細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子、基質金屬蛋白酶-9和賴氨酸去甲基化酶6B在浸潤性乳腺癌組織中的表達及其病理診斷價值

姜 黃，鄭麗華，徐小艷，王建君，徐憲偉，王 娜，邢晨菊，魯顯宇

(1.河南中醫藥大學第五臨床醫學院/鄭州人民醫院病理科,河南 鄭州 450003;2.河南醫學高等?？茖W校人體解剖學教研室,河南 鄭州 450000)

在過去20 a中,我國乳腺癌的發病率和病死率呈快速上升趨勢[1],雖然手術、放化療、免疫治療和聯合治療等手段大大提高了乳腺癌患者的生活質量,但患者的總生存率仍無明顯改善,乳腺癌依然嚴重威脅著女性群體的健康。侵襲和轉移是導致乳腺癌患者復發和死亡的主要原因,尋找乳腺癌新的標志物有助于乳腺癌的診斷、治療和預后判斷。細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN)是一種高度糖基化的單次跨膜蛋白,屬于免疫球蛋白超家族分子成員,在正常組織中不表達或低表達,在包括乳腺癌在內的多種腫瘤中高表達,與腫瘤的侵襲、轉移和預后密切相關[2-4],可作為預判腫瘤不良預后的因子之一?；|金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)位于染色體20q11.1-13.1,屬于基質金屬蛋白酶家族,其主要功能是降解細胞外基質,在乳腺癌等多種腫瘤中高表達,對腫瘤的診療和預后有重要的臨床意義[5]。賴氨酸去甲基化酶6B(lysine demethylase 6B,KDM6B)是賴氨酸27位點三甲基組蛋白H3去甲基化酶,其異常表達與多種腫瘤的發生發展有關,但其在乳腺癌中的表達及生物作用機制尚不完全清楚。目前,關于KDM6B在乳腺癌組織中屬于抑癌基因還是促癌基因報道不一,最近的文獻表明,KDM6B在乳腺癌中的作用機制是通過促進β-連環蛋白的核內降解來阻止M2型巨噬細胞的極化[6]。EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白在乳腺癌中的表達情況、這3種蛋白之間的相關性及其在乳腺癌的病理診斷中的價值目前尚未見文獻報道。本研究采用免疫組織化學法檢測EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白在浸潤性乳腺癌組織中的表達,分析其與浸潤性乳腺癌臨床病理特征的關系及三者的相關性,并探討這3個指標在浸潤性乳腺癌病理診斷中的價值,旨在為浸潤性乳腺癌的臨床病理診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2014年1月至2017年12月河南中醫藥大學第五臨床醫學院/鄭州人民醫院病理科保存的124例浸潤性乳腺癌患者的手術切除活檢標本為研究對象。納入標準:(1)經病理學檢查診斷為原發浸潤性乳腺癌,組織學類型為浸潤性導管癌;(2)女性患者;(3)經過乳腺保乳或乳腺根治性切除術;(4)患者臨床資料齊全。排除標準:(1)術前接受放化療或中醫治療;(2)穿刺標本;(3)轉移性乳腺癌?；颊吣挲g29～73歲,其中<50歲者41例,≥50歲者83例;腫瘤直徑:≤2 cm者61例,2～5 cm者42例,>5 cm者21例;按照2019年世界衛生組織(World Health Organization,WHO)推薦的Nottingham組織學分級系統標準[7],Ⅰ級19例,Ⅱ級70例,Ⅲ級35例;無淋巴結轉移74例,有淋巴結轉移50例;TNM分期:Ⅰ～Ⅱ 期54例,Ⅲ～Ⅳ 期70例。另選取同期保存的低級別導管內癌組織標本20例、高級別導管內癌組織標本27例、距離浸潤性乳腺癌>1 cm 處癌旁組織標本22例作為對照組。

1.2 主要試劑與儀器

KDM6B一抗兔抗人多克隆抗體購自英國Abcam公司,EMMPRIN、MMP-9蛋白一抗兔抗人單克隆抗體、二抗及二氨基聯苯胺(diaminobenzidine,DAB)、抗原修復液、BOX-1002避光免疫組織化學濕盒購自福州邁新生物技術開發有限公司;BPX-82電熱恒溫培養箱購自上海博訊醫療生物儀器股份有限公司,HPC-1001不銹鋼高壓鍋購自福州邁新生物技術開發有限公司,Leica DM3000顯微鏡購自德國Leica公司。

