來源于Pseudomonas多巴脫羧酶的異源表達、純化及酶學性質研究

周耀林, 孫登岳,2, 曾志雄, 李 霞,2

(1. 齊魯工業大學(山東省科學院)生物工程學部, 濟南 250000; 2. 齊魯工業大學(山東省科學院)生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室, 濟南 250000)

多巴胺(3,4-二羥基苯乙胺,DOPA) 是一種廣泛存在于人類和動物腦中的重要神經遞質,在哺乳動物大腦中含量最為豐富,其約占大腦中兒茶酚胺總量的80%[1]。多巴胺生理功能在60多年前被發現[2],此后人們一直在努力揭示多巴胺在生物體中的作用及其相關的分子作用機制,研究發現,多巴胺參與調節一系列的機體行為調節過程,包括運動、藥物成癮、長時程增強(LTP)、食物攝入和激素分泌等[3-9];多巴胺還與生理過程的調節有關,如在大腦外周作為心血功能、血管張力、胃和胃腸道功能的調節劑[10]。此外,多巴胺濃度的變化與一些疾病密切相關,如帕金森病、精神分裂癥、阿爾茨海默病和朊病毒病等[11-13]。

多巴脫羧酶(DODC)于1938年首次在哺乳動物腎臟組織中被發現[14],是酪氨酸合成黑色素代謝途徑中的關鍵轉化酶[12],可以催化左旋多巴(L-DOPA)脫羧生成多巴胺[15-16]。多巴脫羧酶廣泛存在于哺乳動物、昆蟲和植物中。在哺乳動物中,多巴脫羧酶常見于中樞及外圍組織的神經元內,在肺部、肝部、腎、腎上腺和胃腸道等組織內也有較高的表達,參與機體調節。在昆蟲中,多巴脫羧酶合成的多巴胺和5-羥基色氨作為一種幫助角質層硬化的前體物質,對昆蟲的行為和發育起著重要的作用[17-18]。在植物中,多巴脫羧酶與植物的激素合成和成熟相關,此外,還能產生作為藥物活性分子前體的芳香族生物堿[19]。

本研究對來源于Pseudomonas的DODC蛋白進行異源表達、純化,對其酶學性質進行研究,通過同源序列對比和系統發育樹對DODC的家族屬性進行分析,確定了催化活性的關鍵位點,為以后該酶的利用及其改造提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌BL21(DE3)、DH5α和CV6-pGEX-6P-1質粒(N-端帶GST標簽)等都是本實驗室保藏。酵母提取物、胰蛋白胨、NaCl等耗材均購自國藥集團化學試劑有限公司(上海,中國);質粒提取試劑盒購自賽默飛公司;Glutathione Sepharose 4B樹脂、離子交換色譜柱購自美國GE公司;限制性核酸內切酶SacⅠ、EcoRⅠ、連接酶SolutionⅠ和DNA Polymerase Prime STAR Max均購自Takara Bio公司(北京,中國);超濾管購自Millipore公司。

凝膠成像系統(Analytik Jena公司),SDS-PAGE系統(Hitachi公司),高速冷凍離心機(Hitachi公司),超聲波破碎儀(美國SONICS公司),蛋白純化儀(美國GE公司),高效液相色譜儀(日本島津公司),PCR儀(德國Eppendorf公司)。

1.2 方法

1.2.1 DODC載體構建

DODC蛋白的基因序列(GeneBank No.WP 010953480.1)在金唯智公司(天津,中國)合成,以該基因為模板設計引物Primer F:CCGGAATTCATGGCCACCCCGGAACAGTTC;Primer R:TTCCGCGGCCGCTATGGCCGACGTCGACCTAGCCCTTAATAACATCTTGCAG。通過PCR擴增目的基因。擴增體系為25 μL,循環參數:98 ℃預變性30 s;98 ℃變性10 s,54 ℃退火15 s,72 ℃延伸5 s,運行30個循環;72 ℃保溫10 min。擴增的目的基因和載體CV6-pGEX-6P-1用限制性內切酶EcoRⅠ和SacⅠ進行雙酶切,然后進行切膠回收,用SolutionⅠ在16 ℃連接25 min。再用熱激法轉化至DH5α感受態細胞中,挑單菌落,分別進行菌落PCR和雙酶切驗證,最后送樣進行驗證。

