姜黃素對TNBS 誘導的大鼠結腸炎IL-36α和IL-36γ表達的影響

梁昌顯,呂曉丹,范俊華,李世權,詹靈凌,呂小平

炎性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)主要包括潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)和克羅恩病(Crohn's disease,CD)[1]。IBD發生發展與促炎及抑炎因子相互作用失衡有關。有研究發現白介素36(interleukin 36,IL-36)通過IL-36R和IL-1受體輔助蛋白(IL-1 receptor accessory protein, IL-1RAcP)介導細胞內信號轉導,誘發促炎細胞因子分泌[2]。研究表明,在炎性腸病中IL-36α和IL-36γ表達升高,與炎性腸病的炎性反應發生發展密切相關[3]。小鼠腸道炎性反應模型中IL-36α和IL-36γ表達上調,活動期IBD患者結腸黏膜IL-36α和IL-36γ蛋白水平升高,IL-36在慢性炎性腸病中起著促進腸壁纖維化作用[4]。目前,批準上市治療IBD的藥物包括氨基水楊酸、甾體類激素、免疫抑制劑等,但這些藥物治療IBD過程中均存在不同的局限性和不良反應。姜黃素是從姜共根莖中提取的黃色天然活性結晶粉末,其可通過對多種信號分子進行調節,從而起到抗炎、抗腫瘤、抗纖維化等生物學作用[5]。本研究采用姜黃素對實驗性大鼠結腸炎模型進行干預,現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:選擇40只健康成年SPF級雄性SD大鼠,體質量(220±12)g,購自北京維通利華實驗動物中心,質量合格證編號:SCXK(粵)2022-0063,生產許可證號:SCXK(京)2021-0006。在24 ℃、60%相對濕度的環境下適應性喂養,自由進食、飲水1周后造模。研究設計和實施過程符合動物福利和倫理原則(202205004)。

1.1.2 主要儀器:電子分析天平(型號 PE504,瑞士梅特勒托利多有限公司);高速冷凍多用途離心機(型號180R,德國Eppendorf公司);全自動酶標儀(型號iMark型,美國Bio-Rad公司);電泳儀(型號DYCZ-20G DNA,北京六一儀器廠);紫外分光光度計(型號nodrop2000,美國Thermo公司);凝膠成像分析系統(型號Gel doc2000,美國Bio-Rad公司);雙色紅外激光成像系統(型號Odyssey,美國LI-COR公司);病理顯微鏡(型號J150, CX33,日本Olympus公司)。

1.1.3 藥物及試劑:三硝基苯磺酸(TNBS,Sigma-Aldrich公司,5%水溶液,批號S220507013);姜黃素(北京索萊寶生物科技有限公司,純度95.0%,批號SL220513007);柳氮磺砒啶(北京索萊寶生物科技有限公司,純度≥98%,批號SL220519036);異氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司,批號W220501039);大鼠IL-36α及IL-36γ ELISA試劑盒(上海將來實業股份有限公司,批號分別為:JL22050002、JL22040001);IL-36α抗體(United Kingdom,批號ab269274)和IL-36γ抗體(武漢云克隆科技股份有限公司,批號A20220531053);牛血清白蛋白BSA(武漢賽維爾生物科技有限公司,批號GM1106);HRP 標記山羊抗大鼠IgG二抗(武漢賽維爾生物科技有限公司,批號GM1108 )。

1.2 實驗方法 實驗于2022年5月在廣西醫科大學醫學實驗動物中心進行。

1.2.1 模型構建:將成年SPF級雄性SD 大鼠40只適應性飼養1周后,按照隨機方法分為正常對照組、模型組、柳氮磺砒啶治療組、姜黃素治療組,每組10只,分籠飼養(5只/籠),并用耳標作好標記。造模前禁食12 h。模型組、姜黃素組、柳氮磺砒啶組大鼠分別以TNBS 乙醇溶液灌腸制備大鼠結腸炎模型[6]。大鼠異氟烷麻醉成功后,一次性結腸灌注TNBS乙醇溶液0.65 ml(5%TNBS 0.4 ml+50%乙醇0.25 ml);正常對照組予等體積的生理鹽水灌腸。提起大鼠尾部倒立3 min后,放回籠內常規飼養。

