設計改造羧酸還原酶合成醫藥中間體(S)-2-氨基丁醇

張曉輝, 覃宗敏, 李聰聰, 路福平, 曲 戈, 孫周通

(1. 天津科技大學生物工程學院, 天津 300457; 2. 中國科學院天津工業生物技術研究所,天津 300308; 3. 國家合成生物技術創新中心, 天津 300308)

手性胺醇化合物是醫藥合成中的重要中間體[1-5],目前市場上使用的藥物中含有胺醇結構的約占40%[6]。隨著手性藥物在醫藥市場上的需求日趨增加,手性醫藥中間體的綠色生物合成也備受關注。(S)-2-氨基丁醇是一類非常重要的手性砌塊,用于眾多藥物合成中,例如,抗結核桿菌藥物乙胺丁醇(Ethambutol)、治療哮喘的沙美特羅(Salmeterol)[7]、減緩新型冠狀病毒并發癥的美托洛爾MTP(Metoprolol)[8-9]、治療增殖性嬰兒血管瘤的阿替洛爾(Atenolol)[10-11]、治療神經源性逼尿肌過度活動NDO的特效藥米拉貝隆(Mirabegron)[12]、HIV抑制劑埃替拉韋(Elvitegravur)[2]和一種抗腫瘤藥物PDK1抑制劑[13]等。

合成(S)-2-氨基丁醇的化學方法存在一些問題,如需要昂貴的原料和過渡金屬催化劑,步驟復雜,區域和對映體選擇性不足,并且需要高壓設備等。相反,生物催化法因其對環境較為友好、產物的對映選擇性高和參與反應時的條件相對溫和等優勢而備受青睞,是一種很有發展前景的替代性方法。目前生物催化法可利用?；负王０访阜纸馔庀?-氨基丁醇來獲得(S)-2-氨基丁醇[14-15],也可以用轉氨酶[16]或氨基酸脫氫酶[17]從2-酮丁酸底物出發,不對稱合成(S)-2-氨基丁醇,還有通過胺脫氫酶催化1-羥基-2-丁酮直接胺化合成(S)-2-氨基丁醇[18],這些方法存在轉化率低,在合成過程中需要消耗大量氨供體同時產生副產物,底物昂貴等問題。有研究報道,在酵母細胞中構建了一條從蘇氨酸出發,通過4步反應合成(S)-2-氨基丁醇的新途徑,首次實現(S)-2-氨基丁醇的體內合成。其中,關鍵一步是利用羧酸還原酶(Carboxylic acid reductase, CAR)催化還原(S)-2-氨基丁酸生成(S)-2-氨基丁醛,但野生型CAR對(S)-2-氨基丁酸的底物特異性較差且催化效率低[19]。

雖然CAR在工業生產醛和各種羧酸的還原衍生物方面具有巨大潛力,受到極大關注,但是該類酶對極性較強的氨基酸類底物活性較差[20]。近年來亦有針對CAR的酶工程研究,但大多聚焦于有機酸類底物[21-22]或者開發基于此類酶的新反應設計[23-24],尚未有針對提升α-氨基酸類底物催化活性的相關文獻報道。

研究以Segniliparusrugosus來源的野生型羧酸還原酶SrCAR為研究對象,以N-Boc-(S)-2-氨基丁酸(N-Boc-1a)為模式底物,通過設計提升SrCAR催化效率并級聯醇脫氫酶,還原N-Boc-1a為N-Boc-(S)-2-氨基丁醇(N-Boc-1c),最終通過脫Boc保護合成目標產物(S)-2-氨基丁醇(1c),見圖1。

圖1 全細胞催化合成 (S)-2-氨基丁醇(1c)Figure 1 Whole-cell synthesis of (S)-2-aminobutanol(1c)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與引物來源

宿主為E.coliBAP1[25];以Segniliparusrugosus來源的羧酸還原酶SrCAR(GenBank:WP_007468889)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)來源的醇脫氫酶PfADH(GenBank:AF090329.2)和大腸桿菌(Escherichiacoli)來源的醛還原酶Ahr(GenBank:WP_001309160.1)均由武漢金開瑞生物工程公司合成;引物合成均來自安升達(北京)。