1.3 免疫組織化學法檢測乳腺癌旁組織、低級別導管內癌、高級別導管內癌及浸潤性乳腺癌組織中 EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白的表達

對124例浸潤性乳腺癌和對照組標本進行切片(厚 3～4 μm),二甲苯脫蠟,乙醇水化,抗原修復5 min,其中EMMPRIN、MMP-9蛋白使用檸檬酸(pH 6.0)修復, KDM6B使用乙二胺四乙酸修復;滴加 EMMPRIN、MMP-9、KDM6B一抗(滴度均為1200),在免疫組織化學濕盒內37 ℃孵育1.5～2.0 h;用磷酸鹽緩沖液洗滌后,滴加二抗(即用型),室溫下孵育20～30 min;DAB顯色,蘇木精復染,梯度乙醇脫水,二甲苯透明后封片,顯微鏡下觀察3種抗體在乳腺癌旁組織、低級別導管內癌、高級別導管內癌及浸潤性乳腺癌組織中的表達情況,其中EMMPRIN蛋白表達主要定位于細胞膜,染色呈棕黃色;MMP-9蛋白表達主要定位于細胞質,染色呈棕黃色;KDM6B蛋白表達主要定位于細胞核,染色呈棕黃色。采用ImagePro Plus圖像分析軟件分析EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白在乳腺癌旁組織、低級別導管內癌、高級別導管內癌及浸潤性乳腺癌組織中的相對表達量:在400倍鏡下,從每張切片中取10個著色最強的視野輸入計算機,將其轉換成灰色照片,導入ImagePro Plus圖像分析軟件,檢測每個陽性細胞的灰度,同時檢測相應的10個視野的背景灰度,參照文獻[8]的方法計算每張切片的陽性單位(positive unit,PU)值,以PU值代表EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白的相對表達量;實驗重復3次,取均值。

1.4 浸潤性乳腺癌組織中EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白陽性強度與患者臨床病理特征的關系分析

通過查詢病歷資料收集124例浸潤性乳腺癌患者的年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、WHO分級、淋巴結轉移及TNM分期等一般臨床資料,分析浸潤性乳腺癌組織中EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白相對表達量與臨床病理特征的關系。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白在乳腺癌旁組織、低級別導管內癌、高級別導管內癌及浸潤性乳腺癌組織中的表達

浸潤性乳腺癌組織中的EMMPRIN蛋白表達主要定位于細胞膜,少量定位于細胞質,染色呈棕黃色、強陽性表達,在乳腺間質的纖維細胞中有微弱表達(圖1A1);乳腺癌旁組織中EMMPRIN蛋白幾乎不表達(圖1A2);低級別導管內癌組織中EMMPRIN蛋白呈少量表達(圖1A3);高級別導管內癌組織中MMPRIN蛋白呈中等強度表達(圖1A4)。MMP-9蛋白表達主要定位于浸潤性乳腺癌細胞的細胞質,呈棕黃色、強陽性表達,在乳腺間質的纖維細胞中有少量表達(圖1B1);乳腺癌旁組織中MMP-9蛋白呈少量表達(圖1B2);低級別導管內癌組織中MMP-9蛋白呈少量表達(圖1B3);高級別導管內癌組織中MMP-9蛋白呈中等強度表達(圖1B4)。浸潤性乳腺癌組織中KDM6B蛋白表達主要定于細胞核,呈棕黃色、弱至中等強度表達,在乳腺間質的纖維細胞中有少量表達(圖1C1);乳腺癌旁組織中KDM6B蛋白呈強陽性表達(圖1C2);低級別導管內癌組織中KDM6B蛋白呈強陽性表達(圖1C3);高級別導管內癌組織中KDM6B蛋白呈弱至中等強度表達(圖1C4)。

A1、B1、C1:浸潤性乳腺癌;A2、B2、C2:乳腺癌旁組織;A3、B3、C3:低級別導管內癌;A4、B4、C4:高級別導管內癌。

2.2 不同組織中EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白相對表達量比較

不同組織中EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白的相對表達量比較差異均有統計學意義(F=75.140、41.860、57.497,P<0.05)。高級別導管內癌和浸潤性乳腺癌組織中EMMPRIN、MMP-9蛋白的相對表達量顯著高于癌旁組織和低級別導管內癌組織,KDM6B蛋白的相對表達量顯著低于癌旁組織和低級別導管內癌組織,差異有統計學意義(P<0.05)。浸潤性乳腺癌組織中EMMPRIN、MMP-9蛋白的相對表達量顯著高于高級別導管內癌組織,KDM6B蛋白的相對表達量顯著低于高級別導管內癌組織,差異有統計學意義(P<0.05)。乳腺癌旁組織與低級別導管內癌組織中EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白的相對表達量比較差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表1。