1.2.2 重組蛋白表達與純化

將構建好的重組質粒轉化到BL21感受態細胞中過夜培養,挑取轉化子轉接到5 mL試管LB培養,再轉接到1 L搖瓶LB中培養,待OD值達到0.6～0.8,加入異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.1 mmol/L,誘導蛋白表達,16 ℃過夜培養12～16 h,4 ℃條件下4 000 r/min,離心15 min收集菌體。菌體置于裂解緩沖液[50 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,10%(體積比)甘油,0.4 mol/L氯化鈉]中,并加入80 μL 50 mg/mL的溶菌酶,40 μL 1 mol/L的PMSF和10 μL β-巰基乙醇混勻。隨后用超聲波破碎儀在低溫條件下破碎細胞,設置條件:超聲破碎3 s,間隔5 s,功率40%(總500 W),時間10 min。破碎液于4 ℃、13 000 r/min離心60 min。取上清液與已平衡好的Glutathione Sepharose 4B樹脂在混合儀上4 ℃溫育2 h,隨后將結合目的蛋白的樹脂加入一次性層析柱中,用裂解緩沖液洗去雜蛋白,最后用洗脫緩沖液洗掉目的蛋白。用本實驗室純化3C蛋白酶于4 ℃過夜酶切去除GST標簽蛋白,最后通過Source Q柱進一步純化。

1.2.3 DODC酶學性質測定

以左旋多巴為底物,采用液相色譜法測定DODC的酶活性。反應體系(500 μL):100 mmol/L PBS緩沖液(pH 7.5),2 mmol/L左旋多巴底物,9.6 nmol/L多巴脫羧酶。在40 ℃條件下反應5 min后,于沸水浴孵育5 min終止反應。每組實驗數據均重復3次,并設置對照組(將酶液替換成緩沖液,其余條件不變)。高效液相色譜條件:ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(3 μm,4.6 mm×250 mm),流動相:2%乙酸溶液-甲醇(90∶10);流速0.5 mL/min;柱溫:室溫;檢測波長280 nm;進樣量40 μL。單位(U)被確定為每分鐘1 μmol產物的生成量。

(1)最適反應溫度和溫度穩定性。在pH 7.0 PBS緩沖液(100 mmol/L)中,將反應體系分別置于20～65 ℃條件下進行測定[20]。將酶液分別置于20～65 ℃條件下保溫30 min、1 h和2 h ,然后冰浴10 min,測定殘余酶活性,以4 ℃下酶液活性為100%。

(2)最適反應pH及pH穩定性。選擇pH 5.5～9.0(100 mmol/L)的緩沖液;MES緩沖液pH 5.5～6.5;PBS緩沖液pH 6.0～9.0; HEPES緩沖液pH 7.0～9.0;Tris-HCl 緩沖液pH 7.0～9.0。在40 ℃條件下進行測定,其中以酶活最高者為100%。將酶置于上述不同pH的緩沖液中,4 ℃條件下保溫1 h后測定酶活,其中酶活最高者為100%。

(3)金屬離子對DODC酶活的影響。選擇Ca2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Ni2+和Al3+等8種金屬離子,終濃度為0.5 mmol/L,在4 ℃條件下與酶孵育10 min后加入底物,測定酶活[21-23]。以不加金屬離子組作為對照組。

(4)底物特異性。以多巴、色氨酸、酪氨酸、5-羥基色氨酸作為底物,在40 ℃、 pH 7.0下反應5 min,測定酶活。以多巴、酪氨酸、5-羥基色氨酸為底物的檢測波長為280 nm,以色氨酸為底物的檢測波長為275 nm[24]。

2 結果與分析

2.1 載體構建及雙酶切驗證

構建好的重組質粒,用菌落PCR的方法初步驗證,獲得1條單一條帶,結果見圖1(a),條帶約為1.4 kb,這與目的基因的長度一致;利用限制性內切酶EcoRⅠ和SacⅠ對重組質粒DODC-CV6進行酶切驗證,獲得2條大小分別為1.4 kb和5 kb的條帶[圖1(b)],5 kb的條帶與載體的長度一致,1.4 kb的條帶與目的基因的長度一致;經驗證序列正確,說明重組質粒構建成功。

(a)1、2: PCR產物;M:DNA Marker;(b)1、2:雙酶切驗證;M:DNA Marker。圖1 DODC菌落PCR和雙酶切驗證Figure 1 Enzyme digestion and colony PCR of DODC-CV6

2.2 DODC表達純化

利用生物信息學軟件DANMAN分析DODC核酸序列,預測其分子質量約為51.5 ku,GST標簽的大小為26 ku,所以GST-DODC融合蛋白理論值為77 ku。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析[圖2(a)],15 mmol/L谷胱甘肽的洗脫緩沖液中含有較多的目標蛋白,說明DODC與Glutathione Sepharose 4B樹脂親和力較強,且蛋白分子質量和預測值大致一樣。

