應用天然水凝膠修復關節軟骨損傷的研究進展*

薛春宇 陳國強 袁俊虎 傅煊健 陳雨航 陳賢藝 關宏業 陳揚

對臨床醫師來講，軟骨缺損的再生是一項巨大的挑戰。據報道，在膝關節鏡檢查中，有60%的關節炎患者患有軟骨損傷，其中15%的60 歲以上的患者患有嚴重的軟骨損傷[1]。與其他大多數組織不同，軟骨基本上是沒有血管的，且細胞含量少，這會極大地限制受損軟骨自愈的能力[2]。當前軟骨組織修復策略在臨床上已有應用，如微骨折術、自體軟骨細胞植入、自體骨軟骨移植和同種異體骨軟骨移植等，但這些仍然存在明顯的局限和不足，包括煩瑣的離體細胞操作，潛在罹患腫瘤的可能，治療風險和監管問題。因此，找尋一種有望解決上述問題的修復軟骨的方法具有重要的臨床意義。

如今，由支架、細胞和生長因子組成的組織工程材料已經發展成為軟骨組織修復最有前景的治療策略。為了較好地修復軟骨損傷，必須制備具有生物降解能力的支架，能模擬特定組織的特征，并能提供細胞或生長因子，為新形成的組織提供支撐。在理想情況下，軟骨修復材料應具有無毒無害、多孔性、生物相容性和生物降解能力，且有細胞分化和組織生成能力，從而使得材料具有良好性能，如降解的速度能與新組織形成的速度相匹配，能輸送營養物質和代謝物，可與周圍天然組織緊密融合粘連和填充受損部位等[3]。

水凝膠是由天然或合成的親水性聚合物相互交聯組成的具有獨特的3D交聯聚合物網絡，該網絡可包含諸多化學組分，其物理性質通過材料整體表現出來。構成水凝膠的聚合物鏈的親水性能使其吸收一定量的水，可用于生物材料中，以實現藥物輸送和組織再生?；诮宦摲绞?，水凝膠分為化學和物理網絡凝膠?；瘜W交聯的水凝膠通常通過合成聚合物的分子鍵結合在一起，并具有穩定、組成相同和結構可控的特點。雖然物理交聯的水凝膠通常通過諸如分子纏繞、氫鍵、離子鍵或疏水相互作用等次級相互作用聚集，其所形成的結構可逆，具有自我修復的特性，與化學交聯水凝膠相比具有多種優勢，如易于制造、毒性較小、可重塑和更易生物降解等[4]。

1 天然水凝膠在軟骨損傷中的應用

天然水凝膠由于具有生物相容性、可降解性和與細胞外基質（extracellular matrix, ECM）的相似性，在組織再生中具有明確的應用，可令細胞具有生物活性，能提供良好的黏附表面。用于水凝膠制備的天然聚合物，包括蛋白質基材料（如明膠、膠原蛋白、纖維蛋白和絲蛋白）和多糖基材料（如透明質酸、硫酸軟骨素、藻酸鹽和殼聚糖等）。天然水凝膠無毒、不能引起免疫反應，并且其降解產物也是無毒和無免疫原性的，最終代謝產物會安全地排泄到體外。但是，天然水凝膠的穩定性差，降解快及機械強度相對較低，極大地限制了其應用[5]。

1.1 海藻酸鹽水凝膠

海藻酸鹽（alginate, ALG）是從褐藻中提取的天然多糖，β-D-甘露糖醛酸（β-D-mannuronic, M）和α-L-古洛糖醛酸（α-L-guluronic, G）按（1→4）鍵連接而成，由于其良好的生物相容性、高水化粘彈性、交聯能力和物理特性，已被廣泛用于封裝細胞[6-7]。與其他天然聚合物相比，海藻酸鹽有利于細胞行使功能和細胞錨定，形成3D多孔水凝膠支架[8]。海藻酸鹽水凝膠可以支持軟骨細胞的生長和增殖，并維持其形態。Kosik-kozio? 等[9]發現體外培養后14 d，約80%的人軟骨細胞保留在水凝膠支架中，且軟骨細胞在整個培養過程中保持圓形。另外，海藻酸鹽水凝膠還能轉移間充質干細胞進行軟骨再生。通過海藻酸鹽水凝膠和燒結的聚乳酸－乙醇酸微球支架復合，在這種條件下，這些軟骨細胞可以從軟骨層向軟骨下骨層轉移，實現界面的整合，該材料在兔膝關節缺陷模型中表現出優異的組織修復效果[10]。

