溫度對過氧化氫抑制前成骨細胞MC3T3-E1細胞增殖和成骨分化的影響

耿盧婧，孫智欣，李俞辰，張 瑜，史培培

(新鄉醫學院生命科學技術學院,河南 新鄉 453003)

隨著人口老齡化的持續加速,骨質疏松癥已成為公共衛生健康的熱點問題之一。老年骨質疏松癥誘發的脆性骨折1 a內病死率高達14%[1]。研究表明,在骨質疏松癥發病過程中,氧化應激[2]、腸道微生物[3-4]、自噬[5-6]、鐵代謝[7]、細胞衰老[8]等均發揮重要作用,而氧化應激是導致骨質疏松癥中成骨細胞和破骨細胞功能失衡的關鍵因素之一[9]。此外,隨著年齡的增加,機體的體溫調節能力自然衰退[10]。溫度不僅可以調節機體的免疫能力[11],改變腸道微生物的功能[12],還會增加機體患癌風險,影響癌癥的免疫治療效果[13],甚至影響生物體的壽命[14]。然而,目前溫度與骨質疏松的關系尚不清楚?；诖?本研究選用小鼠胚胎成骨細胞前體細胞MC3T3-E1為研究對象,觀察溫度對過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)誘導的氧化損傷抑制前成骨細胞增殖和成骨分化的影響,旨在揭示溫度對骨重建的影響,為骨質疏松癥的治療提供實驗基礎和新思路。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑與儀器

小鼠胚胎成骨細胞前體細胞MC3T3-E1由河南省溫度應激分子基礎與疾病防治創新團隊贈予并保存。MEMα培養液、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、100×青霉素-鏈霉素溶液、2.5 g·L-1胰蛋白酶購自武漢普諾賽生命科技有限公司,細胞計數試劑盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)、引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司,H2O2溶液購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司,RNAiso Plus、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自寶日醫生物技術(北京)有限公司,聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)凝膠快速制備試劑盒、三色預染蛋白Maker購自上海雅酶生物醫藥科技有限公司,甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、Runt相關轉錄因子2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2)、骨橋蛋白(osteopontin,OPN)和骨鈣素(osteocalcin,OC)一抗和二抗均購自英國Abcam公司;NanoDrop 2000微量分光光度計購自美國Thermo Fisher Scientific公司,電泳儀和電泳槽購自美國Bio-Rad公司,7500熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)儀購自美國Applied Biosystems公司,Amersham Imager 600化學發光儀購自美國GE公司。

1.2 細胞培養及分組處理

將MC3T3-E1細胞接種于含體積分數20%FBS、體積分數1%100×青霉素-鏈霉素溶液的MEMα培養液中,置于37 ℃、含體積分數5%CO2的培養箱中培養,待細胞生長至匯合度為80%～90%時進行傳代。傳代時,先去除所有培養液,然后加入1 mL 胰蛋白酶(2.5 g·L-1)消化細胞,1 000 r·min-1離心5 min,收集細胞;取對數生長期MC3T3-E1細胞,以每孔1×104接種于96孔板,隨機分為0、450、500、550、600、650 μmol·L-1H2O2干預組,分別給予0、450、500、550、600、650 μmol·L-1H2O2溶液干預2 h。依據參考文獻[15-17]和預實驗結果,選擇32 ℃、37 ℃、40 ℃溫度作為實驗溫度條件。取對數生長期MC3T3-E1細胞,以每孔3×105接種于6孔板,隨機分為對照組、模型組、低溫組和高溫組。對照組細胞置于37 ℃、含體積分數5%CO2培養箱中孵育24 h;模型組細胞置于37 ℃、含體積分數5%CO2培養箱中孵育24 h,并給予H2O2刺激2 h;低溫組細胞置于32 ℃、含體積分數5%CO2培養箱中孵育24 h,并給予H2O2刺激2 h;高溫組細胞置于40 ℃、含體積分數5%CO2培養箱中孵育24 h,并予H2O2刺激2 h。