(a)GST-DODC純化蛋白SDS-PAGE分析[ 1:超聲樣;2:上清樣;3:流穿樣;4、5:洗滌樣;6～8:洗脫樣(15 mmol/L 谷胱甘肽)]。(b) 酶法去掉融合標簽GST(1:酶切前;2:酶切后)。(c) GST-DODC離子交換層析及SDS-PAGE結果。圖2 DODC蛋白純化示意圖Figure 2 Purification of DODC

通過親和層析后獲得較純蛋白,直接以質量比50∶1的比例加入3C蛋白酶,4 ℃過夜酶切,從SDS-PAGE 圖[圖2(b)]可以看出,GST-DODC融合蛋白被切分為51.5 ku的DODC蛋白和26 ku的GST標簽。

通過Source Q陰離子吸附層析柱,利用 GE Healthcare的 AKTApure蛋白純化儀對蛋白進一步進行離子吸附層析純化。從陰離子吸附層析圖[圖2(c)]中可以看出,GST標簽在47 mL流出,DODC蛋白在56 mL流出。結合SDS-PAGE圖分析能夠得到純度較高的目的蛋白,可以用于蛋白濃度的測定和酶活測定。

2.3 酶學性質分析

2.3.1 溫度對DODC催化活性及穩定性的影響

溫度對酶活性具有較大影響。隨著溫度的升高,底物分子熱運動加快,分子碰撞的機會增加,從而提高了酶的活性。但溫度過高會導致蛋白質的變性失活。由圖3(a)可得,DODC最適催化溫度為40 ℃。在35～45 ℃時,相對酶活保持70%以上;當溫度高于45 ℃時酶活急劇下降,在65 ℃時酶活低于40%,因此DODC在體外的最適催化溫度范圍為35～45 ℃。

(a) 溫度對DODC酶活的影響;(b) DODC的熱穩定性。圖3 溫度對DODC酶活和熱穩定性的影響Figure 3 Effect of temperature on DODC enzyme activity and thermal stability

由圖3(b)可知,隨著保溫時間增加,酶活性不斷下降,并且溫度越高、保存時間越長其活性下降程度越大。DODC在20～30 ℃,保溫2 h的情況下,酶活性保留50%以上,當保存溫度高于35 ℃時,隨著保存時間的增加,活性下降幅度越大。因此,DODC對溫度較為敏感。

2.3.2 pH對DODC催化活性及穩定性的影響

pH是影響酶活性的另一個重要因素。當酶處于過酸或者過堿的環境時,都會造成酶不可逆的失活。由圖4(a)可知,DODC催化反應的最適 pH 緩沖液為 PBS(pH 7.5),在pH值小于7.5時,酶活性隨著緩沖液pH的增加逐漸升高;當pH值大于7.5時,酶活性隨著緩沖液pH增加逐漸降低。在同樣pH條件下,與Tris-HCl和HEPES 緩沖液相比較,PBS緩沖液更適合DODC的催化反應。極端pH條件如pH 6.0及以下,DODC的相對酶活低于30%。因此,DODC最適緩沖液是 PBS且最適pH值為7.5。由圖4(b)可知,在pH 6.0～7.5時,酶活仍可以保留80%以上活性,在pH 6.5時,DODC最穩定;在pH 8.0～9.5時,酶活性已經低于50%。

(a) pH對DODC酶活的影響;(b) DODC的pH穩定性。圖4 pH對DODC酶活和催化穩定性的影響Figure 4 Effect of pH on the DODC activity and stability

2.3.3 金屬離子對DODC酶活的影響

由圖5可知,在一系列陽離子中,Cu2+、Zn2+、Ni2+、Al3+對DODC酶活均有抑制作用,其中,Cu2+的抑制作用最明顯,相對酶活為80%。Mg2+、Mn2+、Fe2+對DODC酶有促進作用,其中,Ca2+在這8種陽離子中對酶活促進作用最為明顯,使酶活提高10%。

不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。圖5 不同陽離子對DODC酶活的影響Figure 5 Effect of different cations on the activity of DODC

2.3.4 酶動力學參數和底物特異性

以濃度為0.5～12 mmol/L左旋多巴作為底物測試酶動力學參數,用GraphPad 8.0.2的Michaelis-Menten方程非線性擬合處理數據,得到DODC對左旋多巴的動力學參數Km為1.013 mmol/L,kcat為37.76 s-1,kcat/Km為37.76 s-1mmol/L-1)。

