人原代呼吸道上皮細胞培養及抗呼吸道合胞病毒活性

丁惠如, 趙 敏, 程寧寧, 付遠輝, 彭向雷, 虞結梅, 鄭妍鵬, 何金生

(北京交通大學生命科學與生物工程研究院, 北京 100044)

人呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus, RSV)是人類呼吸道疾病的重要病原體,所引發的感染是導致兒童下呼吸道疾病和毛細支氣管炎的主要病因,也是老年人和免疫功能低下患者發病和死亡的重要原因[1-3]。與RSV相關的呼吸道感染已成為全世界范圍內主要的公共衛生問題之一,盡管從20世紀60年代起已開始研發RSV疫苗和治療藥物,但目前不僅仍無安全、有效的疫苗問世,針對RSV感染的抗病毒治療藥物也非常有限。迄今為止,僅有利巴韋林(Ribavirin)和帕利珠單抗(Palivizumab)兩種藥物用于防治RSV感染[4-6]。然而,Ribavirin療效欠佳、副作用大,存在一定的健康風險,并不建議常規使用[7-9]。Palivizumab是特異性針對RSV F蛋白的人源化單克隆抗體,已獲美國FDA批準,可用于預防高危嬰幼兒因RSV感染而引發嚴重下呼吸道疾病,但其價格昂貴且不能用于RSV感染后的治療[10-12]。因此,尋找安全、高效的抗RSV治療性藥物,仍是當前亟待解決的重要課題。

目前,抗RSV藥物研發主要使用永生化的非極化上皮細胞系或RSV半許可復制動物模型[13-15]。永生化的呼吸道來源的細胞系,如HEp-2、BEAS-2B和A549細胞等,雖然在抗RSV藥物體外藥效評價具有一定價值,但很難反映呼吸道上皮細胞的復雜性[16-17]。小鼠等嚙齒動物模型對RSV感染是半許可復制,亦難以再現人類RSV感染特征,作為抗病毒藥物功效評價具有一定的局限性[18]。研究表明[19-23],人原代呼吸道上皮細胞(Human airway epithelial cell,hAEC)在允許細胞極化的條件下培養時會發生顯著的形態變化,可準確重現其正常的在體形態。與非極化的上皮細胞相比,極化的呼吸道上皮細胞能夠最大程度模擬體內呼吸道情況。因此,原代培養的呼吸道上皮細胞,尤其是分化良好的hAEC在抗RSV藥物篩選、藥效評價等方面受到廣泛青睞。本研究建立了hAEC的培養方法并構建了RSV的體外感染模型,在該模型上檢測了小分子化合物RSV-A-4和6-MMPr的抗RSV活性及其細胞毒性,進而探討兩種化合物抑制RSV復制的作用機制,為RSV藥物研發和發病機制等研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠胚胎成纖維細胞(NIH/3T3)購自中國科學院上海細胞庫;野生型RSV-long株購自美國ATCC;RSV-mGFP由法國Université de Versailles Saint-Quentin-en-Yvelines 大學Marie-Anne Rameix-Welti博士饋贈;RSV-A-4為前期本實驗室從國家新化合物庫篩選并結構優化的小分子化合物;6-MMPr和Ribavirin購自上海陶素生化科技有限公司;RSV-604和GS-5806購自美國MCE公司。

1.2 方法

1.2.1 hAEC標本的獲取及培養

采集志愿者鼻拭子(志愿者為本課題組學生,均獲知情同意,并經北京交通大學理學院倫理審查委員會批準),浸泡于培養基中,充分洗滌后,450 g,室溫離心5 min,棄上清液,用F培養基(DMEM/F12,Gibco BRL, 美國)重懸后,加入到生長有NIH/3T3細胞的T25培養瓶中,37 ℃、5% CO2細胞培養箱培養;每天更換F培養基,5 d后更換為無抗生素的培養基繼續培養,hAEC生長密度達50%以上時進行傳代。

1.2.2 hAEC形態學觀察和活力測定

每天定時在倒置顯微鏡下觀察細胞形態,當hAEC生長密度達到80%時,采用胰酶消化細胞,制備單細胞懸液,0.4%臺盼藍染液染色后,置于倒置顯微鏡下觀察,隨機取3個視野統計死細胞與活細胞數目,進而計算hAEC的細胞存活率。