然而，海藻酸鹽水凝膠的應用仍然存在一些限制。首先，海藻酸鹽水凝膠的穩定性較差，即使在生理環境下也會在短時間內逐漸喪失機械強度，這則需要設計交聯過程來增強機械性能[11]。其次，由于海藻酸鹽在哺乳動物中的細胞黏附力和與細胞相互作用的能力都較低，所以需引入細胞黏附物質，以更好地支持細胞功能。在精氨酸/甘氨酸/天冬氨酸功能化海藻酸鹽水凝膠中嵌入骨髓來源的間充質干細胞可以增強骨軟骨再生并提高修復后組織的機械性能[12]。然而，海藻酸鹽水凝膠的機械性能較差，限制了其在醫學中的應用潛力。有研究將細菌纖維素引入雙網絡水凝膠系統中來制備高性能的生物水凝膠。該水凝膠壓縮模量與天然關節軟骨相匹配，但其溶脹度明顯下降，在兔的骨軟骨缺損模型的結果證明了該雙層結構支架良好的骨軟骨修復效果[13]。另外，以海藻酸鹽－聚甲基丙烯酸酯雜化水凝膠為骨架，在靜電和共價相互作用的基礎上，通過交聯形成單一的多孔結構來制備支架材料克服了單純海藻酸鹽材料的機械性能限制。海藻酸鹽提供了模擬細胞外基質的合適微環境，而甲基丙烯酸酯部分也可以改善所得混合水凝膠的機械性能[14]。

1.2 殼聚糖水凝膠

殼聚糖來源于幾丁質，是一種源自甲殼動物殼的陽離子聚合物，具有良好的親水性、生物相容性和生物降解性，是結締組織的重要組成部分，具有絡合、抑菌、吸附和抗氧化的作用[15-17]。殼聚糖可以在酸性pH或非溶劑條件下凝膠，可進一步制備基于殼聚糖的水凝膠支架。殼聚糖具有良好的生物相容性和可降解性。因而，它是一種具有廣泛應用前景的組織工程材料，可以認為是醫學領域軟骨修復的潛在材料。盡管殼聚糖與其他天然聚合物的混合物可以通過靜電相互作用生成一系列功能性水凝膠，但其物理交聯的網絡極易溶解，力學性能較弱，極大地限制了其應用[18]。同時為了克服其不溶于水的缺陷，有研究制備了具有良好溶解性的N-琥珀酰殼聚糖-二醛淀粉混合物水凝膠，以修復軟骨缺損[19]。殼聚糖的致敏性和作用機理也可能需要在其臨床應用中加以改進。與單純殼聚糖水凝膠相比，引入聚己內酯支架后，復合支架的壓縮模量顯著增加，該復合支架有益于細胞存活。因此，復合水凝膠支架往往具有令人滿意的機械強度和仿生微環境。

1.3 明膠水凝膠

明膠是一種水溶性蛋白，是膠原蛋白部分水解而來的產物，由一系列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列組成，具有良好的生物相容性、降解性和溫敏性，其最高臨界溶解溫度在25 ～ 35℃，可改善細胞黏附和基質金屬蛋白酶的能力?；诿髂z的復合物已被用作生物材料領域中用于組織工程和分子載體的合適支架。然而，單純明膠水凝膠存在熱穩定性差與力學穩定性差等問題。因此，有必要對明膠結構進行一定程度上的化學改性，以提高明膠水凝膠的理化性能，使其更適合在軟骨修復應用。通過甲基丙烯酸酐修飾明膠來獲得甲基丙烯酰胺化明膠（gelatin methacryloyl,GelMA）是一種常見且有效的明膠改性方式[20]。研究發現，紫外光照交聯時間1 min 時GelMA 水凝膠的吸水速率和平衡溶脹比最佳，降解速度快，拉伸性能與天然軟骨結構類似，具有良好的生物相容性，與骨修復材料力學匹配[21]。將明膠進行化學修飾以制備生物支架，為骨關節炎軟骨損傷的治療提供了新思路。

