酒精性肝病中的鐵死亡機制研究進展

李雪梅，康 萌，萬靜之，李澳忠，劉啟玲，，秦緒軍

(1.陜西中醫藥大學公共衛生學院，陜西 咸陽 712046；2. 西北工業大學生命學院，陜西 西安 710072)

全世界約20億人飲酒，導致每年有超330萬例死亡病例(約占總死亡人數的5.9%)[1]。據不完全統計，中國每年因飲酒死亡人數高達70萬，飲酒所致死亡人數占全球之首[2]。飲酒已經成為嚴重的公共衛生事件。酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是由長期大量飲酒或短期酗酒而引起的復雜的肝臟代謝性疾病，具有較高的發病率和死亡率。臨床上可將其分為酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化4個階段[3]。目前已報道的ALD 發病機制主要涉及肝脂肪變性、氧化應激、乙醛毒性和炎癥反應等多種機制。但ALD的具體分子機制仍不清楚，且尚無明確有效的治療藥物[4]。因此，探討新的分子機制對于尋找預防和治療ALD 有效藥物和策略具有重要意義。

鐵死亡(ferroptosis)是由哥倫比亞大學Dr.Stockwell于2012年提出的一種新型程序性細胞死亡，在腫瘤、神經疾病、急性肝腎損傷、缺血再灌注等多種疾病中發揮著重要作用[5]。鐵死亡是細胞內大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)在鐵離子(Fe2+/Fe3+)存在的情況下，脂膜上多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)發生氧化產生大量的脂質過氧化物(lipid peroxide，LPO)，如丙二醛(malonaldehyde，MDA)和4-羥基壬烯酸等，引起生物膜損傷，最終導致細胞死亡[6]。與其他細胞死亡形式相比，鐵死亡具有獨有的特征：①細胞形態方面，如細胞膜破裂、線粒體皺縮破裂、膜密度增高和嵴減少；②細胞分子方面，如胱氨酸/谷氨酸逆轉運受體(system XC-)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPx4)水平抑制，以及Fe2+/Fe3+、ROS、PUFA、多不飽和脂肪酸-磷脂(PUFA-PLs)和LPO 等的過度積累[7-8]。

1 ALD中的鐵死亡

研究表明，ALD伴隨著鐵死亡的發生，酒精能夠通過多種機制引起鐵死亡[9]。肝臟是人體重要的代謝器官，也是酒精代謝的主要場所。酒精可引起肝臟氧化應激，而氧化應激是觸發鐵死亡的必要條件之一。Liu等[10]通過酒精灌胃小鼠，發現酒精暴露后體內可產生過量ROS，引發氧化應激，誘導鐵死亡發生。除氧化應激外，鐵離子積累也是誘導鐵死亡的主要原因之一。有研究發現有超過一半的ALD患者肝臟內會出現鐵離子的沉積[11]。Luo 等[12]研究發現，酒精可誘導肝臟內鐵離子濃度升高，導致鐵死亡的發生。此外，脂質代謝紊亂所導致的LPO積累也能影響鐵死亡。Liu等[13]通過酒精灌胃小鼠，發現酒精引起體內的LPO 積累可誘導鐵死亡。Choi 等[14]發現，酒精會增加體內脂肪的合成，促進體內脂質過氧化進程，導致LPO積累，誘導鐵死亡的發生。而抑制鐵死亡能夠改善ALD。He等[15]研究發現，抑制體內氧化應激，平衡鐵代謝和脂質代謝等，會有效抑制鐵死亡，保護肝臟。由此說明，鐵死亡可能在ALD發生和發展中起著重要作用，是防治ALD的潛在靶點。因此，有必要對鐵死亡進行深入研究，揭示鐵死亡在ALD 中發揮的具體作用，為防治ALD提供新的策略和干預靶點。

2 酒精調控鐵死亡的機制

2.1 酒精通過ROS調控線粒體及脂質過氧化誘導鐵死亡

ROS是由氧分子不完全還原所產生的一類分子，具有分子量小、壽命短和高反應活性等特點。常見的ROS主要包括：超氧陰離子(·-O2)、羥自由基(·OH)、單線態氧(1O2)、過氧化氫(H2O2)以及各種過氧化物等[16]。這些ROS主要產生于線粒體、過氧化酶體以及內質網等細胞器[17]。當ROS水平過高時，會引發氧化應激，損傷細胞內蛋白質、脂質以及DNA等大分子，干擾正常的細胞信號轉導，影響線粒體膜電位和電子傳遞鏈，導致細胞死亡，如凋亡、自噬以及鐵死亡等[18]。