1.1.2 試劑與儀器

島津高效液相色譜儀LC-2030C、島津高效氣相色譜儀LC-2030(日本SHIMADZM公司),其他詳見文獻[26],N-Boc-(S)-2-氨基丁酸及其他試劑均由喀斯瑪平臺的生化公司購置。

1.1.3 培養基和培養條件

LB培養基:10 g胰蛋白胨,5 g酵母提取物,10 g氯化鈉,1 000 mL純水;TB培養基:24 g胰蛋白胨,12 g酵母提取物,4 mL甘油,900 mL純水,100 mL TB緩沖液(2.31 g磷酸二氫鉀、16.43 g磷酸氫二鉀,100 mL純水)。將TB培養基與TB緩沖液單獨分裝滅菌(121 ℃滅菌20 min)備用,使用前將TB液體培養基與TB緩沖液以9∶1的比例混合。

1.2 方法

1.2.1 突變體庫的構建

相關突變體及突變體文庫均以MegaPCR方法[27]構建,共兩輪PCR,以第一輪得到的產物作為第二輪的大引物。PCR擴增體系(50 μL):無菌水(32 μL),10×PCR KOD-Plus-Neo緩沖液(5 μL),模板DNA(1 μL,5 ng),上游引物(1.5 μL,0.3 μmol/L)和下游引物(1.5 μL,0.3 μmol/L),KOD-Plus-Neo DNA聚合酶(1 μL),2 mmol/L dNTPs(5 μL,0.2 mmol/L),25 mmol/L MgSO4(3 μL,1.5 mmol/L)。PCR程序:94 ℃預變性2 min;98 ℃變性15 s,55 ℃退火30 s,68 ℃延伸7 min,以2 kb/min的速率延伸,循環數為30次。PCR產物用限制性內切酶DpnI處理3 h,然后電轉到大腸桿菌感受態細胞E.coliBAP1中。如表1所示,根據G430與K524位點組合和K524與A627組合以NNK(反向為MNN)為構建單元設計引物,根據表3陽性位點的氨基酸突變殘基,設計G430/K524/E533/A627簡并密碼子庫的引物。

表1 組合突變體文庫引物列表Table 1 The primers used in the combinatorial mutant libraries

1.2.2 突變體文庫篩選

96深孔培養板中加入300 μL含有卡納霉素(Kan)(50 μg/mL)的LB培養基。用滅菌后的牙簽挑取SrCAR突變體文庫的單克隆轉移到96深孔培養板中,于37 ℃、800 r/min恒溫振蕩培養過夜。取120 μL菌液加入到含有60 μL (60%,體積分數)甘油的保菌板中保菌,保菌板用無菌封口膜封上后放置-80 ℃保存。將含有異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(0.2 mmol/L)和Kan(50 μg/mL)的700 μL TB補加到96深孔培養板中的剩余菌液中,在30 ℃搖床中誘導培養12 h。收集細胞沉淀并用0.5 mL磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L,pH 7.4)洗滌菌體兩遍,離心后棄上清液。將細胞沉淀在0.5 mL的含有終濃度為5 mmol/LN-Boc-1a、100 mmol/L葡萄糖、2 mg/mL NADPH依賴性葡萄糖脫氫酶(GDH)的粗酶粉、10 mmol/L ATP、10 mmol/L氯化鎂(MgCl2)和2 mmol/L NADP+的磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L,pH 7.4)中重懸菌體,并于30 ℃、800 r/min的條件下反應5 h[28]。設置E.coliBAP1/pET24a為陰性對照,同時設置無菌對照,其他流程均相同。待反應結束后,通過離心收集上清液。取100 μL上清液轉移到96孔酶標板(Costar 3603)中,同時加入20 μL溴百里酚藍[29]。將該96孔酶標板在室溫下混勻后,用酶標儀Neo2在615 nm處檢測吸光度值,選取吸光度值小于野生型的突變體用于復篩。