1.4 膠原水凝膠

膠原蛋白是細胞外基質的重要成分，是一種天然的生物材料，主要為Ⅰ型與Ⅱ型膠原蛋白，為三螺旋結構，廣泛存在于皮膚、骨骼、軟骨、血管、牙齒和肌腱中，已廣泛應用于生物和醫學領域。膠原蛋白水凝膠可通過紫外光照聚合，脫氫熱處理或與其他基團發生交聯反應制備。Calabrese等[22]評估了一種新型支架，該支架由Ⅰ型膠原蛋白和人脂肪來源的間充質干細胞組成，具有良好的成軟骨潛能，無論是否存在軟骨誘導因子，該支架都具有較高的軟骨再生能力。體內和體外實驗表明，含有軟骨細胞的Ⅱ型膠原水凝膠支持間充質干細胞的增殖和軟骨生成[23]。并且，由Ⅰ型和Ⅱ型膠原蛋白制備的復合水凝膠可通過調節兩種類型膠原蛋白的含量來調節復合水凝膠的性能。通常將膠原蛋白與其他天然生物大分子結合，或通過化學修飾來制備水凝膠。Ⅱ型膠原蛋白和透明質酸（hyaluronic acid, HA）制備的可注射水凝膠，加入軟骨細胞后，軟骨細胞在培養過程中保持活性，并可維持軟骨細胞的表型[24]。與明膠相似，膠原蛋白的機械性能較差，會快速降解，這些對軟骨修復是不利的，其改進思路也與明膠相似。

常見的天然水凝膠的類型如表1 所示。另外，應用透明質酸、絲素蛋白、硫酸軟骨素同樣可以構建水凝膠支架。有研究開發了一種原位光交聯的透明質酸作為關節軟骨修復的支架材料，將軟骨細胞在該水凝膠中體外培養，細胞保持圓形并產生大量的軟骨基質。將水凝膠填入軟骨缺損處，發現2 周后缺損處積累大量軟骨基質[25]。通過化學改性制備的水凝膠具有更好的生物降解性、機械性能及光學交聯能力。

表1 常見天然水凝膠的類型

2 水凝膠的評價

水凝膠性質的定量和定性表征是其在軟骨修復中應用的關鍵步驟，這使得水凝膠可根據特定的需求進行設計。在水凝膠的研究中，通常使用不同的方法來表征水凝膠材料。

水凝膠網絡中聚合物分子之間的網眼大小可以從10 ～ 500 μm的大孔到5 ～ 100 nm的孔不等，這些孔旨在誘導組織再生[26]。掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope, SEM）和透射電子顯微鏡（transmission electron microscope, TEM）通常用于觀察水凝膠和其他生物材料的表面形態和內部多孔結構。兩種設備之間的明顯區別是空間分辨率的不同。例如，將水凝膠通過SEM 和TEM 進行觀測，SEM 顯示水凝膠是具有多孔微結構和孔壁是光滑的，水凝膠的內部結構則可以通過TEM觀察，其分辨率可以達到0.2 nm[27]。

水凝膠的物理性質被認為是控制骨骼再生的最重要因素之一。物理性質通常還包括保水能力、溶脹性和水凝膠的包埋率。包封效率可以根據所包埋藥物的不同性質，通過分光光度計或高效液相色譜法等進行測定，這也是水凝膠的重要物理性質。毋庸置疑，在軟骨修復中測定不同材料和制備方法制成的水凝膠的機械性能非常重要，需測量不同的數據，如壓縮模量、拉伸強度及流變性質來評估水凝膠的機械性質。

由于不同官能團和化學鍵的存在對水凝膠的性能具有顯著影響，因此有必要分析制備的水凝膠中存在的不同官能團和化學鍵。通常使用X射線衍射、傅立葉變換紅外光譜、核磁共振和熱重分析來分析水凝膠的結構。

在體外進行水凝膠的降解測試時，可將水凝膠材料放入磷酸鹽緩沖鹽水中，并在37℃下孵育觀察一定時間。因為水凝膠材料用作細胞的支架，測試其嵌入細胞和植入部位對材料的安全性是必要的。體外生物相容性測試一般通過細胞實驗進行，通過一系列指標觀察水凝膠材料中細胞的存活情況。水凝膠支架中細胞的形態可以通過倒置顯微鏡觀察。細胞生長和增殖可以通過MTT 法來測定，AO/PI染色、DAPI染色和刃天青檢測也是可行的方法。細胞生長還可以通過分析ECM的合成來評估，可用甲苯胺藍染料染色并在倒置顯微鏡下觀察[28]。此外，堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）是成骨細胞分化的明顯特征，也是其分化最常見的指標之一。