1.2.2 給藥方法:當大鼠出現活動及攝食減少、毛發晦暗粗糙易脫落、體質量進行性下降,并伴腹瀉、肉眼血便等,表明成功誘導出大鼠結腸炎模型。自造模第2天起,姜黃素組每日予姜黃素溶液100 mg/kg灌胃;柳氮磺砒啶組大鼠每日予柳氮磺砒啶(SASP)溶液100 mg/kg灌胃;正常對照組、模型組每日予等體積的生理鹽水灌胃,4組均連續給藥7 d。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 疾病活動指數(DAI)評分評估:建模期間,每天在固定時間段內(09:00—10:00)稱量大鼠體質量,觀察大鼠糞便性狀,取新鮮糞便進行糞便隱血實驗(干化學法),評估TNBS對大鼠疾病活動指數(disease activity index,DAI)評分的影響,參照參考文獻[7]標準,DAI評分=(體質量改變評分+糞便隱血試驗評分+大便性狀評分)/3 。

1.3.2 結腸組織大體形態損傷(colonmacroscopic damage index,CMDI)評分:建模成功7 d后處死大鼠,剪取肛門至盲腸的腸段,縱向剖開,PBS沖洗腸內糞便,參照參考文獻[8]標準進行CMDI 評估,CMDI 評分標準:0分(結腸組織正常大體形態),1分(結腸組織充血,無潰瘍),2分(結腸黏膜潰瘍、充血,腸黏膜粗糙),3分(結腸黏膜潰瘍面積直徑1 cm左右),4分(結腸黏膜潰瘍面積直徑2 cm左右,腸壁增厚,與周圍組織輕度粘連),5分(結腸黏膜潰瘍面積直徑2 cm左右,腸壁增厚,與周圍組織重度粘連)。

1.3.3 ELISA法檢測血清IL-36α和IL-36γ水平:建模成功7 d后,大鼠異氟烷麻醉,采血3 ml靜置2 h, 離心取血清,采用ELISA法檢測血清IL-36α和IL-36γ。所有操作均嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行。

1.3.4 大鼠結腸組織病理HE染色觀察:建模成功7 d后處死大鼠,縱向剖開結腸,取炎性反應明顯處結腸組織0.5 cm,10%多聚甲醛固定24 h,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,常規石蠟包埋,4 μm厚連續切片。切片經二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化,蘇木素染色、鹽酸乙醇分化、氨水反藍、伊紅染色,然后梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固。將已染色烘干的切片在光學顯微鏡下拍照觀察。

1.3.5 免疫組化法檢測結腸組織IL-36α、IL-36γ蛋白表達:取石蠟包埋的結腸組織,連續切片厚4 μm,置于60 ℃烤箱烘烤1 h,然后經環保型脫蠟液脫蠟、梯度乙醇脫水,在EDTA抗原修復液(pH 9.0)微波以合適溫度修復抗原,自然冷卻至室溫,滴加3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶活性。3%BSA封閉后,滴加PBS按一定比例配好的IL-36α/γ,4 ℃孵育過夜。次日,滴加HRP 標記山羊抗大鼠IgG二抗。DAB顯色、蘇木素復染、鹽酸酒精進行分化,梯度乙醇脫水、二甲苯透明,中性樹膠封固,白光顯微鏡下拍照觀察。每張切片隨機選取5個不重疊的高倍鏡視野(400×),采用Image-Pro Plus 6.0軟件對陽性染色進行半定量分析,計算平均光密度(average optical density,AOD)。AOD=積分光密度/陽性面積。以AOD值代表蛋白陽性表達量。

2 結 果

2.1 各組大鼠DAI評分、CMDI評分比較 與正常對照組比較,模型組DAI、CMDI評分均升高,差異有統計學意義(P均<0.01);與模型組比較,姜黃素組和柳氮磺砒啶組DAI、CMDI評分降低 ,且姜黃素組低于柳氮磺砒啶組,差異有統計學意義(P均<0.01),見表1。