以野生型SrCAR為模板,和另外42條已報道的CAR序列[30]進行多序列比對,導出FASTA格式的結果文件,提交到Comulator網站(https://comulator.bio-prodict.com)[31],對G430、E533和K524等3個陽性位點進行共進化分析。

1.2.3 酶活性分析

為進一步篩選出優勢突變體,將經過96孔板初篩得到的突變體在250 mL廣口錐型搖瓶中擴大培養,進行全細胞生物轉化反應的轉化率驗證。將所得突變體接種至含有Kan(50 μg/mL)的5 mL LB試管中,220 r/min、37 ℃恒溫振蕩培養10 h。然后,將1 mL菌液轉接入含Kan(50 μg/mL)的50 mL TB培養基中,繼續培養至菌體OD600值達到0.8左右。隨后,以終濃度0.1 mmol/L IPTG以過表達羧酸還原酶,在20 ℃恒溫振蕩繼續誘導培養約15 h。離心后用磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L,pH 7.4)洗滌菌體兩遍,棄上清液,稱取濕菌體重量,置于-80 ℃冰箱冷凍保存備用。SrCAR及其突變體生物轉化反應的0.5 mL反應體系如下:羧酸還原酶全細胞0.1 g/mL,葡萄糖脫氫酶GDH粗酶粉2 mg/mL,5 mmol/LN-Boc-1a,2 mmol/L NADP+,100 mmol/L葡萄糖,磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L,pH 7.4),于2 mL EP管中反應,在恒溫金屬浴中30 ℃,1 000 r/min反應1 h,0.5 h時調節pH 7.4,以12 000 r/min的轉速離心3 min收集反應液。取200 μL的上清液于新的2 mL EP管中,加入飽和的NaCl,再加入二倍體積乙酸乙酯400 μL使蛋白質充分變性,并將產物萃取出來,在室溫下用恒溫振蕩混勻儀振蕩5 min后,于12 000 r/min、3 min的條件下離心收集上清液。取200 μL上清液過0.22 μm有機膜后進行氣相色譜檢測[32]。檢測條件如表2。

表2 氣相色譜檢測條件Table 2 Detection conditions of gas chromatography

全細胞催化(S)-2-氨基丁酸的檢測:12 000 r/min室溫離心5 min收集反應液。取150 μL的上清液于新的2 mL EP管中,加入500 μL乙腈以使其中的蛋白質充分變性,充分振蕩后,12 000 r/min離心3 min收集上層反應液。用Marfey’s試劑(14 mmol/L,溶于乙腈,避光備用)衍生[33]:取100 μL乙腈+40 μL碳酸氫鈉(1 mol/L)+30 μL衍生劑+50 μL上述上層反應液,在恒溫金屬浴中于80 ℃、1 000 r/min的條件下衍生10 min。衍生結束后,用10 μL濃鹽酸(4 mol/L)淬滅反應。取200 μL反應液用0.22 μm有機膜過濾后進行液相檢測。檢測條件:液相色譜柱Zorbax SB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm),340 nm處,室溫下流速為1 mL/min。進樣體積為10 μL,A泵為純水[含0.1%(體積分數)三氟乙酸],B泵為甲醇[含0.1%(體積分數)三氟乙酸],前3 min以40%的甲醇[含0.1%(體積分數)三氟乙酸]洗脫,4～13 min以60%的甲醇(體積分數0.1%三氟乙酸)洗脫,14～20 min以60%的甲醇(體積分數0.1%三氟乙酸)洗脫。(S)-2-氨基丁酸保留時間為14.3 min,(S)-2-氨基丁醇保留時間為12.5 min。

1.2.4 優勢突變體酶學性能表征

在1.2.3節所述0.5 mL反應體系中,30 ℃,1 000 r/min反應,測定在底物濃度0.2～40 mmol/L范圍內反應的初速度。經計算得到反應速率和底物濃度,利用GraphPad Prism 9軟件進行米氏方程的非線性擬合,得到Km和Vmax,最后計算得kcat[34]。