1.2.3 hAEC免疫熒光染色鑒定

按5×104個細胞/孔,將hAEC接種于置入細胞爬片的6孔板中,37 ℃、5% CO2培養,每天換液并記錄細胞狀態,當細胞豐度達到80%左右時,吸出培養基,PBS洗3次后,用預冷的95%乙醇4 ℃固定30 min;棄去乙醇,PBS洗3次,加入含5%胎牛血清的封閉液,37 ℃封閉30 min;PBS洗3次,加入兔抗人角蛋白單克隆抗體(Abcam,Cat.No.ab53280)(1∶1 000稀釋),37 ℃孵育1 h;PBS 洗3次,加入山羊抗兔 DyLight488 熒光二抗(Abcam,Cat.No.ab96899)(1∶5 000稀釋),37 ℃孵育1 h;PBS洗滌后,加入DAPI 核染劑染色15 min,最后用90%甘油進行封片后在顯微鏡下觀察。

1.2.4 RSV感染hAEC

P3代hAEC生長密度達到60%時準備接毒,棄去原培養基,PBS洗1次,加入7 mL 2%細胞維持液,按0.1 MOI接種 RSV-mGFP病毒,混勻,37 ℃、5% CO2培養,接毒約20 h后,更換維持液,每天觀察細胞病變情況,待細胞完全病變后,收集病毒。

1.2.5 細胞活性檢測(MTS法)

按1.5×104個細胞/孔將hAEC接種于96孔板,37 ℃、5% CO2培養過夜;棄去原培養基,PBS洗過后,將0.1、1、10、100和1 000 μmol/L的待測化合物加入96孔板中,100 μL/孔,設置陰性對照、陽性對照組(Ribavirin)及空白對照。37 ℃培養48 h,棄原培養基,PBS洗1次,避光將MTS和PMS按照20∶1混合,并將20 μL混合液與100 μL 2%細胞維持液加入到96孔板中,37 ℃孵育3 h后,使用多能酶標儀檢測490 nm處OD值,計算細胞活性CC50。

細胞活性=(實驗組吸光度值-空白對照組吸光度值)/(細胞陰性對照組吸光度值-空白對照組吸光度值)×100%

1.2.6 化合物抑制RSV復制活性分析

按2×104個細胞/孔將hAEC接種于黑色透明底96孔板,37 ℃、5% CO2培養24 h后,將濃度為0.02、0.2、2、20和200 μmol/L的待測化合物分別與3 000 PFU/50 μL的 RSV-mGFP等體積混合,按100 μL/孔加入96孔板中,同時設置陰性對照(DMSO稀釋50倍)和病毒對照組(只加3 000 PFU的RSV-mGFP),37 ℃,5% CO2培養48 h,用多功能酶標儀檢測綠色熒光蛋白的熒光強度,并計算IC50。

1.2.7 Time-of-addition assay分析

將hAEC按1.5×104個細胞/孔接種于96孔板,37 ℃培養24 h后棄培養基,PBS洗1次,加入用2%維持液稀釋的RSV病毒液,每孔3 000 PFU/100 μL,37 ℃、5% CO2孵育2 h,此時間點定位第0小時,棄去培養基,PBS洗滌1次,加入90 μL維持液,37 ℃培養;將化合物用維持液稀釋,使稀釋濃度低于其CC50,但大于IC50,RSV-A-4、6-MMPr、RSV-604、GS-5806及Ribavirin分別為1 mmol/L、50 μmol/L、10 μmol/L、1 mmol/L和100 μmol/L,設立陰性對照組;分別于-1、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13及14 h時,加入10 μL不同化合物及DMSO,加入病毒約24 h后,PBS洗3次,提取細胞與病毒RNA,RT-qPCR測定RSV病毒滴度。

1.3 數據處理與分析

正態分布數據選用t檢驗和單因素方差分析方法,非正態分布數據采用非參數檢驗,通過IBM SPSS statistics 22軟件進行統計學分析,通過GraphPad Prism 8作圖,以P<0.05作為不同組間差異具有顯著性的標準。

2 結果與分析

2.1 hAEC細胞培養與鑒定

2.1.1 hAEC形態學觀察

顯微鏡下觀察hAEC生長情況,結果如圖1所示。接種hAEC第2 天,即可見有原代細胞出現;第3～5天,細胞團逐漸變大,細胞聚集成團;第5～8天,細胞數量逐漸增多,細胞團面積也逐漸變大,細胞呈扁平狀、多邊形狀,密集呈鵝卵石鋪路樣分布生長(圖2),約占細胞培養瓶的80%以上;第10天,細胞匯合度達90%,說明hAEC在滋養層細胞上生長良好。