脂質過氧化是指在ROS存在的情況下，脂質分子受到氧化作用形成過氧化物的過程。其脂質過氧化產物被認為是鐵死亡的標志之一。一些脂質過氧化酶在脂質過氧化過程中發揮著重要作用，包括乙?；o酶A 合成酶長鏈家族成員4(acyl-CoA synthetase long chain family member 4，ACSL4)、脂氧合酶和溶血磷脂酰膽堿?；D移酶3(lysophosphatidyl-choline acyltransferase 3，LPCAT3)等[19]。ACSL 主要在內質網和線粒體外膜表達，其功能是將游離的長鏈脂肪酸和CoA結合形成脂肪?；o酶A。ACSL 共有5 種亞型，但只有ACSL4 與鐵死亡有關，并被認為是鐵死亡的敏感性標志物[20]。Xu 等[21]通過Lieber-DeCarli 液體酒精飼料誘導小鼠建立慢性ALD 模型，發現酒精引起肝臟發生氧化應激引起鐵死亡，具體機制主要是酒精暴露導致體內ACSL4上調，產生過量LPO在體內積累而導致的。脂氧合酶是一類非血紅素含鐵雙加氧酶，花生四烯酸15脂氧合酶(arachidonate-15-lipoxygenase，ALOX15)是人類脂氧合酶家族成員之一。ALOX15 能夠將PUFA 作為底物進行氧化反應，誘導鐵死亡的發生[20]。Zhang等[22]在研究慢性ALD模型中發現，酒精會上調ALOX15 表達，并增加ALOX15 產物的生成，從而誘導鐵死亡的發生。LPCAT3 是一種調節花生四烯酸水平的?；D移酶。當LPCAT3 高表達時，花生四烯酸的水平顯著增加，導致LPO生成增加，破壞細胞膜結構，誘導鐵死亡的發生[19，23]。Lu 等[24]通過對小鼠進行5%液體酒精飼料Lieber-DeCarli 喂養10 d，并在最后一天單次大劑量酒精灌胃(5 g/kg，30%體積比酒精)誘導成慢性加急性酒精性損傷小鼠模型(NIAAA 模型)[25]，發現酒精引起肝臟ROS 產生增加，導致LPCAT3 過度表達，增加了LPO 濃度，誘導鐵死亡的發生。這些研究結果表明，在ALD的發生的過程中，酒精的攝入上調了ACSL4、ALOX15 和LPCAT3 等酶的活性，加快脂質過氧化進程，破壞細胞膜結構，最終誘導鐵死亡，可能促進了ALD的發生發展，因此抑制這些酶的表達或活性，或者增加體內抗氧化活性有助于抑制鐵死亡，保護防治ALD。

線粒體是細胞主要的能量生產和轉化場所。線粒體是雙膜結構的細胞器，由外膜和內膜包裹基質構成。線粒體基質中含有高濃度的三羧酸循環酶混合物以及對ROS高度敏感易受氧化損傷的線粒體DNA。線粒體通過三羧酸循環、氧化磷酸化等過程進行營養代謝產生能量以供機體活動所需[26]。在能量代謝的過程中，電子傳遞鏈復合物I和III的電子泄漏產生，然后通過線粒體超氧化物歧化酶2的作用轉化產生H2O2。生成的H2O2會與Fe2+發生Fenton 反應，產生高活性的·OH。這些ROS 會與PUFA發生反應，形成PUFA自由基，并與氧分子迅速反應生成LPO，導致線粒體氧化損傷[27]。

