UPLC-MS/MS法測定龍膽瀉肝丸（水丸）中5種成分的含量 *

吳洋生 蔣 玲 周云峰 黃招光※

（1.宜春市袁州區檢驗檢測中心檢測室，江西 宜春 336000；2.宜春市袁州區衛生健康服務中心辦公室，江西 宜春 336000；3.宜春市檢驗檢測中心藥品檢驗所，江西 宜春 336000）

龍膽瀉肝丸（水丸）是由10 味中藥組成的復方制劑［1］，方中龍膽利肝經濕熱為君藥，黃芩和梔子清熱為臣藥，澤瀉導濕熱為佐藥，甘草護胃安中兼佐使之用［2］。研究［1，3-11］表明，龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷、甘草苷和23-乙酰澤瀉醇B分別為龍膽、梔子、黃芩、甘草、澤瀉的代表性有效成分，已廣泛作為定量指標用于控制這些藥味和中藥制劑的質量。根據現行標準和相關文獻［12-14］，龍膽瀉肝丸（水丸）中各有效成分的含量測定主要采用高效液相色譜法（HPLC），而幾無運用超高效液相色譜串聯質譜法（UPLC-MS/MS）法進行含量分析報道。UPLC-MS/MS 法具有分析速度快、靈敏度高、專屬性強等特點［15］，已廣泛用于中藥材與中藥復方制劑的定性和定量分析?；诖?，本研究以龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷、甘草苷和23-乙酰澤瀉醇B 為定量指標，首次采用UPLC-MS/MS法測定龍膽瀉肝丸（水丸）中龍膽、梔子、黃芩、甘草和澤瀉5種藥味的含量，現報道如下。

1 主要儀器與試藥

超高效液相色譜儀（美國Waters 公司，型號：Hclass，配備xevo TQD三重四極桿質譜檢測器）；龍膽瀉肝丸（水丸22 批，抽樣地點：宜春、萍鄉、新余、九江、贛州等江西省11個地級市）；龍膽苦苷（批號：110770-201918，純度：97.1%）、梔子苷（批號：110749-201919，純度：97.1%）、黃芩苷（批號：110715-202122，純度：94.2%）、甘草苷（批號：111610-201908，純度：95.0%）和23-乙酰澤瀉醇B（批號：111846-201705，純度：99.7%）均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈、甲酸為色譜級；水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件色譜柱采用Waters ACQUITY UPLC?BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm），柱溫為30 ℃，流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～2 min，5%A～5%A；2～5 min，5%A～75%A；5～8 min，75%A～75%A；8.01 ～10 min，5%A～5%A），流速為0.2 mL/min，進樣量為5 μL。

2.2 質譜條件電噴霧離子源（ESI），多反應監測模式（MRM），正負離子模式同時掃描，毛細管電壓0.5 kV，錐孔氣流量50 L/h，離子源溫度150 ℃，脫溶劑氣流量950 L/h，脫溶劑氣溫度580 ℃。龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷、甘草苷和23-乙酰澤瀉醇B 的定量離子對分別為m/z 401→179、m/z 433→225、m/z 271→211、m/z 417→255、m/z 497→437。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液分別精密稱取龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷、甘草苷和23-乙酰澤瀉醇B對照品適量，加70%甲醇溶液，溶解稀釋成含133.200 μg/mL、103.600 μg/mL、94.580 μg/mL、20.030 μg/mL 和6.022 μg/mL 的單一成分對照品母液。

2.3.2 供試品溶液取樣品適量研細，精密稱取0.2 g，移至100 mL 量瓶中，加入70%甲醇溶液約80 mL，超聲處理40 min，放冷至室溫；加70%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻過濾，取續濾液，作為1號供試品溶液。

精密量取1 號供試品溶液2 mL，置于10 mL 量瓶中，加上述溶劑稀釋至刻度，搖勻過濾，取續濾液，作為2號供試品溶液（用于測定黃芩苷成分）。

2.3.3 陰性樣品溶液龍膽瀉肝丸（水丸）方中所有藥味均以原粉入藥，按照處方比例和工藝，分別制備不含龍膽、梔子、黃芩、甘草、澤瀉的陰性樣品，按供試品溶液的處理方法制備陰性樣品溶液。