3 軟骨缺損動物模型

水凝膠的開發主要用于治療軟骨缺損，因此，在應用之前，水凝膠材料與活生物組織之間的相互作用非常重要，盡管通過細胞實驗分析了該材料的生物相容性，但證明該材料在體內對細胞無毒是必要的。通過建立動物測試模型，常用的如大鼠、小鼠、兔子等對材料進行測試，以模擬人體的環境和身體狀況。

因為要進行標準化評估，所以確定關節軟骨缺損的幾何形狀很重要。動物模型中的關節軟骨缺損通常是圓形或矩形的。圓形缺陷可以使用商業或定制的打孔器來創建，如皮膚活檢穿孔器。同樣，應使用定制打孔器（而不是手術刀片）制造出矩形缺陷來將缺損標準化，之后使用刮匙或勺子仔細清除這些缺損處的關節軟骨。創建軟骨缺損模型時，必須特別注意進行精細的手術操作。部分研究者認為，缺損一定不能延伸到軟骨下骨中[29]，因為這將導致大量骨髓成分的涌入，從而可能干擾單純軟骨的修復方式。然而，筆者認為創建軟骨下骨缺損的動物模型是必要的，雖然這增加了修復難度，但也更貼近于實際。

小鼠適合用作驗證模型，可以有很多動物樣本數目，并且使用來自相同品系的小鼠具有均一性。此外，對于特定的研究，可以使用無胸腺、轉基因或基因敲除，以及免疫系統受損的小鼠，這些小鼠會較早出現骨關節炎。例如，Matsuoka等[30]敘述了一種軟骨修復小鼠模型，其應用C57Bl/6 小鼠模型對基因操控及深入了解關節表面愈合過程的機制有一定意義。像其他嚙齒動物一樣，小鼠的飼養和繁殖通常價格不高，而特定基因敲除小鼠的研發和繁育則會更具挑戰性，也更加昂貴。

小鼠關節小，關節軟骨薄，僅由幾個細胞層組成。這使得研究支架對部分或全層軟骨缺損的關節軟骨修復較難進行。與人類不同，其生長板未閉合，這增加了軟骨修復的內在治愈潛力。除了大體、組織學和生化評估外，也可以使用MRI或micro CT進行檢查，并且可以進行生物力學測試。

與小鼠相比，大鼠的關節要大得多，但軟骨層仍然很薄。在大鼠膝關節中，可在股骨髁或滑車中造出直徑最大為3 mm 的軟骨甚至骨軟骨缺損，該處缺損的臨界大小未知。Choi等[31]應用大鼠模型描述了模塊化殼聚糖水凝膠在關節內的應用，用以治療關節軟骨缺損。與小鼠類似，大鼠的飼養比較經濟，但面臨類似的問題，如生長板不閉合會改善體內修復效果。對于結果評估的方法可與小鼠相同。

兔子模型介于小動物模型與大動物模型之間，需要相對簡單的飼養。兔子的股骨髁和滑車足夠大，可形成最大3 ～ 4 mm的骨缺損或軟骨缺損。股骨遠端生長板在6 ～ 8個月時閉合[32]。兔子的膝蓋彎曲度比人大得多，導致滑車承受力要比人大。兔子的內源性愈合潛力相對較高，其軟骨有可能再生。但是，在成年兔子中直徑為2 mm 的骨軟骨缺損只能修復，不能再生。與大鼠一樣，兔子髕骨的軟骨部分位于硬骨部分的近端。

4 總結與展望

本文講述了近年來水凝膠在軟骨修復中的設計和應用的研究進展。水凝膠具有很好的生物相容性和生物降解性，有利于細胞存活。軟骨組織再生的關鍵之一是促進軟骨整合及軟骨下骨再生，因為這兩種組織具有不同的結構和性能，因此需要水凝膠支架同時模擬兩種組織的性能。另外，軟骨修復作用與軟骨細胞外基質的沉積和重塑有關，如果材料的降解速率與這不完全匹配，則ECM無法沉積在損害軟骨再生的缺損區域。水凝膠具有可控的降解速率、良好的生物相容性和機械性能，是理想的軟骨組織工程材料。

