雷公藤甲素對大鼠卵巢氧化應激及顆粒細胞線粒體自噬的影響

嚴 謹，鄧蒂斯，吳克明

(1.陜西中醫藥大學基礎醫學院,陜西 咸陽 712046;2.成都中醫藥大學附屬醫院婦科,四川 成都 610000)

雷公藤為衛矛科植物,中藥以雷公藤根、葉及花入藥,具有殺蟲、消炎、解毒的功效。臨床上常用雷公藤治療風濕免疫性疾病[1]、慢性腎炎[2]、哮喘[3]等多種疾病。雷公藤甲素(triptolide,TP)是雷公藤的主要有效成分,屬環氧二萜內酯化合物,也是引起不良反應的主要成分[4-7]。臨床應用雷公藤制劑的主要不良反應有女性月經紊亂、閉經、卵巢功能減退等,因此,TP的生殖毒性一直備受關注,與此同時也給雷公藤制劑的臨床應用帶來巨大挑戰。本課題組前期研究發現,采用TP 400 μg·kg-1·d-1的劑量連續灌胃60 d,可造成雌性育齡期大鼠卵巢功能減退[8-9]。但該造模法致大鼠卵巢功能減退的具體分子機制尚未完全闡明。本研究通過TP灌胃建立卵巢功能減退大鼠模型,觀察TP對大鼠卵巢氧化應激、顆粒細胞線粒體自噬及卵巢功能的影響,旨在為雷公藤生殖毒性的防治提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

3月齡性成熟雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠50只,體質量220～260 g,購自四川成都達碩生物科技有限公司,大鼠生產許可證號:SCXY(川)2020-030,使用許可證號:SYXK(川)2019-189。所有大鼠于室溫22～25 ℃、相對濕度45%～65%、12 h/12 h明暗交替環境中分籠適應性喂養5 d,清潔級飼養。本研究通過陜西中醫藥大學倫理委員會審批,實驗中嚴格執行所有倫理程序。

1.2 主要試劑與儀器

TP購自成都德思特生物技術有限公司,組織標本固定液購自福晨(天津)化學試劑有限公司,蘇木精、伊紅染液購自武漢塞維爾生物科技有限公司,抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone,AMH)、雌二醇(estradiol,E2)、促卵泡生成素(follicle stimulating hormone,FSH)酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA )試劑盒購自上海茁彩生物科技有限公司,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所;Panthera數碼三目攝像顯微鏡購自成都麥克迪奧有限公司,JEM-1400FLASH透射電子顯微鏡購自日本JEOL公司,徠卡-2016轉輪式切片機、EM UC7超薄切片機購自德國徠卡公司,BMJ-A包埋機購自常州郊區中威電子儀器廠,SpectraMAX Plus384酶標儀購自上海美谷分子儀器有限公司,UPH-Ⅱ-10T優普超純水制造系統購自成都超純科技有限公司。

1.3 造模前合格動物篩選

將50只健康雌性SD大鼠于每日9:00行陰道脫落細胞涂片,光鏡下觀察每只大鼠動情周期(動情前期持續時間17～21 h,脫落細胞涂片上見大量有核上皮細胞和少量角化上皮細胞;動情期持續時間9～15 h,脫落細胞涂片上見大量角化上皮;動情后期持續時間10～14 h,脫落細胞涂片上見角化上皮和白細胞;動情間期持續時間 60～70 h,脫落細胞涂片上見大量白細胞)。連續觀察2個動情周期,篩選出25只動情周期正常的大鼠為合格動物,以備后續實驗使用。

1.4 動物分組及模型制備、鑒定

將篩選出的25只大鼠按隨機數字表法分為空白對照組、實驗1組、實驗2組、實驗3組和實驗4組,每組5只。稱取TP 0.025 g,置于 25 mL燒杯中,加入700 μL二甲基亞砜溶液和13.3 mL生理鹽水攪勻備用,最終按照每只大鼠實際體質量將一定量的母液稀釋后進行灌胃。實驗1組大鼠每日給予400 μg·kg-1的TP灌胃1次,連續灌胃30 d;實驗2組大鼠每日給予400 μg·kg-1的TP灌胃1次,連續灌胃40 d;實驗3組大鼠每日給予 500 μg·kg-1的TP灌胃1次,連續灌胃30 d;實驗4組大鼠每日給予 500 μg·kg-1的TP灌胃1次,連續灌胃40 d;空白對照組大鼠每日給予10 mL·kg-1蒸餾水灌胃1次,連續灌胃40 d。各組大鼠均于灌胃結束前第10天開始,每日9:00使用陰道灌洗法采集陰道脫落上皮細胞:移液槍吸取30 μL生理鹽水,緩慢插入大鼠陰道內3～5 mm,吹打3～5次,見液體變渾濁,立即回抽;將每只大鼠的陰道回抽液制備2份陰道涂片,進行巴氏染色制片,光鏡下觀察,出現動情周期紊亂或延長確定造模成功。

