基于上轉換納米顆粒的腫瘤光動力治療研究進展

王 芳，孫照剛，褚洪遷，

(1.首都醫科大學附屬北京胸科醫院轉化醫學研究室，北京 101149；2.北京市結核病胸部腫瘤研究所耐藥結核病研究北京市重點實驗室，北京 101149）

目前，癌癥依然是威脅人類健康的重要原因之一[1]。經統計顯示，2020 年全球約有1 930 萬癌癥新發病例和近1 000 萬癌癥死亡病例[2]，因此研究有效的癌癥治療新技術備受關注。傳統的癌癥治療方法主要包括手術、化學療法、放射療法等[3]。但是，傳統療法存在較大的缺陷，如療效差、毒副作用大和免疫耐受等[4]。因此，亟需開發有效的新型癌癥治療方案。光動力療法(photodynamic therapy，PDT)是一種非侵入性的腫瘤治療方法，已被廣泛應用于臨床抗腫瘤治療領域[5]。然而，PDT 的臨床應用還面臨許多挑戰，比如光敏劑(photosensitizer，PS)的激發光多為可見光，其組織穿透能力弱，導致PDT 的治療局限在表層病灶，對深部腫瘤治療效果差[6]，嚴重限制了其實際臨床應用，因此，開發具有高穿透深度的近紅外光激活的光敏劑具有重要的意義。

上轉換納米顆粒(upconversion nanoparticle，UCNPs)是一類摻雜鑭系元素的光學納米晶體，在近紅外光(near infrared，NIR)激發下，可將兩個或多個低能光子轉換為單個高能輸出光子[7]。由于UCNPs 的NIR 激發光具有更深的組織穿透能力，并且其發射的紫外光或者可見光可激活光敏劑，從而產生具有高度反應性的活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)，達到直接殺死腫瘤細胞或者激活免疫系統的目的。因此，具有毒性小、化學穩定性高和光穩定性好等優點的UCNPs在PDT抗腫瘤治療中具有廣泛的應用前景[8]。

1 光動力療法

PDT作為一種新型的微創性抗腫瘤治療手段，逐漸引起研究者的興趣。PDT 主要由3 種元素組成：PS、特定波長的激發光和氧氣(O2)。PDT 根據光物理和光化學可分為Ⅰ型和Ⅱ型兩種類型[9](見圖1)。Ⅰ型PDT 是基于電子轉移的光動力反應，可產生自由基(如、HO·和H2O2)，但不是大多數PDT 的主要機制；Ⅱ型PDT 是三重態光敏劑與三重態分子氧發生相互作用，形成單線態氧(1O2)，進而誘導細胞凋亡殺傷腫瘤細胞，這個過程需要O2的參與[10]。

圖1 光動力療法的機制示意圖[9]

除了光和O2之外，光敏劑(PS)是PDT 的關鍵因素之一。PDT 的優點在于可通過控制光照對腫瘤部位進行針對性的治療，而PS在黑暗環境下不會被激活。在激發光存在的條件下，可以引發PS 發生光化學或光物理反應[11]。但是PS 的組織滲透性差，自聚集使其無法滲透脂質雙層，導致PDT 療效降低[12]。目前，PS 的研究已經發展至第3 代[5]。第1 代PS 是卟啉類，其中血卟啉最早應用于臨床治療[13]，但是存在純度低、穿透能力差及毒性強的缺點；第2代PS是基于第一代發展而來，主要是血卟啉衍生物(hematoporphyrin derivative， Hp D)、 氯6(chlorine6，Ce6)、5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acid，5-ALA)、3,7-雙(二甲氨基)吩噻嗪-5 鎓氯(methyleneblue，MB)等，改善了第一代PS的缺點，但存在水溶性差的特點[13]；第3代PS 是對第二代PS 進行化學修飾、結合靶向分子或者負載在納米顆粒，具有更好的靶向性和生物相容性[14]。

2 上轉換納米材料

UCNPs 主要由敏化劑離子、活化劑離子和基質材料組成。其中，敏化劑鑭系離子(如Yb3+)可以吸收近紅外光，并將兩個或多個光子傳遞給發射鑭系離子(最常見的是Er3+、Ho3+和Tm3+)[15]?；|材料主要提供結晶主晶格結構，用于活化離子并將離子敏化到正確的位置，為其提供適當的光照條件[16]。

