黃腰胡蜂油脂的抗炎抗氧化活性測試及GC-MS分析

常雅萍, 劉超賀, 肖 懷, 張成桂, 楊銀河, 楊大松

(大理大學云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室, 大理 671000)

昆蟲是自然界種類最多、數量最大的生物類群,是地球上尚未被充分開發與利用的巨大生物資源。據估算,全世界昆蟲種類約有1 000萬種,占自然界全部生物資源60%以上,目前已知可供人類食用的昆蟲超過2 100種[1]。我國有悠久的食用昆蟲歷史,據統計,中國有324種與食品和飼料有關的昆蟲[2]。胡蜂也稱黃蜂或者馬蜂,是膜翅目胡蜂科昆蟲的總稱,全球約5 445種,中國約有290種。胡蜂是云南重要的經濟昆蟲,其不同發育階段都具有很高經濟價值。蜂蛹富含蛋白質、必需氨基酸、不飽和脂肪酸和微量元素等營養成分而成為云南人喜愛的特色風味食品[3-4],而胡蜂酒是收載于《中華人民共和國藥典》用于預防和治療風濕性關節炎的經典民族驗方。加上其生活環境多為樹木茂密的山林,使其成為云南很多山區少數民族的重要經濟來源[5]。

作為云南規?；B殖的特色食藥用昆蟲,胡蜂最常見的食用方式為油炸蜂蛹和成蟲泡酒。已有研究表明蜜蜂蜂蛹中脂肪含量約26%,而胡蜂蜂蛹中脂肪含量約22%[4,6-7]。民間食用蜂蛹通常是油炸,脂肪酸尤其是不飽和脂肪酸作為低極性分子和多種香氣物質的前體,在高溫烹飪過程中,產生揮發性的香氣分子,使蜂蛹具有獨特的風味,同時豐富的脂肪也是蜂蛹獨特口感的來源[4,6-7]。酒精炮制主要提取的也是胡蜂的中低極性成分,因此,油脂是胡蜂食藥用的主要成分之一。已有關于胡蜂營養價值的研究,但主要關注其中蛋白質含量、必需氨基酸組成等方面[3,7],而對油脂的活性和成分研究較少。

氧化還原是人體正常的生理生化和免疫反應,如果機體的氧化還原系統失衡,不僅會影響人體的正常生理狀態,還會加速衰老,導致炎癥、腫瘤、糖尿病等疾病發生[8]。因此,食品中所含成分的抗氧化能力是其保健和營養價值的重要參考,DPPH法是抗氧化活性測試的代表性方法之一。

類風濕性關節炎病情反復發作,致殘率高,臨床上缺乏特異性治療措施。胡蜂作為一種傳統的民族藥物,其藥用價值在古今民族藥著上都有記載,如《本草綱目》、《中國藥用動物原色圖鑒》、《中國民族藥志要》等。位于云南省德宏州的景頗族有采用胡蜂泡酒來預防和治療類風濕性關節炎的傳統,暗示胡蜂中含有抗炎活性成分。巨噬細胞作為機體的免疫細胞,當其受到脂多糖(LPS)等刺激時會分泌出一氧化氮(NO)等炎癥因子[9-10],因此,該模型可以用于評估胡蜂提取物的抗炎活性。

黃腰胡蜂作為云南代表性胡蜂品種之一,盡管其在民間已被廣泛食用或者藥用,而油脂作為其蟲體的主要組分在油炸蜂蛹的特色風味和胡蜂酒藥理活性中均發揮了重要作用,然而其化學成分和生物活性還缺乏現代系統研究,已成為影響其進一步開發利用的關鍵因素。鑒于此,本研究首先從黃腰胡蜂中提取油脂,并根據極性差異將其劃分為3個部位。隨后采用DPPH法對其抗氧化活性進行測試,同時采用LPS誘導的小鼠巨噬細胞炎癥模型對其體外抗炎活性進行測試。為進一步闡明黃腰胡蜂油脂發揮活性的物質基礎,本研究還采用GC-MS技術對其油脂的化學成分進行系統分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品信息

黃腰胡蜂樣品采集于云南省保山市,經大理大學藥學院楊自忠教授鑒定為膜翅目胡蜂科胡蜂屬黃腰胡蜂Vespaaffinis(Linnaeus)[11],標本保存于云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室,標本編號為YZZ20200923。

