雷公藤甲素通過調控NLRP3通路抑制LPS誘導的BV2小膠質細胞炎性反應

穆秉桃，李玉璐，劉淇源，孫肖樂，胡芬琦，曹佳蕾，楊鳳君，李佩佩，畢宇錦，王澤濤，張慧宇

（1.山西大同大學腦科學研究所/分子細胞免疫學大同市重點實驗室，山西大同 037009；2.山西大同大學醫學院，山西大同 037009；3.山西大同大學中醫藥健康服務學院，山西大同 037009）

諸多證據表明，神經炎癥在神經退行性疾病的病理生理學機制中占據了中心地位。在神經退行性疾病腦組織中有許多炎癥標記物，比如炎性細胞因子的增加，受損區域小膠質細胞激活等。其中研究小膠質細胞介導的炎癥反應機制一直是焦點[1-2]。近年來研究發現，炎癥小體活化在神經退行性疾病炎癥反應中發揮關鍵作用。2019 年《Nature》上的新成果揭示：在阿爾茨海默病中，Aβ 沉積會激活NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3）炎性小體[3]；NLRP3 炎性小體可以驅動帕金森病的神經變性等[4]。提示抑制NLRP3 炎癥小體活化可能成為治療神經退行性疾病的有效靶點。

由于NLRP3炎癥小體的激活主要存在于小膠質細胞，因此NLRP3 炎癥小體就成為小膠質細胞介導的炎癥反應的主要響應者。抑制其激活可能成為神經退行性疾病的一種有希望的治療干預方法。

雷公藤甲素（Triptolide,TP）是二萜類化合物的一種，從雷公藤根部提取分離獲得，以顯著的抗炎、抗氧化和免疫抑制作用被廣泛應用[5]。研究顯示，TP對小膠質細胞炎癥反應有顯著的抑制作用[6]，但是其機制尚不清楚。也有研究表明TP 可以抑制NLRP3 的活化[7]，我們推測TP 抑制BV2 小膠質細胞炎性反應機制之一可能是通過調控NLRP3 通路。在本研究中，我們主要觀察TP 對脂多糖（Lipopolysaccharide LPS）誘導BV2 細胞的影響，包括其激活狀態、活性、炎性損傷和NLRP3 炎癥小體表達，探究其對神經炎癥的抑制機制。

1 材料和方法

1.1 材料

鼠源性BV2 小膠質細胞株，由軍事醫學研究院軍事認知與腦科學研究所提供。TP（純度≥98%）購自成都樂美天醫藥科技有限公司（貨號：DL0034）；山羊抗兔（ab150077）熒光二抗為美國Abcam 公司產品；谷氨酰胺、高糖DMEM 為美國Gibco 公司產品；兔抗NLRP3 抗體（批號af2155）、兔抗ASC 抗體（af6234）、兔抗caspase1（af1681）、一氧化氮檢測試劑盒、RIPA 裂解液（P0013B）、LPS、牛血清蛋白及PMSF 均為上海碧云天公司產品；兔 抗IL-18 抗 體（57058S）、兔 抗GAPDH（5174S）、化學發光底物試劑（WBKLS0500）購自美國Milllipore 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及實驗處理

10 mL 培養平皿中加入5～6 mL 含有100 mL/L胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的高糖培養基，把BV2細胞懸液滴2～3滴到平皿中混勻。在5%CO2、37 ℃培養箱中進行常規培養，間隔1 d 換培養液，待細胞達80%豐度后用0.25 %的胰酶進行消化傳代接種培養。達對數生長期細胞分成對照組、LPS模型組、LPS+TP 藥物處理組三組。LPS模型組細胞采用1 mg/L LPS 作用24 h，LPS+TP 組細胞同時加入1 nmol/L TP[8]和1 mg/L LPS 作用24 h。鏡下觀察藥物組細胞發生的形態變化并和對照組比較，拍照記錄。

1.2.2 Griess 法測定上清液中的NO水平

在96 孔板中接種BV2 細胞，接種濃度50 個/μL，每孔100 μL 共設置5 個復孔，按照細胞分組藥物對應處理24 h，吸取細胞上清液加入新的96 孔板中，每孔各50 μL 上清液和標準品，再各加50 μL 的Griess Reagent I和Ⅱ溶液，立即混勻后用酶標儀測定540 nm處吸光值，同時制作并繪制NaNO2標準曲線，用標準曲線公式計算NO 含量。

1.2.3 Western blot法檢測

在6孔板中接種BV2細胞，接種濃度1 000個/μL，每孔2 000 μL，每組設置2 個復孔，依據細胞分組加入藥物處理24 h，棄上清液留下貼壁細胞，PBS 輕柔清洗，加RIPA 裂解液冰上裂解細胞30 min，收集液體，行超微量分光光度計定量蛋白，并將各組蛋白含量調成一致。后續用10%SDS-PAGE 進行電泳分離蛋白，將蛋白轉膜到PVDF膜，轉膜條件為200 mA進行2 h，之后5%的脫脂牛奶封閉，4 ℃冰箱一抗[NLRP3、ASC、caspase1、IL-18 和GAPDH（1∶1000）]孵育過夜，次日室溫下二抗[辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（1∶3000）]孵育2 h，然后Bio-Rad 凝膠成像儀蛋白顯影、觀察并定量分析條帶。