表1 各組大鼠DAI 、CMDI評分和血清IL-36α、IL-36γ水平比較Tab.1 Comparison of DAI, CMDI scores, and serum IL-36α, IL-36 γ in each group of rats

2.2 各組大鼠血清IL-36α、IL-36γ水平比較 與正常對照組比較, 模型組血清IL-36α、IL-36γ水平升高,差異有統計學意義(P均<0.01);與模型組比較,姜黃素組、柳氮磺砒啶組血清IL-36α、IL-36γ水平降低,且姜黃素組低于柳氮磺砒啶組,差異有統計學意義(P均<0.01),見表1。

2.3 各組大鼠結腸組織病理學觀察 正常對照組大鼠結腸鏡下顯示各層結構無異常,其黏膜上皮層上整齊分布著單層柱狀上皮細胞,具有完整細胞以及清晰的腸腺結構,腺體上分布著正常完整的杯狀細胞(GC)和吸收細胞,肌層薄厚均勻未見異常變化;模型組大鼠結腸炎性反應主要侵犯黏膜及其下層,多數大鼠結腸損傷范圍至漿膜層,結腸黏膜失去完整性,可見多灶性淺潰瘍,嚴重時見環壁性深潰瘍,潰瘍或炎性反應明顯區域腺體結構異常,有壞死組織聚集形成的白色污穢苔膜樣物質,可見大量淋巴細胞、中性粒細胞等炎性細胞彌漫性浸潤;柳氮磺砒啶組與姜黃素組大鼠結腸鏡下可見結腸各層組織結構大體正常,腺體被破壞程度較輕,黏膜層、黏膜下層等部位中性粒細胞、淋巴細胞等炎性細胞浸潤的數量及深度較模型組減輕, 炎性反應程度較模型組明顯緩解,見圖1。

2.4 各組大鼠結腸組織IL-36α、IL-36γ蛋白表達水平比較 免疫組化檢查結果顯示,IL-36α、IL-36γ蛋白表達陽性染色主要定位于細胞質及細胞外基質,尤以柱狀上皮間及黏膜下層疏松結締組織間明顯,為黃色或者棕黃色顆粒。與正常對照組比較, 模型組IL-36α、IL-36γ蛋白表達水平升高(P<0.05);與模型組比較,姜黃素組、柳氮磺砒啶組IL-36α、IL-36γ蛋白表達水平均降低,且姜黃素組低于柳氮磺砒啶組(P<0.05),見表2、圖2。

表2 各組大鼠的結腸組織IL-36α、IL-36γ蛋白表達水平比較Tab.2 Comparison of IL-36α, IL-36 γ protein expression levels in colon tissues of rats in each group

注:A.正常對照組,細胞間及間質未見明顯的陽性染色;B.模型組,黏膜下層疏松結締組織IL-36α、IL-36γ陽性表達明顯;C、D.模型組及柳氮磺吡啶組:黏膜下層疏松結締組織IL-36α、IL-36γ陽性表達減少。圖2 各組大鼠結腸組織IL-36α、IL-36γ表達變化(免疫組化染色,×400)Fig.2 IL-36α, IL-36 γ expression changes in colon tissue of rats in each group(immunohistochemical staining, × 400)