1.1.2 儀器與材料

氣相色譜-質譜聯用儀(7890A/5975C,美國Agilent Technologies公司);旋轉蒸發儀(RE -5210A,上海亞榮生化儀器廠);電子天平(FA2004N,上海精密科學儀器有限公司);酶標儀(SpectraMax-M2,美國Molecular Devices公司);乙醇(汕滇藥業有限公司);乙酸乙酯(天津福晨化學試劑有限公司);石油醚(汕滇藥業有限公司);正己烷(天津市津東天正精細化學試劑廠);甲醇(美國TEDIA公司);柱層析硅膠(青島海洋化工有限公司);GF254薄層層析硅膠板(青島海洋化工有限公司);1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(上海麥克林生化科技有限公司)。胎牛血清(批號2158738P,美國GIBCO公司);TNF-α(批號02182510821,Peprotech);LPS(批號026M4021V,美國Sigma公司); NO試劑盒(批號S0021S,碧云天生物技術公司)。

1.2 方法

1.2.1 油脂提取

黃腰胡蜂新鮮蟲體稱重,用95%乙醇(45 L)冷浸提取3次,過濾,合并濾液,減壓濃縮獲得總浸膏。按體積比1∶1加水混懸,用乙酸乙酯萃取4次,濃縮得到乙酸乙酯部位,采用硅膠柱色譜(300～400目)對其進行劃段。

1.2.2 抗氧化活性測試[12]

精密稱取黃腰胡蜂油脂樣品E1～E3,用甲醇逐級稀釋分別配成質量濃度為1、2、3、4、5和6 mg/mL的樣品溶液。精密稱取DPPH,用無水乙醇配制成濃度為0.125 mmol/L的溶液,現配現用。在96孔板中每孔加入20 μL樣品溶液和180 μL DPPH溶液,室溫避光反應30 min。使用酶標儀在517 nm波長處平行測定3次吸光值,取平均值,按如下公式計算待測樣品對DPPH自由基的清除率[13]。

清除率= [1-(Ai-Aj)/A0] × 100%

式中:Ai為樣品+DPPH的吸光度,A0為甲醇+DPPH的吸光度,Aj為樣品+無水乙醇的吸光度。實驗重復3次,取平均值。以樣品濃度為橫坐標,清除率為縱坐標作圖。

1.2.3 抗炎活性測試[14]

細胞培養:RAW264.7細胞用含10%胎牛血清的完全培養基,在37 ℃、5% CO2下培養,每24 h傳代一次,取對數生長期細胞進行實驗。

NO檢測:收集細胞,制成1×105mL-1的細胞混懸液。在96孔板中每孔100 μL,于37 ℃、5% CO2下培養,待細胞貼壁(約24 h)。用質量濃度為100 μg/mL的LPS刺激24 h后,將細胞分為4組:空白組、模型組(IFN-γ 20 ng/mL)、給藥組(IFN-γ 20 ng/mL和E1～E3各250 μg/mL)和陽性藥組(IFN-γ 20 ng/mL和甲氨蝶呤 50 μg/mL),實驗重復3個復孔。加藥后繼續培養24 h,使用NO檢測試劑盒測試細胞上清液在540 nm的OD值,根據標準曲線計算NO的表達水平。

1.2.4 GC-MS分析

稱取E1～E3各10 mg于10 mL容量瓶中,加入適量正己烷溶解并定容至刻度,搖勻備用。色譜柱:Agilent氣相毛細管色譜柱(19091S-433,30 m×250 μm×0.25 μm)。程序升溫:初始溫度70 ℃,保持3 min,以10 ℃/min升至180 ℃,再以1 ℃/min升至220 ℃,最后以20 ℃/min升至290 ℃。質譜條件:載氣為高純He;載氣流速1.0 mL/min;進樣量1.0 μL(分流比為10∶1)。EI離子源,離子源溫度230 ℃;四級桿溫度150 ℃;電離能量70 eV;質量掃描范圍m/z: 50～550。

2 結果與分析

黃腰胡蜂新鮮蟲體共15.7 kg,乙醇提取得總浸膏2.8 kg,經萃取濃縮得到乙酸乙酯部位350.8 g。乙酸乙酯部位采用硅膠柱色譜分離劃段,以石油醚∶乙酸乙酯(200∶1至50∶3)梯度洗脫,結合薄層色譜(TLC)特征,將成分相似部位合并得到極性低(E1)、中(E2)、高(E3)3個油狀餾分。

黃腰胡蜂3個油脂餾分清除DPPH自由基的測試結果如圖1所示。從圖1可以看出,在測試濃度范圍內,油脂的中、低極性部位(E2和E1)沒有顯著的抗氧化活性;而大極性部位(E3)隨著質量濃度升高,抗氧化活性逐漸增強,呈劑量依賴。

圖1 黃腰胡蜂油脂類成分的抗氧化活性Figure 1 Antioxidant activity of oil components extracted from V.affinis

黃腰胡蜂3個油脂餾分對LPS誘導巨噬細胞產生NO的抑制率測試結果如圖2所示。與空白組比較,模型組上清液NO含量顯著升高;與模型組比較,陽性藥組、黃腰胡蜂油脂給藥組上清液中NO含量明顯降低。其中,黃腰胡蜂油脂大極性E3部位的抗炎活性優于陽性藥甲氨蝶呤。綜上可知,黃腰胡蜂油脂的抗氧化和抗炎活性成分主要集中在大極性部位。