1.2.4 免疫熒光染色法

在24 孔板的底部放入滅菌玻璃小圓片，滴入100 μL 濃度為200 個/μL BV2 細胞液，30 min 后加入900 μL 細胞培養液，待細胞貼壁后依據分組加入藥物作用24 h，棄上清后用4 %多聚甲醛固定細胞30 min，固定前后用PBS 輕柔清洗細胞。接著加入封閉液封閉細胞1 h（含1%的BSA 和0.3%的Triton X-100 的PBS 液），4 ℃冰箱一抗[NLRP3、ASC、caspase1、IL-18（1∶1000）]孵育過夜：，次日室溫下避光二抗[Alex Fluor 594（紅色）和488（綠色）標記的山羊抗兔IgG]孵育2 h，PBS 洗3 次，用DAPI 封固液封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.5 統計學方法

采用GraphPad Prism 5.0 軟件對數據進行分析處理，實驗重復三次，數據取平均值，計量資料用±s表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TP對LPS 誘導BV2 細胞NO 釋放量的影響

對NO 釋放量的檢測反映LPS 致炎作用，Griess法結果表明，對比對照組，模型組經LPS 作用后細胞釋放出多量NO（P＜0.01），LPS致炎明顯；對比模型組，TP 組NO 的釋放量明顯較低（P＜0.05），抗炎效果明顯。

圖1 TP對LPS致炎BV2 細胞NO 釋放量的影響

2.2 TP對LPS誘導的BV2細胞形態的影響

圖2結果顯示，非激活狀態的BV2小膠質細胞胞體較小而圓潤、胞質清亮，細胞突起邊緣清晰。LPS致炎性激活狀態下的BV2 小膠質細胞胞體變大、觸角延伸變粗變長，突起末端分支變多,呈現阿米巴樣。TP 組細胞形態發生了逆轉，阿米巴樣小膠質細胞數量明顯減少,細胞形態接近對照組。

圖2 TP作用LPS 誘導的BV2 細胞形態變化

2.3 TP對LPS 誘導的BV2 細胞炎性小體表達的影響

圖3～8顯示了TP對LPS誘導的BV2細胞炎性小體表達的影響。與對照組比較，模型組LPS致小膠細胞炎癥后，炎性小體成分NLRP3、ASC、caspase1表達增高，激活的炎性因子IL-18表達增高。與模型組比較，TP處理組NLRP3、ASC、caspase1和IL-18表達均降低，差異有統計學意義。

圖3 NLRP3的免疫熒光染色檢測及比較

圖4 ASC的免疫熒光染色檢測及比較

圖5 caspase1的免疫熒光染色檢測

圖6 IL-18的免疫熒光染色檢測及比較

圖7 NLRP3、ASC、caspase1和IL-18 蛋白免疫印跡條帶圖

圖8 NLRP3、ASC、caspase1和IL-18 蛋白表達水平比較

3 討論

在近年的研究中，慢性炎癥已成為神經退行性疾病的核心標志。而神經炎癥主要是由常駐小膠質細胞群體驅動的[9]。由NLRP3、凋亡相關點狀蛋白（Apoptosis-associated speck-like protein contain a CARD ASC）和半胱天冬酶-1 前體（pro-cysteinyl aspartate specific proteinase-1 Pro-caspase-1）組成的NLRP3炎性小體，促進前體Procaspase-1成熟為活性caspase-1，參與關鍵調節介質Gasdermin D（GSDMD）的切割，存在GSDMD 氨基末端的結構域又可以激活NLRP3 炎癥小體引起系列炎癥級聯反應[10]?；钚詂aspase-1還將白細胞介素（Interleukin-1β，IL-1β）和IL-18的前體裂解為活性物質，促進IL-18成熟并介導神經組織損傷的炎癥反應。更多的研究已經明確了NLRP3炎癥小體在神經退行性疾病中異?；罨?，NLRP3、caspase1上調,IL-18的表達增強。IL-18通過多種機制誘導神經細胞損傷，包括誘導NO產生，激活壞死和凋亡通路、調節突觸可塑性和絲裂原激活蛋白激酶（mitogen activatedprotein kinase，MAPK）通路的影響元件，破壞細胞外基質和血腦屏障，加劇腦細胞水腫，最終導致細胞壞死[11]。本實驗LPS誘導刺激BV2小膠質細胞炎癥損傷，通過免疫熒光和wester blot法觀察到，LPS使BV2細胞NLRP3炎癥小體激活，NLRP3、ASC、caspase1表達增加（P＜0.5）,促IL-18炎癥因子的成熟并誘導其大量表達（P＜0.5），引發炎癥級聯反應。

最新報道顯示,TP可以通過Nrf/HO-1通路抑制NLRP3炎癥小體的免疫活化,預防細胞損傷[12]。本實驗利用具有抗炎作用的TP作用于LPS誘導的炎性BV2細胞24 h后，免疫熒光和westerblot 顯示炎性小體成分NLRP3、ASC、caspase1表達受到抑制，并且炎癥因子IL-18的表達降低，和LPS組比較差異有統計學意義（P＜0.5），說明中藥雷公藤甲素的抗炎效果良好，對小膠質細胞炎性反應有抑制作用。

由上所知，LPS 誘導小膠質細胞激活，NLRP3炎性小體及致炎因子表達增高，致炎作用明顯，TP干預后抑制了NLRP3 通路激活，有抑炎并保護神經細胞作用。靶向不同位點抑制小膠質細胞NLRP3炎癥小體的激活可能成為干預神經退行性疾病的一種有希望的治療策略。TP治療有可能成為神經退行性疾病中抑制炎癥反應的新思路。下一步實驗中，我們將建立不同的細胞及動物模型進一步明確TP的神經保護作用及其它機制，為深入探討神經退行性疾病的致病機制、尋找新靶點和篩選新的有效藥物提供理論和實驗依據。