1.5 ELISA法檢測各組大鼠血清中AMH、E2、FSH水平

最后1次給藥24 h后,各組大鼠腹腔注射3 g·L-1戊巴比妥鈉(10 mL·kg-1)進行麻醉,腹主動脈取血,3 000 r·min-1離心3 min,取上清液,應用ELISA法檢測血清中AMH、E2、FSH水平,嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.6 蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色觀察各組大鼠卵巢組織病理變化

取各組大鼠右側卵巢,用體積分數10%中性甲醛固定,脫水,石蠟包埋,制作厚約4 μm切片。每只大鼠選3張切片,每張切片選擇4個視野,在100倍鏡下觀察大鼠卵巢形態學變化,比較各組間大鼠卵泡數量、閉鎖卵泡數量及顆粒細胞層脫落、壞死、囊性擴張等病理變化。

1.7 各組大鼠卵巢組織中SOD活性和MDA水平測定

取各組大鼠右側卵巢組織,冰浴條件下加入生理鹽水,勻漿5 min,3 000 r·min-1離心10 min,吸取上清液,采用SOD測定試劑盒檢測SOD活性,MDA測定試劑盒檢測MDA水平,首先配置酶工作液,再進行加樣,最后混勻,37 ℃孵育20 min,采用酶標儀于 532 nm處檢測各管吸光度值。

1.8 透射電子顯微鏡觀察各組大鼠卵巢顆粒細胞線粒體形態結構變化及線粒體自噬情況

取各組大鼠左側新鮮卵巢組織,戊二醛固定,樹脂包埋,枸櫞酸鉛染色,風干后,采用JEM-1400PLUS透射電子顯微鏡觀察顆粒層細胞線粒體形態、線粒體自噬情況。

1.9 流式細胞儀檢測各組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率

無菌條件下取各組大鼠左側卵巢組織,置于預冷的無菌磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer solution,PBS)溶液中,去除周圍脂肪組織、表面包膜,PBS清洗,置于預冷混合營養液F-12培養基中,用細針頭刺破卵泡,在顯微鏡下將顆粒細胞釋放入培養基中,反復吹打使之分散成為單個懸浮細胞。加入 0.25 g·L-1胰蛋白酶,于37 ℃、含體積分數5% CO2培養箱中消化60 min,其間反復吹打2～3次,加入含有胎牛血清的培養液終止消化,過細胞篩,2 500 r·min-1離心5 min,洗滌,棄上清,收集細胞,1 500 r·min-1離心5 min,收集至1.5 mL離心管中,1 500 r·min-1離心5 min,加入不含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶消化,1 500 r·min-1離心5 min,用PBS清洗2遍,按細胞凋亡檢測試劑盒說明加入試劑,進行膜聯合蛋白V-FITC/碘化丙啶染色,1 h內上流式細胞儀檢測卵巢顆粒細胞凋亡率。

1.10 統計學處理

2 結果

2.1 5組大鼠血清中AMH、E2、FSH水平比較

與空白對照組比較,實驗1組、實驗2組、實驗3組和實驗4組大鼠血清中AMH、E2水平顯著降低,FSH水平顯著增高,差異有統計學意義(P<0.05)。與實驗1組比較,實驗2組、實驗3組、實驗4組大鼠血清中AMH、E2水平顯著降低,FSH水平顯著增高,差異有統計學意義(P<0.05)。實驗2組、實驗3組、實驗4組大鼠血清中AMH、E2、FSH水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表1。

表1 5組大鼠血清AMH、E2、FSH水平比較Tab.1 Comparison of serum AMH,E2 and FSH levels of rats among the five groups

2.2 5組大鼠卵巢組織病理變化

空白對照組大鼠卵巢組織被膜完整,皮質區原始卵泡、初級卵泡及次級卵泡等數量較為正常,各級卵泡發育正常,閉鎖卵泡少見,黃體數量較少;髓質區纖維結締組織排列緊密,未見明顯水腫或壞死。與空白對照組相比,實驗1組、實驗2組、實驗3組和實驗4組大鼠卵巢組織可見卵泡數量減少,閉鎖卵泡增多,顆粒層卵泡細胞壞死、脫落和卵泡囊性擴張等病理改變。實驗1組大鼠卵巢組織病理改變程度相對較輕,閉鎖卵泡少,顆粒層細胞壞死不多;實驗4組大鼠卵巢組織病變程度相對最重,可見較多閉鎖卵泡和顆粒細胞層壞死、脫落;實驗2組、實驗3組大鼠卵巢組織病變程度相對輕于實驗4組,閉鎖卵泡較少,顆粒細胞層不同程度壞死和卵泡囊性擴張。結果見圖1。