1.3 CCK-8法檢測MC3T3-E1細胞增殖能力

取0、450、500、550、600、650 μmol·L-1H2O2干預組細胞,以及對照組、模型組、低溫組和高溫組細胞,滴加新鮮含體積分數10% CCK-8工作液的完全培養液,繼續在37 ℃、含體積分數5%CO2的培養箱中培養1 h;然后,使用酶標儀檢測各孔在450 nm處的光密度值(optical density,OD)。計算細胞增殖率,細胞增殖率=(OD處理組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)×100%。實驗重復3次,取均值。

1.4 實時熒光定量PCR 法檢測 MC3T3-E1 細胞中RUNX2、OPN和OC mRNA表達水平

取對照組、模型組、低溫組和高溫組細胞,使用 RNAiso Plus提取細胞總RNA,反轉錄為cDNA,進行熒光定量PCR檢測。根據不同目的基因的mRNA序列,設計熒光定量PCR引物:β-actin上游引物序列為5′-TATGCTCTCCCTCACGCCATCC-3′,β-actin下游引物序列為5′-GTCACGCACGATTTCCCTCTCAG-3′;RUNX2上游引物序列為5′-GATGATGACACTGCCACCTCTGAC-3′,RUNX2下游引物序列為5′-TGAGGGATGAAATGCTTGGGACTG-3′;OPN上游引物序列為5′-ATGGACGACGATGATGACG-ATATG-3′,OPN下游引物序列為5′-ATGGACGACGATGATGACGATATG-3′;OC上游引物序列為5′-CAAGCAGGAGGGCAATAAGGTAGTG-3′,OC下游引物序列為5′-CGGTCTTCAAGCCATACTGGTCTG-3′。反應體系為:SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(2×)10.0 μL,上游引物(10 μmol·L-1)0.8 μL,下游引物(10 μmol·L-1)0.8 μL,ROX Reference Dye Ⅱ(50 ×)0.4 μL,滅菌水 6.0 μL。反應條件為:第1階段,95 ℃ 30 s;第2階段 95 ℃ 5 s,60 ℃ 31 s,重復 40 個循環;第3階段,95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s。以β-actin為內參,采用2-ΔΔCt法計算RUNX2、OPN、OC mRNA相對表達量。實驗重復3次,取均值。

1.5 Western blot法檢測 MC3T3-E1 細胞中RUNX2、OPN和OC蛋白表達

取對照組、模型組、低溫組和高溫組細胞,加入80 μL RIPA裂解液,置于冰上裂解30 min;4 ℃下10 000×g離心10 min,收集細胞裂解液上清液;使用二辛可酸蛋白濃度測定試劑盒測定上清液蛋白濃度后,調整不同樣品的蛋白濃度一致,按比例加入5×蛋白上樣緩沖液,100 ℃加熱15 min,冷卻至室溫后10 000×g離心5 min,取上清液;使用PAGE凝膠快速制備試劑盒(12.5%)配制凝膠進行電泳,上樣量為每孔20 ng蛋白,電泳條件為80 mV 30 min,然后調整電壓為120 mV繼續電泳90 min。電泳結束后,將樣品轉移至0.45 μm聚偏氟乙烯膜上;然后,用脫脂奶粉室溫搖床封閉2 h后,滴加GAPDH小鼠源一抗、RUNX2兔源一抗、OPN兔源一抗、OC兔源一抗(滴度均為11 000),搖床孵育過夜;洗膜3次后,添加對應種屬來源的羊抗鼠二抗或羊抗兔二抗(滴度均為11 000),室溫搖床孵育50 min。使用增強化學發光試劑盒進行顯影,Amersham Imager 600化學發光儀采集蛋白條帶照片;使用 ImageJ 軟件分析目的蛋白條帶灰度值,計算目的蛋白相對表達量,以GAPDH為內參,以目的蛋白灰度值與內參蛋白灰度值比值表示目的蛋白相對表達量。實驗重復3次,取均值。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 不同濃度H2O2誘導MC3T3-E1細胞增殖率比較

0、450、500、550、600、650 μmol·L-1H2O2干預組細胞增殖率分別為(100.00±6.49)%、(95.10±5.69)%、(88.50±4.46)%、(76.00±2.02)%、(51.20±6.87)%、(39.50±4.46)%。0、450、500 μmol·L-1H2O2干預組細胞增殖率比較差異無統計學意義(P>0.05);550、600、650 μmol·L-1H2O2干預組細胞增殖率顯著低于0、450、500 μmol·L-1H2O2干預組,且隨H2O2濃度增加細胞增殖率顯著降低(P<0.05)。為保證后續實驗有足夠的細胞,選擇 550 μmol·L-1為H2O2干預濃度。