羧酸還原酶的熱穩定性測試:以蛋白質構象受溫度影響變性一半時的熔解溫度Tm為指標,利用圓二色光譜(Circular dichroism,CD)分析酶蛋白樣品的熱穩定性[26]。對目的蛋白進行鎳柱親和層析,經脫鹽后,用脫鹽液將純酶液稀釋到0.2 mg/mL左右,經過高速低溫離心的純酶液上樣檢測。根據CD儀器記錄曲線經擬合后得到Tm。

1.2.5 分子對接與分子動力學模擬

以SrCAR(PDB編號5MSW)[35]為模板,通過在線SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)同源建模得到XH7的模型。使用Autodock 4.2[36]的拉馬克遺傳算法(LGA)將底物N-Boc-1a對接到SrCAR與XH7的活性口袋中,將獲得的能量最低的復合物結構作為分子動力學模擬的初始結構。研究中模擬了2個體系,分別為野生型SrCAR+N-Boc-1a,突變體SrCAR(XH7)+N-Boc-1a兩個復合物結構。所有的分子動力學模擬均使用AMBER 20軟件包[37]運行。蛋白質由amber ff14SB力場描述[38],并使用GAFF[39]生成小分子的力場參數。將TIP3P[40]水分子添加到八面體的周期性盒子中進行模擬,距離溶質的距離為1.2 nm,以避免邊緣效應的影響。通過加入適當數量的中和離子,使整個系統成為電中性的。用SHAKE算法[41]約束所有涉及氫原子的鍵,長程靜電相互作用采用PME算法[42]來處理,截斷半徑為1 nm。對2個系統通過最陡下降算法和共軛梯度算法模擬各5 000步,使系統能量最小化。之后,在NVT系綜下逐漸加熱到298 K,最終,在NPT系綜下對每個系統進行了50 ns的模擬,并平行重復3次,所有模擬的時間步長均為2 fs。

1.2.6 產物脫Boc與分離純化

反應結束后將反應液以4 000 r/min離心30 min,收集上清液,并用磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L, pH 7.4)洗滌菌體3次,隨后在收集到的反應液中加入飽和氯化鈉和乙酸乙酯進行萃取,取上層萃取液進行旋轉蒸發,再加入二氯甲烷溶解,加入濃HCl(12 mol/L)至pH 2進行脫Boc保護[43],室溫反應5 h。反應結束后加入飽和碳酸氫鈉淬滅反應,通過分液漏斗分離下層有機溶液,并用無水硫酸鈉進行干燥,最后通過旋轉蒸發獲得(S)-2-氨基丁醇粗提物。用純水溶解上述固體后,再通過離子交換樹脂Doex 50WX8-100對產物進一步提純[18],獲得(S)-2-氨基丁醇純品。具體操作如下:首先將離子交換柱和產物粗提物分別用5%(體積分數)的硫酸酸化,再用超純水洗滌柱子,接著以低流速緩慢加入酸化好的樣品,用超純水洗滌至pH 7.0左右,再用100 mL 9%(體積分數)的氨水將樣品洗脫,得到的洗脫液經旋轉蒸發后得到(S)-2-氨基丁醇。

2 結果與分析

2.1 底物(S)-2-氨基丁酸的N-Boc保護

構建大腸桿菌全細胞催化底物(S)-2-氨基丁酸(1a)反應體系,發現在空載體對照及含有SrCAR重組菌均有87%的底物消耗,且未檢測到產物1c[圖2(a)]。此外,利用純酶反應驗證,如圖2(b)所示,在不含酶的陰性對照反應體系中存在60%的底物消耗,但無產物生成;在含有SrCAR與醛還原酶Ahr純酶的反應體系中,檢測到80%的底物消耗,且有20%的產物(S)-2-氨基丁醇生成。在全細胞催化體系中存在底物1a的背景消耗問題,可能被大腸桿菌內源酶代謝消耗。上述結果表明,SrCAR純酶能夠與大腸桿菌來源的醛還原酶Ahr級聯,催化1a生成1c,但是存在明顯的底物背景消耗問題,說明1a并非理想底物。