A:空白對照組;B:實驗1組;C:實驗2組;D:實驗3組;E:實驗4組。

2.3 5組大鼠卵巢組織中SOD活性及MDA水平比較

與空白對照組比較,實驗1組、實驗2組、實驗3組和實驗4組大鼠卵巢組織中SOD活性顯著降低,MDA水平顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05)。與實驗1組比較,實驗2組、實驗3組、實驗4組大鼠卵巢組織中SOD活性顯著降低,MDA水平顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05)。實驗2組、實驗3組、實驗4組大鼠卵巢組織中SOD活性、MDA水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表2。

表2 5組大鼠卵巢組織中SOD活性及MDA水平比較Tab.2 Comparison of SOD activity and MDA levels in ovarian tissue of rats among the five groups

2.4 5組大鼠卵巢顆粒細胞線粒體形態、結構及線粒體自噬情況

空白對照組大鼠的卵巢顆粒細胞形態結構正常,細胞核呈不規則多邊形,染色質分布均勻,以常染色質為主,核膜清晰完整,細胞質中可見線粒體等細胞器且結構完整清晰(圖2A)。實驗1組、實驗2組、實驗3組和實驗4組大鼠卵巢顆粒細胞細胞質中可見不同程度的線粒體自噬(紅色箭頭所示),實驗2組、實驗3組、實驗4組大鼠線粒體自噬程度重于實驗1組,實驗3組、實驗4組大鼠線粒體自噬程度重于實驗2組,實驗3組與實驗4組大鼠粒體自噬程度相當,其中實驗3組和實驗4組電鏡下可見卵巢顆粒細胞細胞質中含較多線粒體自噬小體,多數線粒體發生輕度腫脹,部分線粒體嵴結構消失,粗面內質網擴張呈囊狀(圖2B、圖2C、圖2D、圖2E)。

A:空白對照組;B:實驗1組;C:實驗2組;D:實驗3組;E:實驗4組?！?該紅色箭頭處代表自噬小體,表明出現線粒體自噬。

2.5 5組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率比較

空白對照組、實驗1組、實驗2組、實驗3組和實驗4組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率分別為(6.23±2.49)%、(18.53±11.19)%、(20.29±8.34)%、(21.38±8.24)%、(28.48±11.66)%。實驗1組、實驗2組、實驗3組和實驗4組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率均顯著高于空白對照組,實驗2組、實驗3組和實驗4組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率顯著高于實驗1組,實驗3組、實驗4組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率顯著高于實驗2組,實驗4組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率顯著高于實驗3組,差異有統計學意義(P<0.05)。結果見圖3。

3 討論

臨床上雷公藤制劑常應用于抗腫瘤、風濕免疫性疾病等領域,TP是雷公藤的主要有效成分,TP生殖毒性日漸成為阻礙其進一步發展的重大障礙。TP生殖毒性在女性主要見于卵巢功能減退,具體表現為月經周期紊亂、閉經及卵巢功能早衰等。卵巢功能減退是指卵巢內可募集卵泡數量減少和質量降低,并伴隨低雌激素及高促性腺激素,臨床表現為月經紊亂或閉經,生育力降低或不孕。近年來,卵巢功能減退類疾病發病率增高[10],其成為女性生殖醫學研究的重點和熱點[11]。該類疾病的病因和病理機制尚未完全闡明,且無特效治療藥物,使用TP建立卵巢功能減退大鼠模型可為深入研究該疾病的發病機制提供有效的動物模型。近年臨床研究發現,卵巢功能減退女性的卵巢顆粒細胞中線粒體DNA數量和結構改變,進而導致線粒體功能障礙,是顆粒細胞凋亡即卵泡閉鎖的主要原因[12]。線粒體自噬可通過清理受損傷的線粒體來保護顆粒細胞的結構和功能正常。既往動物實驗研究表明,卵巢內氧化應激的累積會造成卵巢內分泌失調[13],氧化應激發生后,顆粒細胞凋亡亦隨之增加,由此引發更多卵泡閉鎖[14]。線粒體為細胞代謝、細胞周期和細胞信號轉導提供ATP,發生卵巢氧化應激后,線粒體內膜通透性增加、膜電位下降,導致氧化磷酸化受損,出現能量代謝障礙,此時線粒體發生腫脹[15-16];隨著線粒體結構異常,線粒體功能障礙進一步加重[17]。因此,在TP誘導的卵巢功能減退大鼠模型中,藥物劑量和作用時間是否與模型大鼠的卵巢損害成正比、TP是否參與誘導顆粒細胞氧化應激損傷、線粒體功能障礙及線粒體自噬等問題亟待明確。