2.2 對照組、模型組、低溫組和高溫組細胞增殖率比較

對照組、模型組、低溫組和高溫組細胞增殖率分別為(100.0±1.73)%、(77.7±2.28)%、(54.3±1.99)%、(96.2±4.56)%。模型組和低溫組細胞增殖率顯著低于對照組和高溫組,低溫組細胞增殖率顯著低于模型組,差異有統計學意義(P<0.05);對照組與高溫組細胞增殖率比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3 對照組、模型組、低溫組和高溫組細胞中RUNX2、OPN和OC mRNA相對表達量比較

模型組和高溫組細胞中RUNX2 mRNA相對表達量顯著高于對照組和低溫組,低溫組細胞中RUNX2 mRNA相對表達量顯著低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05);模型組和高溫組細胞中RUNX2 mRNA相對表達量比較差異無統計學意義(P>0.05)。模型組、低溫組和高溫組細胞中OPN mRNA相對表達量顯著高于對照組,低溫組和高溫組細胞中OPN mRNA相對表達量顯著高于模型組,低溫組細胞中OPN mRNA相對表達量顯著高于高溫組,差異有統計學意義(P<0.05)。模型組、低溫組和高溫組細胞中OC mRNA相對表達量顯著高于對照組,低溫組和高溫組細胞中OC mRNA相對表達量顯著高于模型組,差異有統計學意義(P<0.05);低溫組與高溫組細胞中OC mRNA相對表達量比較差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表1。

表1 對照組、模型組、低溫組和高溫組細胞中RUNX2、OPN和OC mRNA相對表達量比較Tab.1 Comparison of relative expression levels of RUNX2,OPN and OC mRNA in the cells among the control group,model group,low-temperature group and high-temperature group

2.4 對照組、模型組、低溫組和高溫組細胞中RUNX2、OPN和OC蛋白相對表達量比較

模型組、低溫組和高溫組細胞中RUNX2、OPN和OC蛋白相對表達量顯著低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。低溫組細胞中RUNX2、OPN蛋白相對表達量顯著低于模型組和高溫組,OC蛋白相對表達量顯著低于高溫組,差異有統計學意義(P<0.05);低溫組與模型組細胞中OC蛋白相對表達量比較差異無統計學意義(P>0.05)。高溫組細胞中RUNX2、OPN和OC蛋白相對表達量顯著高于模型組,差異有統計學意義(P<0.05)。結果見圖1和表2。

1:對照組;2:模型組;3:低溫組;4:高溫組。

表2 對照組、模型組、低溫組和高溫組細胞中RUNX2、OPN和OC蛋白相對表達量比較Tab.2 Comparison of relative expression levels of RUNX2,OPN,and OC protein in cells among the control group,model group,low-temperature group,and high-temperature group

3 討論

骨質疏松主要是由于骨量丟失增加與骨細胞生成減少所致,過量自由基導致的氧化應激是骨質疏松癥發生和進展的主要因素之一。H2O2常用于模擬自由基引起的細胞氧化損傷模型,包括骨質疏松模型[9]。本研究結果顯示,模型組細胞增殖率顯著低于對照組,RUNX2、OPN和OC mRNA相對表達量顯著高于對照組,RUNX2、OPN和OC蛋白相對表達量顯著低于對照組;說明,H2O2可抑制MC3T3-E1細胞的增殖和RUNX2、OPN和OC的蛋白翻譯,從而抑制成骨分化,導致骨質疏松。與文獻報道H2O2抑制間充質干細胞[18]、成骨細胞[19]和血管平滑肌細胞[20]成骨分化的作用一致。

