組酸性纖維素酶CBH Ⅱ基因與pW425t非抗性的穿梭表達載體的重組質粒pW425t-CBH Ⅱ,通過電轉化的方法轉入乳酸桿菌中,并且表達成功。孫磊等[12]將纖維素酶基因導入乳酸菌中獲得了轉基因乳酸菌,得到了可分解含有纖維素和半纖維素物質作物的新型青貯劑,使青貯更加方便高效。

本研究旨在將能降解纖維素酶系中的綠色木霉CBH II基因克隆到乳酸乳球菌表達載體pNZ8148,通過電轉化方式將重組質粒轉入具有良好益生效果的乳酸乳球菌NZ3900中,經Nisin誘導表達,獲得能表達纖維素酶的重組乳酸乳球菌,為乳酸乳球菌的改造應用奠定基礎。對乳酸乳球菌進行表達可分解纖維素酶基因的改造,可能獲得新型的青貯飼料添加劑,增加對飼料中纖維素和半纖維素物質的分解,提高青貯效率,增加飼料的分解利用率;也可能開發出新型的生物口服制劑,增加動物體對富含纖維素和半纖維素物質作物的消化與吸收,從而提高畜牧生產的效率。

1 材料與方法

1.1 所用質粒和細胞

通過生物信息學方法按照乳酸菌的偏好性對綠色木霉(T.reesei)CBH II基因(GenBank登錄號：M55080)進行密碼子優化[13],進行密碼子優化后的CBH II基因由北京擎科生物科技有限公司合成并克隆到克隆載體中,獲得質粒pCBH II;乳酸乳球菌表達載體pNZ8148來自廣西壯族自治區獸醫研究所;MC1061大腸桿菌購于湖南豐暉生物科技有限公司;乳酸乳球菌NZ3900來自中國科學院上海獸醫研究所。

1.2 主要試劑

高保真DNA聚合酶PrimeSTAR?MAX DNA Polymerase、DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker均購于Takara公司;高保真限制性核酸內切酶KpnI-HF和SacI-HF以及T4 DNA連接酶購于New England BioLabs公司;膠回收試劑盒、反應液回收試劑盒、質粒小提試劑盒均購于Omega公司;超級感受態細胞制備試劑盒購于上海生工生物工程股份有限公司;GM17肉湯培養基購于北京酷來博科技有限公司;乳酸鏈球菌素(Nisin)購于 MACKLIN公司;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、預染蛋白質分子質量標準購于康為世紀公司。

1.3 引物的設計與合成

根據密碼子優化后的綠色木霉(T.reesei)CBH II基因序列設計一對引物,上游引物引入KpnI限制性核酸內切酶識別位點,下游引物引入SacI限制性核酸內切酶識別位點,引物由北京擎科生物科技有限公司合成。引物序列為：

CBH II-KpnI-F：5′-acgGGTACCatgaagaaaaagatcatcagtg-3′(下劃線部分為KpnⅠ識別位點);CBH II-SacI-R：5′-cgtGAGCTCtaaaaatgatggattcgcatt-3′(下劃線部分為SacⅠ識別位點)。

1.4 CBH II基因的擴增

將質粒pCBH II稀釋1000倍后以其為模板,使用PrimeSTAR MAX高保真DNA聚合酶擴增。擴增體系為25μL體系：PrimeSTAR MAX 12.5μL,上下游引物分別0.5μL,模板DNA 3μL,ddH2O補全至25μL,配制兩管共50μL。PCR 擴增條件：預變性98℃ 3min;變性98℃ 10s,退火55℃ 5s,延伸72℃ 10s,32個循環;繼續延伸72℃ 10min后經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,目的條帶使用Omega公司膠回收試劑盒純化回收。