本研究通過TP灌胃,成功構建了大鼠卵巢功能減退模型,并根據TP灌胃劑量和給藥時間的不同,將其分為空白對照組、實驗1組(400 μg·kg-1·d-1TP,連續30 d)、實驗2組(400 μg·kg-1·d-1TP,連續40 d)、實驗3組(500 μg·kg-1·d-1TP,連續30 d)和實驗4組(500 μg·kg-1·d-1TP,連續40 d),結果顯示,與空白對照組相比,實驗1組、實驗2組、實驗3組和實驗4組大鼠血清中AMH、E2水平顯著降低,FSH水平顯著增高,說明TP可通過影響大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸的內分泌功能,造成卵巢內分泌功能紊亂和卵巢儲備功能下降。從數據上來看,實驗2組、實驗3組、實驗4組大鼠血清中AMH、E2水平呈下降趨勢,FSH水平呈上升趨勢,但實驗2組、實驗3組、實驗4組大鼠血清中AMH、E2、FSH水平比較差異無統計學意義,可能是納入的樣本量較少所致。另外,本研究結果發現,與空白對照組相比,實驗1組、實驗2組、實驗3組和實驗4組大鼠卵巢組織卵泡數量減少,閉鎖卵泡增多,顆粒層卵泡細胞壞死、脫落和卵泡囊性擴張;其中實驗1組大鼠卵巢組織病理改變程度相對較輕,閉鎖卵泡少,顆粒層細胞壞死不多;實驗4組大鼠卵巢組織病變程度相對最重,可見較多閉鎖卵泡和顆粒細胞層壞死、脫落;實驗2組和實驗3組大鼠卵巢組織病變程度相對輕于實驗4組,閉鎖卵泡較少,顆粒細胞層不同程度壞死和卵泡囊性擴張。以上結果表明,TP劑量和干預時間與卵巢組織損傷有關;TP造成大鼠卵巢功能減退以卵巢內卵泡數量減少、閉鎖卵泡增加并伴隨低E2和高促性腺激素為特征,AMH降低進一步證實了卵巢儲備功能的降低。

另外,本研究結果顯示,隨著TP劑量的增加和給藥時間延長,各實驗組大鼠卵巢氧化應激損傷逐漸加重,其中與空白對照組比較,實驗1組、實驗2組、實驗3組和實驗4組大鼠卵巢組織SOD活性顯著降低、MDA水平顯著增高,且透射電鏡觀察發現,與空白對照組相比,實驗1組、實驗2組、實驗3組和實驗4組大鼠卵巢顆粒細胞的細胞質中均可見不同程度的線粒體自噬;與實驗1組比較,實驗2組、實驗3組、實驗4組大鼠卵巢組織SOD活性顯著降低,MDA水平顯著升高,且實驗2組、實驗3組、實驗4組大鼠線粒體自噬程度重于實驗1組;實驗2組、實驗3組、實驗4組大鼠卵巢組織SOD及MDA水平比較差異無統計學意義,但實驗3組、實驗4組大鼠線粒體自噬程度重于實驗2組,而實驗3組與實驗4組自噬程度相當;以上結果提示,TP可造成卵巢氧化應激損傷和線粒體自噬增加,其損傷可能與TP作用時間和劑量有關,隨著氧化應激損傷加重,線粒體自噬程度亦逐步增加;但實驗3組與實驗4組的顆粒細胞內線粒體自噬水平基本持平,說明線粒體自噬到達一定程度后,不再隨著TP干預時間的繼續增加而持續增強。本研究結果顯示,實驗1組、實驗2組、實驗3組和實驗4組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率均顯著高于空白對照組,實驗2組、實驗3組和實驗4組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率顯著高于實驗1組,實驗3組、實驗4組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率顯著高于實驗2組,實驗4組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率顯著高于實驗3組;提示,TP最終可造成卵巢顆粒細胞凋亡,卵巢顆粒細胞凋亡率與TP作用時間和劑量有關。

4 結論

采用TP灌胃給藥可成功構建大鼠卵巢功能減退模型,TP劑量和干預時間與卵巢組織損傷有關。隨著TP劑量和干預時間的增加,大鼠卵巢氧化應激水平逐漸增高,顆粒細胞內線粒體腫脹、線粒體嵴消失的程度逐漸加重,線粒體自噬增加。TP誘導的卵巢氧化應激損傷可能是引發卵巢功能低下的重要因素,其作用機制可能是通過卵巢氧化應激影響卵巢內分泌功能和誘導顆粒細胞凋亡等病理生理過程而完成。卵巢顆粒細胞線粒體自噬雖然能清除氧化應激損傷,但隨著氧化應激的累積,超出機體自噬清除能力,線粒體自噬到達一定程度后不再隨著TP干預時間的繼續增加而持續增強,此時卵巢損傷則進行性加重,最終造成不可逆性損害。