表1 不同組織中EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白的相對表達量比較 Tab.1 Comparison of the relative expression of EMMPRIN,MMP-9,and KDM6B protein in different tissues

2.3 EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白相對表達量與浸潤性乳腺癌臨床病理特征的關系

EMMPRIN、KDM6B蛋白的相對表達量與浸潤性乳腺癌患者的年齡、腫瘤部位和腫瘤直徑無關(P>0.05);MMP-9蛋白的相對表達量與浸潤性乳腺癌患者的年齡和腫瘤部位無關(P>0.05);MMP-9蛋白的相對表達量與浸潤性乳腺癌的腫瘤直徑有關(P<0.05)。EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白的相對表達量與浸潤性乳腺癌的WHO分級、淋巴結轉移、TNM 分期有關(P<0.05);其中在浸潤性乳腺癌WHO分級 Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級中,EMMPRIN、MMP-9蛋白的相對表達量依次升高,KDM6B蛋白的相對表達量依次降低,差異有統計學意義(P<0.05);浸潤性乳腺癌淋巴結有轉移組EMMPRIN、MMP-9蛋白的相對表達量顯著高于無淋巴結轉移組,KDM6B蛋白的相對表達量顯著低于無淋巴結轉移組,差異有統計學意義(P<0.05);TNM分期 Ⅲ～Ⅳ期組EMMPRIN、MMP-9蛋白的相對表達量顯著高于Ⅰ～Ⅱ期組,KDM6B蛋白的相對表達量顯著低于Ⅰ～Ⅱ期組,差異有統計學意義(P<0.05)。在浸潤性乳腺癌腫瘤直徑≤2 cm、2～5 cm、>5 cm組中,MMP-9蛋白的相對表達量依次升高,差異有統計學意義(P<0.05);EMMPRIN、KDM6B蛋白比較差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表2。

表2 EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白相對表達量與浸潤性乳腺癌臨床病理特征的關系Tab 2 Relationship between relative expression of EMMPRIN,MMP-9,KDM6B protein and clinical pathological characteristics of invasive breast cancer

2.4 浸潤性乳腺癌組織中EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白的相關性

Spearman相關性分析顯示,浸潤性乳腺癌組織中EMMPRIN與MMP-9蛋白的表達呈顯著正相關(r=0.990,P=0.000);EMMPRIN與KDM6B蛋白的表達呈顯著負相關(r=-0.606,P=0.000);MMP-9與KDM6B蛋白的表達呈顯著負相關(r=-0.612,P=0.000)。

2.5 EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白對浸潤性乳腺癌的診斷價值

ROC曲線分析顯示,EMMPRIN蛋白診斷浸潤性乳腺癌的曲線下面積(area under the curve,AUC)為 0.875[95%置信區間(confidence interval,CI):0.823～0.926,P<0.05],最佳界值為10.043,敏感度為 79.0%,特異度為76.8%。MMP-9診斷浸潤性乳腺癌的AUC為 0.863(95%CI:0.808～0.917,P<0.05),最佳界值為10.070,敏感度為74.2%,特異度為76.8%。KDM6B診斷浸潤性乳腺癌的AUC為0.267(95%CI:0.196～0.338,P<0.05),最佳界值為11.003,敏感度為71.0%,特異度為98.6%。結果見圖2。

圖2 EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白診斷浸潤性乳腺癌的ROC曲線Fig.2 ROC curves of EMMPRIN,MMP-9,and KDM6B protein in diagnosing invasive breast cancer

3 討論

乳腺癌已成為世界上發病率最高的女性惡性腫瘤,是導致女性死亡的第一大惡性腫瘤[9]。乳腺癌的發生發展是多階段、多因素、多基因共同作用的復雜過程,其侵襲和轉移相關機制尚不明確。EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白在乳腺癌中的定量表達、相關性及病理診斷價值尚未見文獻報道。本研究通過免疫組織化學法檢測124例浸潤性乳腺癌組織中EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白的表達情況,采用圖像分析技術對上述蛋白進行定量檢測,分析其與浸潤性乳腺癌臨床病理特征的關系、3種蛋白之間的相關性及其在浸潤性乳腺癌中的診斷價值,以期為浸潤性乳腺癌的臨床病理診斷提供參考。