2.4 專屬性取“2.3”項的溶液進行測定，采集MRM圖.見圖1。結果可知，供試品溶液出現與各對照品化合物溶液保留時間一致的色譜峰，質譜響應強度均較高。各陰性樣品溶液的色譜圖沒有與目標化合物保留時間一致的色譜峰，說明各陰性樣品溶液對各藥味含量的測定無干擾，專屬性較好。

2.5 標準曲線和檢出限分別精密吸取“2.3.1”項下的各對照品母液適量，置于同100 mL 量瓶中，用70%甲醇溶液配制成一系列混合對照品溶液依次測定，以濃度（X）為橫坐標，定量離子對峰面積（Y）為縱坐標，進行線性回歸，曲線方程結果見表1。以信噪比為3∶1 時的對照品濃度作為儀器檢測限。

表1 5種化合物標準曲線和檢出限

2.6 精密度、重復性和穩定性取“2.5”項下的對照品混合溶液，連續進樣6次，記錄峰面積，龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷、甘草苷和23-乙酰澤瀉醇B峰面積的相對標準偏差（RSD）分別為1.6%、1.9%、2.0%、1.8%、2.3%。

平行稱取0.2 g 樣品（批號：20201104）6 份，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液進行測定，上述各成分峰面積的RSD分別為1.5%、3.1%、1.8%、3.7%、5.1%。

取一份供試品溶液，分別放置0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、20 h 后測定，上述各成分峰面積的RSD 分別為2.3%、2.9%、2.2%、4.0%、3.7%。

2.7 加標回收率精密稱取“2.6”項下已知含量的龍膽瀉肝丸樣品6 份，每份0.1 g，置于100 mL 量瓶中，再分別加入相當于樣品中的龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷、甘草苷和23-乙酰澤瀉醇B 含量約100%的對照品溶液適量，各6 份，按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，依次測定平均回收率。上述各成分的平均回收率分別為103.04%、99.65%、100.05%、99.96%、97.32%，表明該方法回收率較好。

2.8 樣品結果精密稱量28 批次樣品，按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，每個供試品溶液平行進樣2次，記錄峰面積，代入標準曲線計算含量，樣品中龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷、甘草苷和23-乙酰澤瀉醇B 的含量。見表2。

表2 樣品中5種成分含量測定結果 （mg/g）

3 討論

本研究液相色譜條件考察了乙腈-0.02%氨溶液、乙腈-0.01 mol/L 乙酸銨溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液3 種流動相系統，根據待測成分峰形、質譜響應強度等表現情況，選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液流動相系統；質譜條件采用MRM模式進行測定，通過Mass tune調諧對5種成分進行質譜參數優化，選擇最佳的錐孔電壓、毛細管電壓、碰撞能量、正負離子掃描模式和定量離子對。樣品的提取溶劑為70%甲醇水溶液，超聲40 mim 后，5 種目標化合物可提取完全。

從含量結果可看出，各企業樣本中5 種成分的含量具有一定的差異性，如23-乙酰澤瀉醇B 的量可相差約17 倍，說明現行標準可能不能很好地控制制劑的整體質量。因為對于一些未進行定量控制的藥味，有些生產企業可能并不會嚴格把關其質量，甚至有可能以次充好，進行投料生產。

本研究建立了測定龍膽瀉肝丸（水丸）中龍膽、梔子、黃芩、甘草、澤瀉含量的UPLC-MS/MS 法，該法分析速度快、靈敏度高、專屬性強、樣品處理簡單，可作為該制劑的質量控制方法。根據藥味配伍原則，龍膽、梔子和黃芩、澤瀉、甘草分別為龍膽瀉肝丸中的君、臣、佐、使藥，建立可同時測定該5種藥味含量的方法，對于控制該制劑的整體質量具有重要意義。