毫無疑問，要使軟骨完全恢復其本來狀態，對結構、力學和生物功能的復原是一項重大挑戰，如何實現軟骨和軟骨下骨再生的整合一直是組織工程學中的關鍵問題，因為水凝膠支架需要模擬兩種不同類型的組織結構和性質。在這種情況下，軟骨修復的部分應具有出高彈性模量，以承受壓力和摩擦，能增強軟骨細胞成軟骨的表達，并有助于軟骨細胞礦化。另外，軟骨下骨修復應能促進水凝膠內血管網絡的形成，從而促進營養物質的運輸，刺激成骨細胞的增殖，并為軟骨再生提供強有力的支持。更重要的是，缺損處周圍的軟骨與植入物的界面應具有牢固的附著力。盡管水凝膠性能經過不斷優化，能夠基本滿足軟骨層的修復需求，然而要開發兼具超高力學強度、高孔隙率和物理結構穩定的天然水凝膠以滿足軟骨下骨的修復需求還是比較困難。

目前用于關節軟骨修復的天然可降解水凝膠的力學強度、彈性模量和韌性還達不到軟骨修復要求，如何提高水凝膠的力學性能是目前研究的重點。大量研究通過在高分子水凝膠中引入雙網絡結構、離子螯合鍵、氫鍵、共價鍵、納米交聯位點、動態的共價鍵-非共價鍵及多種交聯結構，以獲得高強復合水凝膠[33]。受中國濃湯熬制方法啟發，Wang等[34]用高溫蒸餾濃縮方法提高了天然海藻酸鈉、卡拉膠多糖在水中的溶解度，制備出高濃度的多糖水凝膠預聚液。隨后，在該混合溶液中加入鈣離子和熱響應的瓊脂糖，最終合成高韌性的天然可降解水凝膠。因水凝膠含有高密度氫鍵、離子鍵，使得其拉伸強度、彈性模量和斷裂韌性分別高達2 MPa、2 MPa 和1 200 Jm-2。因此，在高濃度天然水凝膠預聚液中引入多種類型的交聯結構，通過調控其內部的交聯密度和化學組分，有望獲得高強度、高韌性、可生物降解的滿足關節軟骨修復需求的仿生植入材料。

近年來，受關節軟骨/軟骨下骨組織多級微納結構的啟發，開發納米梯度復合支架促進關節軟骨修復是目前的趨勢。有研究采用原位成型方法在海藻酸鈉和聚乙烯醇水凝膠的下層和上層分別復合不同濃度的HA和硫酸軟骨素/玉米蛋白納米顆粒制備出納米梯度復合水凝膠支架[35]。兔子體內膝關節缺損修復結果表明該納米梯度復合水凝膠能夠促進透明軟骨和軟骨下骨的再生，生物力學結果表明實驗組的新生軟骨/骨組織與宿主組織界面結合力遠遠高于空白對照組。此外，軟骨/軟骨下骨的重建和再生是多種活性生物分子共同參與調控的結果，因此，納米復合水凝膠結合生長因子的固載為軟骨/軟骨下骨的修復提供了新思路。

目前，用于臨床試驗的組織工程產品數量有限，在促進微細加工技術和開發細胞支架方面，朝著更先進和針對性療法的快速進展仍然值得注意，理想水凝膠應同時具有以下特征：①生物活性和仿生功能；②承受機械應力；③與骨和軟骨組織相結合；④運輸藥物和生長因子。因而，結構復雜的復合水凝膠支架是必須的，以實現良好的臨床治療效果，并應對水凝膠支架的力學和生物學行為進行相應的研究，以確保材料與周圍組織有強的相互作用。有了這種理解，未來應該仔細思考設計水凝膠的二級、三級的高級結構，量化其組成、形態、結構和功能，表征它們的結合方式及與細胞表面受體的相互作用，最后將其轉變為臨床可用的生物材料。筆者堅信，借助水凝膠的不斷發展及理化和機械性能的精確調控，會涌現先進的用于臨床的生物材料。