酒精會對線粒體產生明顯損傷作用。酒精攝入后，部分酒精在肝臟線粒體代謝，產生過量ROS及線粒體氧化應激，導致線粒體形態和功能障礙[28]。酒精的代謝消耗了NAD+，引起NADH/NAD+的比值增加，使體內Fe3+轉化為Fe2+，引發Fenton反應，產生過量的·OH，進一步加劇氧化應激和線粒體損傷[29]。Xue 等[30]在56%體積比酒精以6 mL/kg 灌胃SD 大鼠16周，誘導慢性ALD，結果發現酒精攝入引起肝組織線粒體結構的改變，包括線粒體膜密度的增加，線粒體嵴減少或消失以及外膜破裂等。Samuvel等[31]通過采用單劑量酒精灌胃誘導C57小鼠急性ALD，結果表明酒精暴露會損傷線粒體DNA，阻礙線粒體內脂肪酸β-氧化的正常進行。Ding 等[32]采用5%的液體酒精飼料Lieber-DeCarli 喂養C57 小鼠12 周，誘導慢性ALD，發現酒精攝入可導致線粒體形態和功能障礙，引起LPO 大量積累，誘導鐵死亡的發生。而改善線粒體功能可以減輕酒精引起的鐵死亡。Dong 等[33]通過NIAAA 法誘導C57 小鼠慢性加急性ALD，發現通過藥物馬鞭草干預激活過氧化物酶體增殖激活受體α可改善線粒體結構和功能障礙，能夠抑制鐵死亡，保護酒精引起的肝損傷。Frataxin 是一種位于線粒體基質的與線粒體功能和鐵硫簇生物發生相關的蛋白，對維持線粒體能量代謝具有重要作用[34]。Liu 等[10]發現，酒精能夠抑制Frataxin 的表達，使線粒體形態功能受到損傷，增加ROS 及脂質過氧化，誘導鐵死亡，促進ALD，而過表達Frataxin 能夠降低鐵死亡，減輕酒精引起的肝損傷。綜上，酒精攝入引發線粒體ROS產生，導致氧化應激以及線粒體功能障礙，誘導鐵死亡，促進ALD；而抑制線粒體氧化應激，提高線粒體功能可以減輕鐵死亡改善ALD。

2.2 酒精通過GSH/GPx4調控鐵死亡

GSH/GPx4 系統是體內維持氧化和抗氧化平衡的重要途徑。該系統的上游組件是system XC-，由調節溶質載體家族3成員2(regulatory subunit slute carrier family 3 member 2，SLC3A2)和溶質載體家族7 成員11(catalytic subunit solute carrier family 7 member 11，SLC7A11，也稱xCT)組成[6]。xCT主要負責轉運活性，而SLC3A2 作為伴侶蛋白發揮作用，促進細胞內谷氨酸排出和細胞外半胱氨酸(cysteine，Cys)的攝取。通過system XC-的作用，Cys參與谷氨酸半胱氨酸連接酶和谷胱甘肽合成酶的合成過程，生成GSH。GSH 與GPx4 相互協作，發揮抗氧化作用。GPx4 是GPxs 家族成員之一，能夠清除H2O2，將有毒的過氧化物如LOOH轉化為無毒的脂質醇，從而抑制鐵死亡發生。因此，GPx4 被認為是抑制鐵死亡的重要因素之一[27，35]。不同的內外環境損傷因素可以通過抑制system XC-減少Cys 的攝取，從而導致GSH 的合成減少，抑制GPx4的活性，進而導致LPO積累，促使鐵死亡的發生[36]。

酒精攝入可對GSH/GPx4 系統產生影響。Zhou 等[37]通過NIAAA法誘導C57小鼠慢性加急性ALD，發現小鼠肝臟GSH減少，GPx4 活性降低，抗氧化能力減弱，并伴隨LPO 含量增加，從而導致鐵死亡；但通過特異性敲除腸道SIRT1可以增加肝臟的GSH 和GPx4 含量，提高抗氧化能力，抑制LPO 含量，發揮酒精肝損傷的保護作用。Shah等[38]采用NIAAA 法誘導C57小鼠急性加慢性ALD，發現酒精暴露引起小鼠肝臟ROS產生的同時，system XC-、GSH、GPx4 以及SOD 水平降低，LPO 含量增加，誘導鐵死亡發生。激活GSH/GPx4 系統可以抑制鐵死亡。通過胸腺素β4 干預發現，增加肝臟抗氧化劑xCT、GPx4、GSH和SOD等含量，降低肝臟ROS和LPO的積累，從而抑制氧化應激和鐵死亡，改善酒精誘導肝臟損傷。Xue 等[30]用酒精灌胃SD 大鼠16 周，誘導ALD，發現褐藻多糖可以通過增加system XC-以及GPx4 蛋白的表達等方式，提高肝臟抗氧化能力，抑制鐵死亡，改善ALD。綜上，system XC-和GSH/GPx4系統在調控鐵死亡中發揮重要的作用。酒精攝入可降低system XC-和GSH/GPx4的表達，促進鐵死亡，導致ALD的發生；提高體內system XC-和GSH/GPx4表達水平以提高抗氧化水平可能是防治ALD的一個新途徑。