上轉換發光(upconversion luminescence，UCL)是指將兩個或多個低能泵光子從近紅外(NIR)光譜區域轉換為波長較短的高能量輸出光子的非線性光學過程[17]。UCNPs 的發光機制主要分為3 個過程：激發態吸收(excited state absorbption，ESA)、能量轉移(energy transfer，ETU)和光子雪崩(photon avalanches，PA)[18]，見圖2。ESA中的激發態吸收過程是基于同一離子通過連續多光子吸收從基態(G)達到更高能激發態能級的原理[19]。由于敏化離子和活化離子的激發態和初始能量狀態之間的能量差是相同的，當它們之間的距離足夠近時，激活離子中的電子跳躍到更高的激發態能級，兩者之間可以發生共振產生能量，從而發生ETU[20]。PA是將ESA和ETU相結合的過程[21]。

圖2 鑭系元素摻雜的UCNP上轉換發光過程[18]

合成UCNPs最常用的方法是熱分解法、微乳液法、相轉移水熱合成法、溶膠-凝膠法等[22]。與傳統發光材料(包括有機染料和量子點)相比，UCNPs 具有化學穩定性高、光學穩定性好、帶隙發射窄等優點[23]。此外，在近紅外光的激發下，具有較強的生物組織穿透力，對生物組織無損傷，信噪比高，在腫瘤治療領域得到了廣泛的應用[24]。

3 UCNPs在光動力治療腫瘤中的應用

UCNPs具有將NIR光轉換為可見光的能力，然后可以通過電子激發能量的轉移激活PS，可改善傳統PDT組織穿透受限的問題[25]。通常，與UCNPs 結合的PS 分為有機分子和無機分子。在大多數有機分子作為PS 的情況下，UCNPs 首先涂有聚合物或二氧化硅殼，實現PS的高有效載荷，保護其免受惡劣環境的降解。有機PS主要是通過物理吸附、靜電吸附、物理包埋法、共價偶聯等方法負載在UCNPs上[26]。對于無機晶體作為PS的情況，它們通常被設計成由UCNPs 為核、PS 為殼的核-殼結構。UCNPs 與PS 的結合不僅可以解決PDT 中PS 的組織滲透能力差的問題，還可以改善PS遞送以及靶向性低等問題，在醫學領域具有很好的應用前景[27]，見表1。

表1 UCNPs的修飾及對應的腫瘤治療改善效果

3.1 UCNPs增加PDT的組織穿透能力

Zhang 等[28]最先報道了PS-UCNPs 用于PDT 治療腫瘤的例子，該體系是由二氧化硅涂層的NaYF4∶Yb3+,Er3+納米顆粒包裹光敏劑M-540組成，可顯著增加PDT的穿透深度，并有效誘導細胞死亡。Wang 等[29]將光敏劑Ce6 加載到基于NaFY4的聚乙二醇(PEG)功能化的UCNPs 上，形成一個超分子復合物UCNPCe6。與依靠可見光激發的傳統PDT相比，使用UCNP-Ce6納米復合物的近紅外光觸發的PDT顯著改善組織穿透深度，可能更適合治療大腫瘤或內部腫瘤。Hou 等[30]介紹了一種基于無機PS二氧化鈦(TiO2)包覆在上轉換納米顆粒(UCNP)核/殼的納米復合材料(UCNPs@TiO2NCs)，其中NaYF4∶Yb3+,Tm3+@NaGdF4∶Yb3+核/殼UCNPs可以有效地將近紅外光轉化為與TiO2殼層吸收匹配的紫外線，見圖3。此外，UCNPs@TiO2NCs 可以通過980 nm 近紅外光的激發有效地產生細胞內ROS，誘導體外癌細胞凋亡。實驗結果顯示對照組和UCNPs@TiO2未照光組有大量的活細胞群，早期和晚期凋亡細胞很少。然而在500 μg/mL劑量下，近紅外或紫外光介導的UCNPs@TiO2組凋亡細胞群顯著增加。

3.2 UCNPs提高PDT的靶向性

UCNPs遞送腫瘤治療藥物的方式包括被動和主動。被動靶向是經高滲透滯留效應(enhanced permeability and retention effect，EPR)實現材料在腫瘤的聚集，但是效率偏低[40]。主動靶向是根據UCNPs材料的可修飾性，利用納米系統表面的特定分子與腫瘤部位的特定分子間、蛋白間(如葉酸受體，適配體等)的主動識別而結合，達到藥物在腫瘤部位特異性聚集的目的[41]。