紅圈標示的是原代細胞,第10天時原代細胞匯合度達90%左右。圖1 hAEC的連續培養狀態(4×)Figure 1 The continuous culture of hAEC (4×)

hAEC傳代結果顯示(圖3),在首次傳代的第1天,即可見有小的原代細胞團出現,待細胞長到第4天時,匯合度可達90%左右,表明首次傳代的細胞比原代培養的細胞生長更快。

圖3 hAEC首次傳代后生長狀態(4×)Figure 3 The growth status of hAEC after the first cell passage(4×)

2.1.2 hAEC活力測定

hAEC用0.4%臺盼藍染色后鏡檢顯示多數為強光點,只有較少數為藍色點。結果提示,原代培養的hAEC細胞活性較高。隨機選取3個樣本(圖4),計算hAEC存活率分別為94.23%、90.10%和95.19%,培養的hAEC平均細胞活力則為93.51%。

活細胞未被染色用黑色圈標示;死細胞被染色為深藍色用紅色圈標示。圖4 臺盼藍染色檢測hAEC存活率 (10×)Figure 4 The hAEC survival rate determined by trypan blue staining (10×)

2.1.3 hAEC免疫熒光染色鑒定

細胞免疫熒光染色結果顯示(圖5),hAEC經兔抗人角蛋白單克隆抗體與山羊抗兔 DyLight488 熒光二抗結合孵育后呈陽性,胞漿著色為綠色,細胞經DAPI復染后,細胞核為藍色,人角蛋白單克隆抗體能與培養的原代細胞特異性結合,表明培養的細胞為hAEC。

(a)hAEC細胞胞漿著色(10×);(b)hAEC細胞胞漿著色(20×);(c)hAEC細胞核經DAPI復染后著色(10×);(d)hAEC細胞核經DAPI復染后著色(20×);(e)merge后圖像(10×);(f)merge后圖像(20×)。圖5 免疫熒光染色鑒定hAECFigure 5 Identification of hAEC by immunofluorescence staining

2.1.4 RSV感染hAEC

如圖6所示,P3代hAEC接種RSV-mGFP 24 h時,僅有極小的融合現象,提示病毒開始在細胞中復制;接種48和72 h時,可見病毒大量復制,出現大面積細胞融合、細胞核核聚集等典型的CPE,這表明RSV能夠在hAEC中有效復制,也說明原代培養的hAEC可作為一種較為理想的RSV體外感染模型。

圖6 RSV-mGFP感染hAEC后細胞病變狀態Figure 6 The cytopathic effect (CPE) of hAEC infected with RSV-mGFP at different time points

2.2 RSV-A-4和6-MMPr的體外抗RSV活性

相對永生化的細胞系,原代培養的呼吸道上皮細胞能夠最大程度模擬體內真實的生理狀態和個體之間的差異,因此,根據課題組前期實驗基礎,本研究選取了RSV-A-4與6-MMPr兩種小分子化合物進行基于hAEC的抗RSV活性研究,RSV-A-4與6-MMPr對hAEC的細胞毒性及對RSV的抑制效果如表1和圖7所示。

表1 RSV-A-4和6-MMPr基于hAEC的CC50、IC50及SITable 1 The CC50, IC50 and SI of RSV-A-4 and 6-MMPr based on hAEC

(a)RSV-A-4和6-MMPr的細胞毒性檢測結果;(b)RSV-A-4和6-MMPr的抗RSV活性檢測結果。實驗結果以平均值±標準差表示,* 為P<0.05。圖7 基于hAEC的RSV-A-4和6-MMPr細胞毒性和抗RSV活性Figure 7 The cytotoxicities and anti-RSV activities of RSV-A-4 and 6-MMPr on hAEC

由表1可見,6-MMPr在hAEC上的CC50值為(95 526±10.97) μmol/L,而RSV-A-4對hAEC幾乎無毒性,RSV-A-4與6-MMPr 的IC50值分別為(207.3±4.766) μmol/L和(3 191±6.106) μmol/L。