實驗分別測定了DODC對酪氨酸、5-羥基色氨酸、左旋多巴和色氨酸的底物特異性。由圖6(a)可知, DODC對左旋多巴的酶活最高,其次為酪氨酸和5-羥基色氨酸,對色氨酸幾乎沒有活性。從4種底物的結構分析可知,酪氨酸與左旋多巴的結構較為相似,僅苯環3號C位多了一個羥基,因此,DODC對酪氨酸的催化活性僅次于左旋多巴,相對酶活可達79.8%。DODC對色氨酸幾乎沒有活性,5-羥基色氨酸與色氨酸結構較為相似,但在苯環5號C位多了一個羥基,故DODC對5-羥基色氨酸的相對酶活也極低,僅為7.2%。因此,DODC的最適底物為左旋多巴。此外,進一步分析左旋多巴的催化產物,由圖6(b)液相色譜圖可知,DODC催化左旋多巴的產物峰在6.81 min出現,產物為多巴胺。

(a)不同底物DODC的酶活性;(b)高效液相色譜法檢測左旋多巴的催化產物。不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。圖6 DODC的底物特異性Figure 6 Substrate specificity of DODC

2.4 DODC 的序列同源性分析

利用NCBI數據庫,通過BLAST功能獲得與DODC氨基酸序列相近的其他來源的多巴脫羧酶氨基酸序列,采用Clustal X 進行序列比對,然后用Espript 3.0進行著色美化,結果見圖7。結果顯示來源于Pseudomonassp. FW305-E2 、Pseudomonassp. USTB-Z 、Pseudomonassp. BP6 、Pseudomonassp. PNP、Susscrofa的脫羧酶的相似度較高,其中,與來自Pseudomonassp. FW305-E2的多巴脫羧酶相似度為99%。將獲得的不同來源的脫羧酶序列采用MEGA 11軟件構建系統進化樹,如圖8所示。結合序列對比分析,DODC屬于AAT-Ι 超家族,其保守的催化結合位點為Thr 241,這也與報道的Pseudomonassp. PNP DOPA decarboxylase是一致的[25-26]。

圖7 DODC氨基酸序列比對Figure 7 Sequence alignment of DODC

圖8 DODC系統樹分析Figure 8 Phylogenetic analysis of DODC

3 結論

多巴脫羧酶屬于芳香族氨基酸脫羧酶,可以將左旋多巴催化產生多巴胺。多巴胺作為一種重要的神經遞質,能夠調節神經元功能,預防高等動物的精神病和神經退行性疾病。此外,多巴脫羧酶已被確定為癌細胞神經內分泌標志物。研究表明DODC基因的表達有助于腫瘤和癌細胞的鑒別診斷,其酶活性是體外區分小細胞肺癌(SCLC)與其他肺癌類型的重要標志物。腫瘤患者中DODC蛋白水平高者比水平低者更容易康復。因此,多巴脫羧酶對癌細胞類型的鑒別診斷,以及人類癌癥的治療都有重要的意義。

本研究將多巴脫羧酶(DODC)在大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中進行異源表達,經過GST-樹脂親和層析、3C蛋白酶切和離子交換層析,獲得了純度在95%以上的DODC純化蛋白,這為以后的蛋白結晶以及結構解析提供了前提條件。與此同時,還測定了DODC蛋白的酶學性質,實驗發現DODC酶的最適溫度為40 ℃;最適pH 7.5,已報道DODC(WP 088512758.1)的最適溫度為55 ℃;最適pH 8.0,兩種酶性質較為接近[27]。金屬離子Ca2+對DODC酶具有較強的促進作用,酶活提高了10%,Cu2+對DODC酶的抑制作用最為明顯,相對酶活為對照組的80%,相較已報道的DODC(WP 088512758.1),來源于Pseudomonas的DODC酶對金屬離子的耐受性更強。DODC的特異性底物為左旋多巴,催化產物為多巴胺。kcat/Km與酶的催化效率成正比,與酶的活性有直接關系,而DODC對左旋多巴的kcat/Km為37.76 s-1mmol/L-1,是DODC(WP 088512758.1)的1.76倍,所以DODC比DODC(WP 088512758.1)有更好的應用前景[27]。通過序列同源性分析,確定DODC屬于AAT-Ι 超家族,預測了該酶的催化位點為Thr 241,這為后續酶的定向改造和催化機制解析提供了條件。本研究對DODC的理化性質進行基礎研究,為以后該蛋白晶體結構解析和催化機理的解析提供了一定理論基礎。