3 討 論

IBD是一種慢性非特異性腸道炎性疾病,臨床雖然尚未明確IBD病理機制,但認為可能與腸道屏障、免疫系統失調以及個人體質等因素相互作用有關。

近年來,隨著對IBD 的研究深入,有研究發現IL-36在參與炎性因子的產生、免疫細胞活化、組織愈合和纖維化等過程中發揮著重要作用[9]。IL-36是IL-1大家族的一部分,為炎性疾病的重要介質,發揮了促炎作用。IL-36在人體組織中廣泛表達,尤其主要分布于皮膚、肺臟、關節、腸道、腎臟和大腦等,可由單核/巨噬細胞、角質細胞、結腸成纖維細胞、T淋巴細胞等多種細胞產生,主要參與皮膚、肺、腸等組織的炎性反應。IL-36在不同疾病中發揮著不同的免疫作用。在正常皮膚中,因IL-36激動劑與抑制劑維持著動態平衡,使其呈低水平結構性表達。有研究發現IL-36α和IL-36γ表達升高并促進結腸炎性反應發生發展,許多小鼠腸道炎性反應模型中IL-36α和IL-36γ表達上調[10-11]。另外,有研究還發現銀屑病患者的IL-36α、IL-36γ表達上調,與IL-17、IL-23等細胞因子表達一起維持炎性反應自我放大效應[12-13]。在活動期IBD患者,尤其是UC患者結腸組織中IL-36α和IL-36γ的表達水平升高[14-16]。Kanda等[17]發現培養的人結腸上皮下肌成纖維細胞在IL-36α和IL-36γ的刺激下產生IL-6、CXCL-1、CXCL-2和CXCL-8等,而這些趨化因子導致周邊的細胞反應具有一定的趨化能力,使得炎性細胞逐漸趨向炎性反應部位,維持機體炎性反應。IL-36α和IL-36γ可誘導中性粒細胞向腸道炎性反應部位聚集,導致腸道黏膜炎性反應狀態。Boutet等[18]在葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的結腸炎小鼠結腸中發現,IL-1β、IL-17A、IL-36α及IL-36γ表達均上調,且其表達呈正相關,結腸炎病情程度與IL-36α和IL-36γ的表達水平有關,提示IL-36信號傳導與腸道炎性免疫反應存在一定的關聯。

目前,IBD臨床治療藥物較多,如氨基水楊酸、糖皮質激素等,從臨床實踐來看,治療效果并不理想,而且安全性仍有待進一步觀察。隨著生物制劑的價格逐漸下降和可獲得性增加,其已成為臨床上治療炎性腸病的主要治療藥物[19]。一方面,生物制劑起效迅速、治療效果好,但免疫原性及長時間使用的療效和可靠性仍有待進一步證實[20-22]。姜黃素具有抗炎、免疫抑制、抗腫瘤等生物學作用[23]。姜黃素作用機制主要包括通過抑制TLR-4 受體和 MyD88 對 TNBS 誘導的實驗性結腸炎發揮抑制作用[24-25];通過激活 PPAR-γ抑制 TNBS 誘導的結腸炎[26];抑制NF-κB的活化及細胞質IκB蛋白的降解,抑制結腸黏膜促炎細胞因子的轉錄;降低IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、IL-23等表達,提高IL-4、IL-10 和IL-13抗炎細胞因素,從而降低大鼠結腸炎性反應,抑制組織纖維化[27]。本研究結果顯示,模型組大鼠精神差、毛色粗糙、排血便,體質量明顯下降,至造模結束仍低于造模前水平,結腸IL-36α、IL-36γ表達明顯增高,表明IL-36α、IL-36γ表達升高與大鼠IBD關系密切,與上述報道結論吻合。經治療后,姜黃素組上述指標均明顯改善,且體質量逐漸恢復至造模前的水平,大鼠的DAI評分降低,大體形態和組織學損傷均改善,血清及結腸IL-36α、IL-36γ表達下降,提示姜黃素對實驗性大鼠結腸炎IL-36α、IL-36γ的表達有明顯的抑制作用,分析原因在于姜黃素可能通過對中性粒細胞過度聚集抑制,降低了IL-36α、IL-36γ表達,平衡抑炎和促炎分子,減輕炎性反應損傷程度及免疫異常反應,從而達到治療實驗性結腸炎的目的。但本研究不足之處在于未能明確姜黃素對TNBS誘導的大鼠結腸炎IL-36α、IL-36γ表達抑制的作用機制,而且基因層次研究存在不足,對是否通過其他信號通路發揮其抗炎的作用需進一步研究。

綜上所述,姜黃素對實驗性大鼠結腸炎IL-36α、IL-36γ的表達有明顯的抑制作用,是IBD潛在的治療藥物。

利益沖突:所有作者均聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

梁昌顯:實驗材料準備, 實驗實施,論文撰寫;呂曉丹:實驗實施,數據采集;李世權:實驗實施,數據采集,統計分析;范俊華、詹靈凌:論文審閱及指導;呂小平:確定選題,實驗設計