葉酸(folic acid，FA)受體在多種腫瘤中過表達，而在絕大多數正常組織中基本不表達或低表達[42]，因此可對UCNPs進行葉酸修飾，借助葉酸-葉酸受體的相互作用將藥物主動靶向至腫瘤部位。Zhao等[31]開發了一種基于葉酸-聚乙二醇-聚天冬氨酸-腙-二氫硫辛酸(FA-PEAH)聚合物改性的UCNPs載體，偶聯疏水性PS pheophorbide a(Pha)的新型治療診斷系統(FA-PEAHUCNPs-Pha，見圖4A。與游離Pha 和非FA-配體偶聯的CH3-PEAH-UCNPs-Pha 相 比，FA-PEAH-UCNPs-Pha 對MCF-7 細胞的細胞毒性和細胞攝取均顯著增強，并產生高效率的PDT作用。值得注意的是，FA-PEAH-UCNPs-Pha 組在30 μg/mL 濃度下處理5 min 后，MCF-7 細胞的存活率下降到近25%。Lu等[32]把UCNPs、酞菁鋅(II)和葉酸共價組裝成一種高效的納米顆粒(UCNPs-ZnPc/FA)，可以通過980 nm 的近紅外光照射觸發PDT產生高效的單線態氧，還可以通過腫瘤成像引導PDT抑制腫瘤生長。生理鹽水組、生理鹽水+NIR 組和UCNPs-ZnPc/FA組在皮下注射Hepa1-6 細胞2 周后長成直徑為10～15 mm 的實體瘤，而UCNPs-ZnPc/FA+NIR 組腫瘤細胞的生長受到明顯抑制，相比于對照組腫瘤抑制率約為80.1%。

圖4 利用葉酸修飾UCNPs實現主動靶向的抗腫瘤治療體系[31，33]

與單一PS 相比，將單一光源對UCNPs 的多次發射應用于納米體系，可以明顯提高PDT療效。Yang等[33]首先利用葉酸改性的兩親性聚合物葉酸-聚丙烯酸-辛胺(FA-PAA-octylamine，FP)包覆在疏水性UCNPs 的表面，促進UCNPs 的分散性和腫瘤細胞的靶向性，并充分利用UCNPs 在808 nm 光激發下的多色發射能力，同時激活兩種不同的PS(MC540 和ZnPc)達到增強PDT的功效，見圖4B。暴露在808 nm光下，隨著FPUMZ濃度的增加，與FPUMZ 孵育的HeLa 細胞的活力顯著下降。在808 nm激光照射下，當納米系統與單一光敏劑MC540或ZnPc 結合時，腫瘤明顯縮小。與單一PS 治療相比，激活兩種光敏劑的PDT導致更明顯的腫瘤抑制。體外和體內的治療效果均表明雙PS納米結構為增強PDT治療提供了一種簡單而有效的方法。

3.3 基于UCNPs的光動力聯合其他療法

單一的PDT療法難以完全抑制腫瘤生長和/或消除腫瘤，多平臺的協同療法備受關注。Xu 等[34]設計了同時負載PS Ce6 和Toll 樣受體7 激動劑咪喹莫特(R837)的UCNP-Ce6-R837，通過NIR 激發誘導PDT 并引發抗腫瘤免疫治療。在NIR 的照射下，UCNP-Ce6-R837 不僅增強組織穿透深度，還有效地觸發PDT破壞腫瘤細胞產生腫瘤相關抗原，同時作為佐劑的R837 可誘導產生強烈的抗腫瘤免疫反應。Ding等[35]制備了以介孔二氧化硅為免疫佐劑包裹的上轉換納米粒子(UCMS)，同時負載光敏劑MC540、雞OVA或者腫瘤細胞碎片，用于抗腫瘤治療。在NIR光照射下，UCMSs-MC540-TF激活MC540，誘導PDT產生ROS殺傷腫瘤細胞，從而釋放TAA 刺激DC 細胞，引發一系列免疫反應以增強抗腫瘤作用。目前，已有許多研究表明基于UCNPs的PDT與免疫療法的聯合使用，在增強消除腫瘤效果的同時還具有長期免疫記憶的功能，可預防腫瘤復發。

化療與PDT 的聯合使用也被廣泛應用于抗腫瘤研究[43]。Rafique 等[36]以UCNPs 為核心和mSiO2為殼，并將其與DOX 和Ce6 結合構建了一個新型輸送系統(UCNPs@mSiO2-DOX/Ce6)。該系統可通過吸收近紅外光激活Ce6，誘發PDT 產生ROS，并釋放化療藥物DOX，實現有效的協同治療，增強腫瘤治療效果。當UCNPs@mSiO2-DOX/Ce6濃度為200 μg/mL時，與SCC7細胞系孵育12、24 和48 h 后，細胞存活率分別下降到89%、80%和51%。由于Ce6 分子產生單線態氧并釋放DOX 分子，UCNPs@mSiO2-DOX/Ce6 在NIR 光誘導下的治療效果(即使孵育時間僅為12 h)也明顯高于黑暗環境下的治療效果(存活率：41%)。Lv等[37]基于UCNPs以光敏劑NH2-MIL-53(Fe)為外殼，負載DOX，構建一種多功能納米藥物平臺(UMD)。在NIR 照射下，UCNPs激活NH2-MIL-53(Fe)誘導PDT，并在TME的酸性條件下釋放DOX，協同化療抑制膠質瘤的生長。