1.5 重組表達質粒的構建與鑒定

使用NEB公司的限制性核酸內切酶KpnI-HF和SacI-HF同時酶切pNZ8148和CBH II回收產物。分別配制50μL體系：KpnI-HF 1μL,SacI-HF 1μL,CutSmart Buffer 5μL,模板質粒pNZ8148/CBH II回收產物 15μL,ddH2O補全至50μL;37℃作用6h以上,使用Omega公司反應液回收試劑盒純化回收。二者回收產物通過T4連接酶16℃過夜連接;使用上海生工生物工程股份有限公司購買的超級感受態細胞制備試劑盒,按說明書步驟制備MC1061感受態細胞,并將上述連接產物轉化至MC1061感受態細胞中,涂布含氯霉素抗性LA平板并挑取單克隆菌落進行菌液PCR鑒定,陽性克隆大量擴繁菌液后使用Omega公司質粒小提試劑盒提取質粒經雙酶切與生物測序進一步鑒定,獲得質粒pNZ8148-CBH II。

1.6 乳酸乳球菌NZ3900感受態細胞的制備

取-80℃儲存的NZ3900菌種加入5mL GM17液體培養基中,30℃靜置厭氧培養24h進行活化,隨后按1∶20的比例將上述菌液加入10mL GM17液體培養基中,在30℃靜置厭氧培養24h放大培養,取10mL菌液接種于100mL GM17液體培養基,培養至OD600≈0.3時,于4℃ 4000r/min離心15min收集菌體沉淀,加入50mL 預冷的含0.5M蔗糖及10%甘油的溶液(EPB)洗滌菌體;通過4℃ 4000r/min離心15min收集沉淀,加入50mL預冷的含0.05M EDTA的EPB溶液再次洗滌菌體,4℃ 4000r/min離心15min收集沉淀,再次加入12mL預冷的EPB溶液洗滌菌體,4℃ 4000r/min離心15min,收集沉淀,最后加入適量的EPB溶液重選菌體,每管100μL 進行分裝,-80℃保存備用[14]。

1.7 重組CBH II蛋白的誘導表達與可溶性分析

利用鑒定正確的重組質粒電轉化NZ3900感受態細胞,條件為電壓2500V、電阻200Ω,將所獲菌液涂布于含有氯霉素的GM17平板,挑選單克隆菌落進行菌液PCR鑒定篩選陽性克隆。陽性菌液接種于5mL GM17液體培養基,并于30℃靜置培養過夜(約16h);按 1∶25 的比例將菌液轉接至 10mL GM17 液體培養基中,待OD600達到0.4時,加入乳酸鏈球菌素(Nisin)至終濃度20ng/mL置于30℃恒溫培養箱中靜置誘導5h。最后加入8mL PBS重懸菌體,超聲破碎菌體(300W,破碎3 s,間歇4 s,150次),5000r/min,4℃離心15min,分別收集上清和沉淀(包涵體)進行SDS-PAGE電泳分析,同時將空載pNZ8148作為對照。

2 結果

2.1 重組表達質粒pNZ8148-CBH II的構建與鑒定

以質粒pCBH II為模板,用設計的引物CBH II-KpnI-F和CBH II-SacI-R擴增CBH II基因,將擴增的CBH II基因克隆至載體pNZ8148中,得到的重組質粒命名為pNZ8148-CBH II。對重組表達質粒進行KpnⅠ和SacⅠ 雙酶切,酶切產物經電泳檢出約1500bp的目的片段和pNZ8148載體片段(圖1),與預期大小一致,最后通過測序結果表明重組表達質粒構建成功(圖2)。

M：DNA標準DL5 000;1,2：pNZ8148-CBH II。

圖2 測序結果比對

2.2 重組質粒pNZ8148-CBH II電轉化NZ3900陽性克隆篩選

將鑒定正確的重組質粒pNZ8148-CBH II以電壓2500V、電阻200Ω的條件電轉化進入NZ3900感受態細胞,將所獲菌液涂布于含有氯霉素的GM17平板,挑選單克隆菌落進行菌液PCR鑒定篩選陽性克隆(圖3),結果顯示在1500bp處有符合其大小的特異性條帶,說明電轉化成功。