(a)全細胞反應催化底物1a[(S)-2-氨基丁酸],全細胞反應體系為0.1 g/mL的全細胞、NADP+(2 mmol/L)、1a(5 mmol/L)、ATP(10 mmol/L)、Mg2+(10 mmol/L)、GDH(2 mg/mL)和葡萄糖(100 mmol/L),反應條件為1 000 r/min,24 h;(b)純酶反應催化底物1a[(S)-2-氨基丁酸],純酶反應體系為SrCAR純酶(75 μmol/L)、Ahr純酶(150 μmol/L)、NADPH(10 mmol/L)、1a(5 mmol/L)、ATP(10 mmol/L)和Mg2+(10 mmol/L),反應條件為800 r/min,24 h,Control為不含純酶但與實驗組一致;(c)1a[(S)-2-氨基丁酸]、N-Fmoc-1a和N-Boc-1a在空載全細胞反應體系中的消耗情況;(d)SrCAR對底物N-Boc-1a的底物消耗與產物生成情況;(c)和(d)為全細胞反應底物不同,其他成分同(a),反應時間為1 h。圖2 全細胞與純酶催化還原(S)-2-氨基丁酸反應Figure 2 Reduction of (S)-2-aminobutyric acid by whole cells and purified enzymes

為解決上述背景消耗問題,采用Boc及Fmoc氨基保護1a,即N-Boc-1a和N-Fmoc-1a作為底物,通過全細胞催化體系考察這兩種底物的消耗情況。結果如圖2(c)所示,在空載(pET24a)體系中,1a的消耗為94%,N-Fmoc-1a的消耗為91%,而N-Boc-1a的消耗僅為18%。說明大腸桿菌內源基因可代謝消耗底物1a及Fmoc保護的底物,但對Boc保護的底物識別能力較差,因此后續研究選擇N-Boc-1a作為模式底物。此外,在SrCAR催化體系中,產物生成和底物消耗均為80%[圖2(d)],推測在含有SrCAR及其突變體過表達的全細胞反應體系中,可競爭性催化還原模式底物,從而一定程度上避免了內源性的背景消耗。說明對底物1a的-NH2進行Boc保護,能夠有效降低背景消耗,并且促進產物生成,因此,后續實驗以N-Boc-1a為模式底物開展。

2.2 羧酸還原酶的理性設計

2.2.1 單位點突變體的篩選

以N-Boc-1a為模式底物,基于實驗室前期開展的催化機制解析及酶-底物相互作用分析等工作[21,34],對已構建的12個單點飽和突變體文庫(T265、S266、G267、H315、S408、G430、T505、D507、Y519、R522、K524、E533)進行全細胞生物轉化篩選測試。其中,G430、K524和E533位點上的突變體活性提高幅度最大,突變體G430V、G430K、G430V、K524A、K524Q、E533F等對N-Boc-1a的轉化率可達99%(5 mmol/L)。因為這3個位點陽性突變較多且突變體轉化率能達到99%,所以理性選取G430、K524和E533為陽性位點。

2.2.2 陽性位點共進化分析

為探索陽性位點G430、E533和K524是否與酶蛋白其他位點存在共同進化關系,對上述3個位點采用在線工具Comulator進行共進化分析。結果表明,只有K524位點存在共進化關聯位點A627。因此,對A627位點開展單點飽和突變測試。其中,A627V、A627N和A627L對5 mmol/L底物的轉化率可達99%。

2.2.3 組合飽和突變

為進一步提高SrCAR突變體活性,以轉化率大于90%為標準,選取G430、K524、E533和A627單點飽和突變體文庫中的優勢突變殘基作為構建單元:G430位點選取的是賴氨酸(K)、色氨酸(W)、異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)、谷氨酸(E)以及野生型甘氨酸(G);據此G430位點設計的簡并密碼子為RWA和KGG。K524位點選擇的是丙氨酸(A)、谷氨酰胺(Q)以及野生型賴氨酸(K);對該位點設計的簡并密碼子為MAA和GCG。E533位點選取的是苯丙氨酸(F)和野生型谷氨酸(E);因沒有同時滿足需求的簡并密碼子,所以對該位點設計的密碼子為GAA和TTT。A627位點選擇的氨基酸為纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、天冬酰胺(N)以及野生型丙氨酸(A);設計的簡并密碼子為KTA、ATT和GCG。以上述簡并密碼子設計引物構建G430/K524/E533/A627“小而精”的突變體文庫(表3),最終從432個轉化子中篩選獲得優勢突變體XH7(G430V/E533F/A627N),轉化率達到99%。