既往研究顯示,EMMPRIN在結直腸癌、非小細胞肺癌、食管癌等腫瘤中的表達與腫瘤的發生發展密切相關[10-12],其高表達提示腫瘤的預后不良。也有研究顯示,EMMPRIN在乳腺癌中高表達,與乳腺癌WHO分級、淋巴結轉移狀況和TNM分期均相關[13]。本研究結果顯示,EMMPRIN蛋白在乳腺癌旁組織中幾乎不表達,低級別導管內癌組織中 EMMPRIN 蛋白呈少量表達,高級別導管內癌組織中EMMPRIN蛋白呈中等強度表達,浸潤性乳腺癌組織中 EMMPRIN蛋白呈高表達;高級別導管內癌和浸潤性乳腺癌組織中EMMPRIN蛋白的相對表達量顯著高于乳腺癌旁組織和低級別導管內癌,浸潤性乳腺癌組織中EMMPRIN蛋白的相對表達量顯著高于高級別導管內癌;浸潤性乳腺癌的WHO分級Ⅲ級、淋巴結有轉移及TNM分期Ⅲ～Ⅳ期組的EMMPRIN蛋白表達量較高。本研究EMMPRIN蛋白定量研究結果與既往文獻研究結果[13]相似,提示EMMPRIN蛋白在乳腺癌侵襲和進展的過程中發揮了促癌作用。

MMP-9能降解細胞外基質而促進腫瘤的浸潤和轉移,在多種腫瘤中高表達,對腫瘤的預后和治療有重要的臨床意義,研究表明,乳腺癌高表達MMP-9與其浸潤轉移密切相關[14-15]。本研究結果顯示,乳腺癌旁組織和低級別導管內癌組織中MMP-9蛋白呈少量表達,高級別導管內癌組織EMMP-9蛋白呈中等強度表達,浸潤性乳腺癌組織中MMP-9蛋白呈高表達;高級別導管內癌和浸潤性乳腺癌組織中MMP-9蛋白的相對表達量顯著高于乳腺癌旁組織和低級別導管內癌,浸潤性乳腺癌組織中MMP-9蛋白的相對表達量顯著高于高級別導管內癌,乳腺癌旁組織與低級別導管內癌組織中MMP-9蛋白的相對表達量比較差異無統計學意義;而浸潤性乳腺癌患者中,有淋巴結轉移者、腫瘤直徑較大者、WHO分級Ⅲ級及TNM分期高者的MMP-9蛋白的表達量增加。提示,MMP-9蛋白的高表達與乳腺癌浸潤和轉移密切相關。

有關KDM6B在乳腺癌中表達的文獻報道不一。胡楠等[16]研究表明,KDM6B過表達可抑制乳腺癌細胞的增殖。而呂娟等[17]研究顯示,KDM6B蛋白在乳腺癌中的表達顯著高于乳腺癌旁組織,其高表達與乳腺癌的TNM分期、雌激素受體表達、孕激素受體表達及淋巴結轉移有關。本研究結果顯示,高級別導管內癌和浸潤性乳腺癌組織中KDM6B蛋白的相對表達量顯著低于乳腺癌旁組織和低級別導管內癌,浸潤性乳腺癌組織中KDM6B蛋白的相對表達量顯著低于高級別導管內癌,且KDM6B蛋白在乳腺癌WHO分級Ⅲ級、淋巴結有轉移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期組中的表達較低,表明KDM6B蛋白抑制了乳腺癌的浸潤和轉移,在乳腺癌的發生發展中扮演抑癌基因的角色。本研究結果與呂娟等[17]的研究不一致,分析其原因如下:(1)免疫組織化學判讀方法不一,本研究采用的是定量判讀,而呂娟等[17]采用的是定性判讀;(2)可能與選取的乳腺癌組織學類型不同有關,本研究中的浸潤性乳腺癌組織學類型為浸潤性導管癌,而呂娟等[17]并未闡明其具體研究的是哪一種組織學亞型的乳腺癌;(3)樣本量不同,本研究樣本量為124例,呂娟等[17]研究中的樣本量為47例。