腫瘤微環境具有含氧量低的特點，對氧依賴的PDT也是一種重大挑戰[44]。Ji等[38]使用光敏劑PFNS修飾在UCNPs 表面，包被上pH 敏感的Mn-Ca3(PO4)2(MnCaP)層，并將缺氧激活的前藥AQ4N 納入其中，形成73 nm 的納米復合材料(UCNP@PFNS/AQ4N)@MnCaP。該納米顆粒具有顯著增強的滲透性和EPR 效應，并在酸性腫瘤微環境中分解MnCaP層，釋放出UCNP@PFNS和AQ4N，在NIR光照射下產生串聯激活的PDT和化療效果。在pH=7.4、980 nm 激光照射下，HeLa 細胞有很高的細胞存活率；而在pH=6.8、980 nm 激光照射下，UCNP@PFNS@MnCaP 組和UCNP@PFNS/AQ4N)@MnCaP 組的HeLa 細胞表現出明顯的細胞毒性，表明在酸性環境下釋放的MnCaP殼將PDT從關閉狀態轉換到打開狀態。值得注意的是，UCNP@PFNS@MnCaP組的中位致死劑量(LD50)值約是(UCNP@PFNS/AQ4N)@MnCaP 組的100 倍。Shao 等[39]設計了由單個UCNP 為核心和卟啉MOF 為殼組成的核心-殼異質結構(UCS)，將缺氧激活前藥替拉帕胺(TPZ)包封在異質結構MOF殼的納米孔中形成TPZ/UCSs，聯合PDT、缺氧激活的化療和免疫療法達到增強抗腫瘤效果(圖5)。與UCNP-MOF異二聚體(UCDs)相比，UCNP@MOF 核殼納米結構(UCSs)表現出更高的近紅外光激活1O2效率，UCS和NIR輻照處理的細胞誘導的DCF熒光細胞為前者的1.4倍。TPZ受腫瘤微環境缺氧刺激，通過單電子還原反應產生有毒的氧化自由基，對缺氧癌細胞的細胞毒性高于正常細胞。未加載TPZ的UCSs在缺氧條件下無細胞毒性，低氧和常氧條件下TPZ/UCSs 對CT26 細胞的半數抑制濃度(IC50)分別為3.02 和55.04 μg/mL，而TPZ/UCSs 缺氧后經近紅外照射的細胞毒性更強(IC50=0.74 μg/mL)。此外，該納米平臺(TPZ/UCSs)與α-PD-L1 檢查點阻斷療法的組合不僅可以根除原發腫瘤，還可通過全身抗腫瘤免疫抑制未經治療的遠端瘤。

圖5 TPZ/UCSs的結構及其觸發光動力療法聯合缺氧激活化療和免疫治療抗腫瘤的示意圖[39]

4 結語與展望

目前，PDT因其獨特的優點被廣泛應用于臨床研究，但傳統PDT依然存在局限性。隨著納米技術的不斷發展，UCNPs在醫學領域受到越來越多的關注，本文主要概述了基于UCNPs的PDT在抗腫瘤治療中的應用。作為光敏劑載體和光能轉換器的UCNPs可以顯著提高PDT的治療深度，降低光毒性，并且其可以通過表面修飾改變水溶性以提高生物相容性。此外，在藥物遞送和釋放方面，UCNPs 對腫瘤的PDT 療效明顯優于傳統的PDT療法，在臨床治療中具有更大的應用潛力。

但是，在設計UCNPs 負載PS 用于PDT 時，需要認真考慮以下幾個方面：①UCNPs 發出的光與PS 的最大吸收波長之間的光譜是否重疊；②UCNPs 內核與PS 之間的距離(有效能量轉移的關鍵)；③PS 擔載量，PS 過量會對PDT 效果產生相反的影響；④殼的厚度，當選擇核-殼策略時，由于PS藥物與發光核之間的距離影響激活PS 的能量轉移過程，從而影響PDT 效率；⑤納米系統的生物相容性；⑥靶向PDT 策略[15]。除此之外，還需要考慮UCNPs在臨床應用中的最適安全劑量、毒性潛伏期以及在人體中的代謝過程等問題，為UCNPs在醫學領域提供更寬廣的應用前景。