表3 陽性位點突變體分析Table 3 Analysis of positive site mutants

為進一步檢驗獲得的系列優勢突變體,提升底物N-Boc-1a濃度至20 mmol/L并進行3 h的催化反應。結果如圖3所示,突變體A627N、K524F/A627V、G430V/E533F/A627N的生成N-Boc-1c的轉化率分別為49%、48%和78%。突變體XH7(G430V/E533F/A627N)的轉化率最高,因此后續開展對XH7的動力學參數測定與放大反應分析。

圖3 全細胞反應催化還原底物N-Boc-1aFigure 3 Reduction of N-Boc-1a by whole cells

2.3 優勢突變體酶學性能表征

為評估SrCAR及其獲得的優勢突變體XH7的催化效率,對工程化羧酸還原酶的Km、kcat、kcat/Km及比酶活4個參數進行動力學表征。其中,優勢突變體XH7的Km值為0.45 mmol/L,與野生型(0.92 mmol/L)相比降低了2倍多,而kcat值與野生型接近,分別為4.41 s-1和4.46 s-1。XH7的催化效率動力學參數kcat/Km為10.21 s-1mmol/L-1,是模板SrCAR(4.78 s-1mmol/L-1)的2.1倍,但比酶活與野生型無明顯差異(分別為0.67 U/mg和0.69 U/mg),見表4。因此,優勢突變體活性的提高主要在于底物N-Boc-1a與酶的親和力增加。此外,CD檢測結果顯示XH7的Tm值比野生型提高了2.3 ℃,說明該突變體在kcat/Km提升的同時,其熱穩定性也略有提升(表4)。

表4 SrCAR優勢突變體的動力學和熱穩定性參數Table 4 Kinetic parameters and specific activity of SrCAR mutants

2.4 分子對接及分子動力學模擬分析

為闡明突變體催化活性及熱穩定性提高的可能分子機制,開展相關計算解析。通過分子對接獲得野生型WT及突變體XH7的蛋白-配體-底物復合體結構[圖4(a)];接下來對獲得的復合體結構開展分子動力學模擬。通過對50 ns的模擬軌跡進行均方根偏差(RMSD)分析發現,XH7的RMSD值分布比野生型更集中,主要富集在0.38 nm附近[圖4(b)],說明其在分子動力學模擬過程中結構更穩定。另外,在XH7中627位點由丙氨酸(A)突變為天冬酰胺(N)后,其酰胺側鏈可與底物N-Boc-1a形成2個氫鍵作用(d2和d3),同時也可以與AMP形成氫鍵相互作用(d4),而在WT中只有骨架N上的氫原子可以與底物形成氫鍵(d1)[圖4(c)]。因此,該位點突變后新形成的相互作用可能更有利于穩定底物N-Boc-1a在口袋中發生活化反應。雖然WT與XH7中430位點的骨架原子與AMP都存在氫鍵相互作用,但在XH7中甘氨酸(G)突變為纈氨酸(V)后,V430側鏈可以與F294形成烷基-π共軛作用(d5),此外,遠離活性中心的533位點由谷氨酸(E)突變為苯丙氨酸(F)后,可以與Y604形成π-π共軛效應(d6),由此可知,G430V/E533F突變可能通過與鄰近殘基的作用而利于提高突變體的熱穩定性。進一步分析發生以上相互作用關系的殘基間距離隨模擬時間變化的趨勢可知,G430V/E533F/A627N與底物、輔因子以及關鍵殘基的距離均維持在0.4 nm左右[圖4(d)],說明上述相互作用在模擬過程中比較穩定。