在EMMPRIN、MMP-9和KDM6B三者的關系中,有關EMMPRIN與MMP-9相關性的報道較多,而目前有關EMMPRIN與KDM6B的相關性、MMP-9與KDM6B的相關性尚未見相關文獻報道。腫瘤的發生發展是多個癌基因和抑癌基因表達共同協作的結果。研究表明,EMMPRIN高表達能夠上調MMPs的表達,并促進腫瘤細胞的浸潤、轉移及腫瘤血管的形成[18-19];另有研究顯示,在結直腸癌、肺腺癌、前列腺癌等腫瘤組織中,EMMPRIN與MMP-9的表達均呈正相關[20-22]。本研究結果顯示,浸潤性乳腺癌組織中EMMPRIN與MMP-9蛋白表達呈正相關,與上述研究結果一致。另外,本研究結果顯示,浸潤性乳腺癌組織中EMMPRIN與KDM6B蛋白的表達呈顯著負相關,MMP-9與KDM6B蛋白的表達呈顯著負相關。YU等[23]研究報道,在頸部鱗狀細胞癌中,EMMPRIN可以通過激活核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB) 信號通路促進腫瘤的進展。PARK等[24]在惡性黑色素瘤細胞系研究中發現,KDM6B能夠通過NF-κB信號通路促進血管生成和募集巨噬細胞來調節腫瘤微環境,促進腫瘤的進展和轉移。而GUARNERI等[25]在皮膚黑色素瘤的研究中發現,NF-κB發揮腫瘤抑制作用與MMP-9的下調有關。以上研究提示,在腫瘤中EMMPRIN和KDM6B均可以通過NF-κB信號通路發揮作用。結合本研究結果,推測在乳腺癌中EMMPRIN過表達和KDM6B低表達可能會導致NF-κB信號通路被顯著激活,上調MMP的產生,從而促進腫瘤的發生發展。本研究不足之處在于僅從蛋白水平分析了三者的相關性,尚未涉及分子層面的研究,其具體分子作用機制尚待進一步研究。

本研究對乳腺癌中EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白的表達采用了免疫組織化學定量檢測方法[8],能夠比較直觀地反映免疫組織化學指標的表達水平。本研究ROC曲線結果顯示,EMMPRIN蛋白診斷浸潤性乳腺癌的AUC為0.875,最佳界值為10.043,敏感度為 79.0%,特異度為76.8%;MMP-9蛋白診斷浸潤性乳腺癌的AUC為0.863,最佳界值為10.070,敏感度為 74.2%,特異度為76.8%;KDM6B蛋白診斷浸潤性乳腺癌的AUC為0.267,最佳界值為11.003,敏感度為 71.0%,特異度為98.6%。EMMPRIN、MMP-9蛋白表達水平越高、KDM6B蛋白表達水平越低,病理組織學診斷浸潤性乳腺癌的可能性越大。由于腫瘤病因的多樣性和復雜性,任何檢測方法或技術都不可能完全實現對腫瘤的診斷,因此,EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白在診斷乳腺癌時應結合其形態學和其他免疫組織化學標志物綜合判斷。

4 結論

EMMPRIN、MMP-9蛋白在浸潤性乳腺癌癌旁組織、低級別導管內癌、高級別導管內癌和浸潤性癌組織中的表達依次升高,KDM6B蛋白的表達則依次降低。EMMPRIN、MMP-9蛋白表達量高提示浸潤性乳腺癌WHO分級高、淋巴結容易轉移、TNM 分期高;KDM6B蛋白表達量高提示浸潤性乳腺癌WHO分級低、淋巴結不易轉移、TNM分期低;MMP-9蛋白表達量越高還提示腫瘤直徑越大。浸潤性乳腺癌組織中EMMPRIN與MMP-9蛋白呈正相關,EMMPRIN與KDM6B蛋白呈負相關,MMP-9與KDM6B蛋白呈負相關。EMMPRIN、MMP-9蛋白表達水平越高、KDM6B蛋白表達水平越低,病理組織學診斷浸潤性乳腺癌的可能性越大。EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白與浸潤性乳腺癌發生發展有關,檢測EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白的表達有助于浸潤性乳腺癌的病理診斷及臨床判斷浸潤轉移。EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白三者之間相關性的研究為浸潤性乳腺癌相關信號通路機制的研究提供了一定的參考依據,其具體分子作用機制有待后續研究。