*** 為P<0.001;**** 為P<0.000 1。圖2 黃腰胡蜂油脂類成分的抗炎活性Figure 2 Anti-inflammatory activities of oil components extracted from V.affinis

黃腰胡蜂油脂極性低(E1)、中(E2)、高(E3)等3個部位GC-MS總離子流圖如圖3所示。采用NIST11.L標準庫檢索。各成分相對百分含量采用歸一化法進行計算,具體化學成分及其占比如圖4所示。結果表明,E1部分共鑒定出21個化合物,占總峰面積的98.59%,其中,不飽和脂肪酸(酯)有12個,占總峰面積的74.63%,其余均為長鏈飽和脂肪酸酯;E2部分共鑒定出20個化合物,占總峰面積的98.73%,其中,不飽和脂肪酸(酯)有11個,占總峰面積的74.47%;E3部分共鑒定出化合物20個,占總峰面積的76.37%,不飽和脂肪酸(酯)有8個,占總峰面積的58.27%。從以上數據可看出黃腰胡蜂油脂中富含優質的不飽和脂肪酸,低極性部位中不飽和脂肪酸含量高達74%。

圖3 黃腰胡蜂油脂成分的總離子色譜圖Figure 3 Total ion chromatogram of oil components extracted from V.affinis

圖4 黃腰胡蜂油脂成分占比圖Figure 4 Percentage of oil components extracted from V.affinis

研究表明,不飽和脂肪酸在人體中發揮了重要作用,尤其在穩定細胞膜結構、維持脂蛋白平衡、調控基因表達、促進生長發育等方面都扮演了關鍵角色[15-16],是食物中優質的營養成分。此外不飽和脂肪酸是肉食香味的重要前體物質。在炒制或炸制等烹飪胡蜂過程中,胡蜂油脂中富含的亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸作為多種香氣物質的前體,產生揮發性的香氣分子[17],使胡蜂在食用過程中具有獨特的風味,從而滿足人們追求食品色香味俱全的現實需求。

3個極性部位中代表性成分(含量超過5%或具有代表性的活性官能團)的對比分析見表1。從表1可以看出黃腰胡蜂油脂的中等極性和低極性部位組成大致相近,主要區別在于脂肪酸碳鏈的長短以及是否成酯。而大極性部位E3中含有兩個代表性成分:具有典型抗氧化活性官能團酚羥基的丁香酚,以及含量高達37%的亞麻酸,這在中低極性油脂中均未發現。結合E3部位與中低極性的E1和E2生物活性的差別,可以得知丁香酚和亞麻酸是黃腰胡蜂油脂發揮抗氧化和抗炎活性的主要和關鍵成分。

表1 黃腰胡蜂油脂代表性成分的GC-MS對比分析結果Table 1 Results of GC-MS analysis of oil components extracted from V.affinis

丁香酚可通過抑制環氧合酶-2的表達而發揮抗炎活性[18];通過抑制前列腺素E2而發揮鎮痛活性[19];通過增加抗氧化酶活性、使用酚羥基捕獲烷基過氧化基團等機理發揮抗氧化活性[20]。而亞麻酸也可以通過阻斷NF-κB、MAPLs激活和抑制COX-2、TNF-α降低炎癥介質的生成,減輕氧化應激水平而發揮抗炎和抗氧化作用[21-22]。

3 結論

(1)采用DPPH法和LPS誘導的巨噬細胞炎癥模型對從黃腰胡蜂中提取得到的3個不同極性的油脂部位的抗氧化和抗炎活性進行測試,結果表明黃腰胡蜂油脂的抗氧化和抗炎活性成分主要集中在大極性部位。(2)采用GC-MS技術對黃腰胡蜂油脂的化學成分進行系統分析,結果表明黃腰胡蜂油脂中富含優質不飽和脂肪酸,尤其在中低極性部位中含量高達74%,是其食用過程中獨特香味及口感的主要成分。(3)對黃腰胡蜂油脂的3個不同極性部位在抗氧化和抗炎活性以及化學成分上的差異做了對比分析,結果表明丁香酚和亞麻酸是黃腰胡蜂油脂發揮抗氧化和抗炎的主要和關鍵成分。

綜上,本研究采用DPPH法和LPS誘導的巨噬細胞炎癥模型對黃腰胡蜂油脂的抗氧化和抗炎活性進行測試;采用GC-MS技術對黃腰胡蜂油脂的化學成分進行系統研究;并結合相關領域研究進展對實驗結果進行對比分析。本研究不僅豐富了對黃腰胡蜂油脂化學成分和生物活性的認識,還為其進一步現代化開發奠定基礎。