2.3 酒精通過鐵代謝調控鐵死亡

鐵離子代謝異常也是影響鐵死亡的重要因素。細胞內的鐵代謝相關蛋白在維持鐵代謝平衡中扮演著重要的角色。這些蛋白包括轉鐵蛋白(transferrin，TF)、轉鐵蛋白受體1(transferrin receptor 1，TFR1)、鐵轉運蛋白1(ferroportin 1，FPN1)、二價金屬離子轉運蛋白1、鐵蛋白重鏈1 和鐵蛋白輕鏈等[39]。TFR1是細胞攝取鐵的主要途徑，當鐵離子和TF 結合后，再與細胞表面的TFR1 結合，通過內吞作用將鐵離子攝入細胞。相反，FPN1是唯一能將鐵從細胞內排出到胞外的蛋白。TFR1和FPN1共同調節細胞內外的鐵平衡，前者將鐵輸送到細胞內，后者將鐵輸出到細胞外[39]。當細胞內鐵代謝穩態受損時，導致細胞內鐵離子增多，與H2O2發生Fenton 反應，進而誘導LPO 的積累，驅動鐵死亡[7]。

研究表明，酒精能夠影響細胞鐵離子濃度。Zhao等[40]通過誘導C57小鼠慢性加急性ALD，發現細胞內鐵離子濃度顯著增加，可引發肝臟內脂質積累，進而導致鐵死亡的發生。褪黑素可通過增加FPN和FTH等蛋白的表達，促進細胞內鐵離子向外轉運抑制鐵死亡，保護肝臟免受酒精侵害。Zhou等[41]研究發現脂肪特異性高表達磷脂酸磷酸酶1會增加酒精引起的鐵離子累積和鐵死亡，從而加重ALD。相反，減少鐵離子累積能夠減輕鐵死亡。Gao等[42]發現，缺鐵情況下對小鼠進行3次酒精灌胃誘導急性ALD，發現肝臟損傷明顯減輕，主要是因為鐵離子的減少抑制了鐵死亡的發生，這也從側面表明鐵離子依賴的鐵死亡在ALD中具有重要作用。此外，Song等[43]研究表明，酒精可以激活核受體激活因子4干擾鐵代謝，導致細胞內鐵離子濃度升高，驅動鐵死亡的發生。采用藥物水飛薊素干預可以抑制核受體激活因子4 的表達，進一步抑制細胞內鐵離子濃度的升高，從而發揮肝臟保護作用。綜上，鐵代謝與鐵死亡密切相關，酒精引起的鐵代謝相關蛋白異常，引起鐵離子累積是酒精引起鐵死亡的重要機制之一，調控特定鐵代謝相關蛋白也有望成為調控鐵死亡防治ALD的潛在靶點。因此，本文對酒精調控鐵死亡的機制作了一個示意圖，見圖1。

圖1 酒精調控鐵死亡的機制示意圖

3 小結與展望

隨著人們生活水平提高和飲酒的增加，ALD患病率日益增加，給肝臟甚至機體健康帶來嚴重挑戰，但目前為止臨床尚無有效防治藥物。探索ALD新機制對于尋找開發基于靶點且有效的臨床藥物具有重要意義。鐵死亡是近年來新發現的一種細胞死亡形式，主要以鐵離子依賴的脂質過氧化損傷為主要特點。酒精代謝引起的氧化應激早已被廣泛報道，同時肝臟又是鐵離子儲存的主要器官，提示鐵死亡很可能在ALD中扮演了重要角色。最近多項研究也證實了酒精能引起鐵死亡，抑制鐵死亡可改善ALD。多種干預策略包括提高抗氧化系統(如xCT、GSH和GPx4 等)活力，減少ROS 和LPO 的過度產生和積累，改善線粒體應激和呼吸功能，以及調控鐵代謝蛋白等抑制異常鐵攝取等，從而抑制鐵死亡改善ALD。其中線粒體作為細胞產生ROS的主要位點，既是酒精損傷的靶點，也是激發鐵死亡的起點，同時也是聯系氧化抗氧化的重要樞紐，提示線粒體是未來調控鐵死亡防治ALD的潛在靶點。此外，國內外對鐵死亡的分子機制仍在不斷探索中，許多新的調控鐵死亡機制不斷被發現，這也必將給ALD的鐵死亡機制提供新的研究思路和線索。但目前對ALD不同階段鐵死亡的變化及機制知之尚少，酒精對鐵死亡的具體調控機制研究相對有限，故進一步加強酒精誘導鐵死亡具體機制的探究，尋找通過調控鐵死亡防治ALD的潛在干預靶點，將成為今后ALD發生機制以及探索防治策略和藥物研究的新方向。