2.3 RSV-A-4與6-MMPr均于病毒基因組復制階段抑制RSV復制

鑒于篩選的RSV-A-4和6-MMPr在hAEC體系中具有良好的抗RSV活性,本研究在hAEC中采用Time-of-addition assay對其抗病毒作用機制進行了初步探討。結果如圖8所示,在-1、0、1、2、3、4和5 h給予RSV-A-4或6-MMPr均可有效抑制RSV復制,與靶向N蛋白藥物RSV 604相似,由此推測RSV-A-4和6-MMPr主要是在RSV的感染晚期或進入細胞后發揮抗感染作用。

虛線指示RSV感染細胞的時間為2 h;實驗結果以平均值±標準差表示。圖8 RSV-A-4和6-MMPr抑制RSV復制周期結果Figure 8 The experimental results of RSV-A-4 and 6-MMPr inhibit RSV replication cycle

3 討論與結論

呼吸道上皮是呼吸道重要天然屏障,作為人類呼吸道與外界環境相連的第一道免疫防線,hAEC對維持防御功能和各項生理功能的運行起關鍵作用[24-25]。分化良好的hAEC由多層上皮細胞組成,包括纖毛、杯狀細胞和基底細胞等,可模仿人呼吸道的生理功能和形態環境,是研究RSV感染更為合適的體外模型。目前,全球范圍內已有多個研究小組建立了人呼吸道上皮細胞的原代培養方法,且已將hAEC用于呼吸道病毒感染和呼吸道固有免疫等領域的研究[26-28]。但需要指出的是,hAEC培養在我國尚處于起步階段,因此,建立hAEC培養對開展RSV疫苗和抗RSV藥物研究具有重要價值和意義。

本文通過采集志愿者鼻拭子分離和培養出hAEC,并對hAEC細胞形態、活性及純度進行了鑒定,結果顯示hAEC的培養方法成功建立。相對細胞系,hAEC對培養環境和實驗操作的要求更苛刻,不規范的實驗操作可能會導致細胞生長緩慢、表型不一致甚至細胞污染,因而,規范實驗操作和有效控制細胞污染是獲得高質量hAEC的關鍵因素。此外,對人呼吸道上皮細胞培養模型,通常從呼吸道中鼻上皮、鼻咽上皮(腺樣體)和氣管支氣管上皮這3個區域來獲得原代上皮細胞,因而優化取材獲得合格質量的樣本是成功培養hAEC的另一個關鍵因素。hAEC在體外通常只能傳代20多次,因而,如何圍繞有限傳代次數的hAEC設計實驗,經濟高效地利用好hAEC,也是一個挑戰。當新收獲的或傳代的hAEC在允許細胞極化的條件下培養時,其細胞形態會發生顯著變化,使得細胞更準確地重現其正常的體內形態,獲得分化良好的極化的hAEC。在不斷探索之后發現,當人呼吸道上皮細胞被體外培養在多孔載體上的氣-液兩相界面處時,其表現出了與體內幾乎相同的形態學和關鍵生理學過程[29-31]。我們也曾嘗試建立基于氣-液兩相的hAEC培養方法,但目前尚未獲得分化良好的極化的hAEC,因而,將hAEC培養于多孔載體的氣-液兩相界面,獲得分化良好的極化的hAEC將是我們下一步工作的重點。

在成功培養出hAEC后,考察了課題組前期在Hep-2和BEAS-2B細胞系中篩選出具有抑制RSV增殖的活性骨架化合物RSV-A-4和具有廣譜抗病毒作用的硫唑嘌呤(AZA)三級代謝產物6-MMPr在hAEC體系中的抗RSV活性及其抗RSV活性的可能作用機制。實驗結果顯示:6-MMPr在hAEC上的CC50值為(95 526±10.97) μmol/L,而RSV-A-4對hAEC幾乎無毒性,RSV-A-4與6-MMPr 的IC50值分別為(207.3±4.766) μmol/L和(3 191±6.106) μmol/L;Time-of-addition assay實驗結果則揭示,RSV-A-4和6-MMPr的體外抗病毒活性主要是作用于RSV的復制階段,二者均是于RSV感染早期,RSV復制階段抑制RSV活性,但還需要進一步闡明RSV-A-4和6-MMPr的有效作用靶點和確切分子機制等。

綜上所述,研究成功構建了RSV的體外感染模型hAEC,并在hAEC上考察了RSV-A-4和6-MMPr的抗RSV活性,并探討二者抗RSV的可能作用機制,為進一步研發抗RSV藥物奠定了重要基礎。但后續工作尚需在小鼠體內進一步驗證RSV-A-4和6-MMPr的體內抗病毒活性,以明確其應用前景。