M：DNA標準DL2000;1,2： pNZ8148-CBH II。

2.3 重組蛋白CBH II的誘導表達與可溶性分析

取上述PCR鑒定正確的陽性克隆接種于5mL GM17液體培養基,并于30℃靜置培養過夜(約16h);按 1∶25 的比例將菌液轉接至10mL GM17 液體培養基中,待 OD600達到0.4時,加入乳酸鏈球菌素(Nisin)靜置誘導5h。通過超聲破碎菌體,收集上清和沉淀(包涵體)進行SDS-PAGE電泳分析(圖4)。結果顯示,Nisin誘導的pNZ8148-CBH II菌液和菌液超聲沉淀經SDS-PAGE電泳分析在約53kDa處有特異性條帶,符合預期大小,而pNZ8148空載、未誘導的pNZ8148-CBH II菌液以及菌液超聲上清均無條帶,說明重組CBH II蛋白可經Nisin誘導在NZ3900細胞中表達,且以包涵體形式表達。

M：預染蛋白質分子質量標準;1：pNZ8148空載對照;2：pNZ8148-CBH II未誘導菌液對照;3：pNZ8148-CBH II誘導菌液;4：pNZ8148-CBH II超聲沉淀;5：pNZ8148-CBH II超聲上清。

3 討論

乳酸菌是一類對人體和動物體有益的、重要的益生菌,具有對整個機體的胃腸道微生態平衡、降低血液膽固醇以及控制內毒素等多種生物學功能。其中最重要的乳酸乳球菌更是食品級的安全微生物,在食品加工業、保健品行業及醫藥領域已被廣泛研究與應用。近年來已有報道多種外源基因已成功在乳酸菌中表達[5, 6, 15],揭開了對乳酸菌的改造及應用新篇章。

纖維素酶是一種生物催化物質,作用主要是促進纖維素的分解,存在于動植物體內及微生物中。孫磊[12]、趙瑩[11]等先后成功通過乳酸菌表達纖維素酶獲得重組乳酸菌工程菌,為改造新型乳酸菌、研制新的生物制劑促進纖維素的分解與吸收提供了有力論證。本研究將能降解纖維素酶系中的CBH II基因克隆到乳酸乳球菌表達載體pNZ8148中,通過電轉化方式將重組質粒轉入乳酸乳球菌NZ3900中并進行Nisin誘導表達,經SDS-PAGE鑒定重組乳酸乳球菌成功表達了CBH II基因,其表達形式為包涵體表達。對此可對信號肽進行分泌型優化、降低誘導溫度,保證蛋白有足夠的時間進行折疊、添加可溶性標簽進行融合表達以增加蛋白在細胞質中的可溶性,從而促進外源蛋白的可溶性表達。乳酸菌作為食品級微生物,在表達過程中,如果同時使用食品級的載體及誘導物,便可直接制成口服制劑,從而免去了一些繁瑣的提取步驟及過程,大大降低了成本以及提高了安全性[16]。荷蘭NIZO研究所開發的食品級誘導物Nisin誘導基因表達系統 ( The nisin controlledgene expression system,NICE ) 是目前乳酸菌最成熟的表達體系[17, 18],Nisin作為L．lactis天然分泌的一種抗菌肽,已被大部分國家認定為食品級的天然防腐劑[19]。本研究使用Nisin誘導,表達菌種及誘導物均為食品級,但所用載體pNZ8148的篩選抗性為氯霉素,這對于食品和醫藥保健等安全性要求較高的領域應用會有所受限。今后使用食品級選擇標記如營養缺陷互補型選擇標記、糖類利用選擇標記、熱應激抗性選擇標記等[20, 21],使得表達系統所有構成均為食品級,以滿足食品和醫藥等領域的高安全性要求。