溫度是生物體不可避免的應激因子之一,適度應激可為機體抵御不良因素的損傷建立保護機制[21]。此外,溫度可以通過積極的基因調控策略對機體產生影響,而不僅僅是被動的熱力學效應。有研究報道,36 ℃或15 ℃的低溫能夠激活人源細胞和線蟲體內的蛋白酶體,降解無用蛋白質,從而使人源細胞和線蟲的壽命顯著延長;但線蟲在4 ℃孵育12 h并沒有延長壽命的效果[14]。正確認識環境溫度對機體的影響,有助于更好地進行健康管理,甚至可能有助于發現退行性骨病的治療新方法和新思路。冷休克蛋白和熱休克蛋白分別是哺乳動物體內受到低溫或高溫刺激后產生的特征性的蛋白。冷休克蛋白普遍具有RNA結合能力,可穩定mRNA,促進蛋白翻譯[22]。熱休克蛋白具有分子伴侶活性,可以維持蛋白穩態從而使細胞在應激條件下存活[23]。有研究報道,熱休克蛋白70經39～42.5 ℃刺激后高表達可能抑制破骨細胞增殖[24]。本研究結果顯示,低溫組細胞增殖率顯著低于模型組,高溫組與對照組細胞增殖率比較差異無統計學意義;說明,32 ℃低溫處理可促進H2O2對MC3T3-E1細胞增殖抑制作用;而40 ℃高溫處理對于H2O2導致的MC3T3-E1細胞增殖率下降具有較好的緩解作用。

RUNX2是轉錄因子runx家族成員,可調控成骨細胞的基因表達,對成骨細胞分化和骨骼形態發生至關重要。OPN是成骨細胞分化成熟的標志。OC在調節骨鈣代謝中起到重要作用。RUNX2、OPN、OC蛋白均是研究骨分化、骨代謝的重要標志物。本研究結果顯示,與對照組相比,模型組、低溫組和高溫組細胞中RUNX2、OPN和OC蛋白的相對表達量顯著減少;與模型組相比,低溫組RUNX2、OPN蛋白的相對表達量均顯著下降,OC蛋白的相對表達量無顯著變化;高溫組細胞RUNX2、OPN和OC蛋白的相對表達量顯著高于模型組。這說明,低溫處理對H2O2引起的MC3T3-E1細胞的成骨分化抑制具有增強作用,而高溫處理可有效緩解H2O2造成的成骨分化抑制,推測其機制可能是低溫抑制了RUNX2、OPN蛋白的表達,而高溫促進了RUNX2、OPN和OC蛋白的表達。低溫組中OC蛋白表達量的變化不同于RUNX2和OPN,可能是由于基因對不同刺激的敏感度不同造成的,需要進一步的實驗驗證。

本研究結果顯示,mRNA的表達量變化和蛋白質并不完全一致,H2O2可抑制RUNX2、OPN和OC蛋白相對表達量,但RUNX2、OPN和OC mRNA相對表達量并未受到H2O2的抑制,其相對表達量顯著增加;與對照組相比,高溫組同樣出現RUNX2、OPN和OC的基因表達量增加、蛋白表達量減少的現象;低溫組細胞中RUNX2 mRNA表達量和蛋白顯著下降,OPN和OC呈現基因表達量增加、蛋白表達量減少;與模型組相比,低溫組OPN mRNA表達量上調,RUNX2、OC mRNA表達量和RUNX2、OPN、OC的蛋白表達量均顯著下降;高溫組細胞中OPN mRNA表達量顯著高于模型組,OC的基因表達量顯著低于模型組,RUNX2、OPN和OC蛋白表達量高模型組。出現這一現象,可能是因為mRNA濃度只能部分解釋蛋白質濃度的變化,復雜而多樣的調控機制導致轉錄組和翻譯組之間定量關系的差異[25]。此外,本研究中僅檢測了蛋白質和mRNA的相對表達量,并不能用來直接比較蛋白質和mRNA水平[26]。在特定穩態條件下,影響蛋白質表達水平的翻譯和蛋白質降解的基因特異性調控仍需要進一步的研究。

4 結論

H2O2可抑制MC3T3-E1細胞增殖和成骨分化,低溫可促進H2O2對MC3T3-E1細胞增殖和成骨分化的抑制作用,高溫則可緩解H2O2對MC3T3-E1細胞增殖和成骨分化的抑制作用。RUNX2、OPN和OC蛋白可能在溫度調控成骨分化的過程中有重要作用,然而其具體的信號通路還需要進一步研究。