(a)野生型WT及突變體XH7與底物分子N-Boc-1a對接后的復合體結構圖;(b)野生型WT及突變體XH7體系的RMSD結果對比;(c)與突變殘基G430V/E533F/A627N相關的殘基間相互作用分析;(d)相互作用距離在分子動力學模擬過程中隨時間變化情況。圖4 野生型WT和突變體XH7與N-Boc-1a的分子對接以及復合物的分子動力學模擬結果分析Figure 4 Molecular docking of wild-type WT and mutant XH7 with N-Boc-1a and analysis of molecular dynamics simulation results of the complex

通過在線網站(https://www.expasy.org/resources/protscale)分析突變體XH7與WT的氨基酸疏水性強度。發現突變體XH7與野生型WT相比,430位點由甘氨酸(G)突變為纈氨酸(V)后,以及遠離活性中心的533位點由谷氨酸(E)突變為苯丙氨酸(F)后,它們周圍的疏水性明顯增強,更有利于蛋白結構的穩定,可能也是Tm值略有提高的原因。

2.5 放大反應

為檢驗工程化的SrCAR能否實現制備級轉化,用優勢突變體XH7全細胞催化20 mmol/LN-Boc-1a(10 mL反應體系)。檢測結果顯示中間產物積累較多[圖5(a)],推測可能是因為大腸桿菌內源醇脫氫酶(Alcohol dehydrogenase,ADH)還原力不足。據此,利用實驗室現有的ADH酶庫(共包含90種不同物種來源ADH),以5 mmol/L的中間產物N-Boc-1b為底物篩選合適的ADH,最終選取轉化率最高(57%)的熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)來源醇脫氫酶PfADH,與突變體XH7建立共表達體系。全細胞催化底物20 mmol/LN-Boc-1a放大反應結果[圖5(a)]所示,在PfADH-XH7共表達體系催化反應中,中間產物N-Boc-1b的積累明顯減少。在5 h時,底物轉化為終產物的量達到99%[圖5(b)]。經強酸脫Boc并用離子交換樹脂進一步純化后,對產物進行了NMR分析。結果為1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ 3.60(d, J=9.5 Hz, 1H), 3.30(t, J=8.5 Hz, 1H), 2.74(s, 3H), 1.47(dd, J=13.1, 6.4 Hz, 1H), 1.44～1.25(m, 1H), 0.94(t, J=7.1 Hz, 3H)。1H NMR結果分析顯示,分離獲得的產物為(S)-2-氨基丁醇,其分離得率為60%。

(a)中間產物N-Boc-1b生成情況;(b)產物N-Boc-1c生成情況。圖5 XH7與PfADH-XH7中間產物積累與產物生成情況Figure 5 Accumulation and product formation of XH7 and PfADH-XH7 intermediates

3 討論

(S)-2-氨基丁醇是一類非常重要的手性醫藥中間體,本研究選擇晶體結構已知[35]、催化機制較為清晰[21,34]的SrCAR為模式酶,以N-Boc保護的(S)-2-氨基丁醇(N-Boc-1a)為模式底物。為提高SrCAR催化還原非天然底物N-Boc-1a的活性,通過構建兩輪突變體文庫并篩選得到優勢突變體XH7(G430V/E533F/A627N),其kcat/Km是野生型模板SrCAR的2.1倍。催化活性提升的同時,其熱穩定性(Tm值)同步提高2.3 ℃。包含XH7與異源醇脫氫酶PfADH的重組大腸桿菌能夠在10 mL反應體系中5 h內完成底物N-Boc-1a(20 mmol/L)的轉化,轉化率達到99%,并經一步脫保護,獲得終產物(S)-2-氨基丁醇。反應體系中所用的ATP比較昂貴,后期可采用磷酸激酶實現由AMP到ATP再生,從而進一步提高放大體系的應用潛力。綜上,研究為生物合成(S)-2-氨基丁醇提供新思路,也為羧酸還原酶催化氨基酸類底物提供了理論參考。