綿羊超數排卵中血清代謝物變化比較分析

馮 睿, 徐全忠, 王春偉, 王樂群, 馮 爽, 張海龍, 張 立, 張立果, 蘇小虎

(1. 內蒙古大學生命科學學院省部共建草原家畜生殖調控與繁育國家重點實驗室, 呼和浩特 010020;2. 內蒙古烏蘭察布市涼城縣農牧和科技局涼城縣畜牧工作站, 烏蘭察布 013750;3. 內蒙古烏蘭察布市農牧和科技局烏蘭察布市畜牧工作站, 烏蘭察布 012000)

超數排卵是利用外源性促性腺激素在一個發情周期內誘導多個卵泡同時發育,結合胚胎移植技術實現優良家畜個體快速繁殖。然而在生產應用中,供體生產胚胎的效率受多方面影響。尋求合適的表征指標以進行供體篩選是提高超數排卵效率的可行手段之一。除了促卵泡激素(FSH)和促黃體生成素(LH)外,一些小分子代謝物也可以影響卵泡發育。已有研究表明,卵泡液中的一些代謝物不僅影響卵母細胞和顆粒細胞的質量,還可以用來表征卵泡發育[1]。卵泡液中的脂肪酸濃度、氨基酸濃度、葡萄糖類代謝產物均可對卵子成熟產生影響,可用于卵泡發育狀態表征[2-4]。有研究表明,卵泡液的一些小分子物質來自血液[5]。因此,血液中的某些代謝物將是反映卵泡發育狀況的可行指標。

本實驗選取年齡和體重相近的東佛里生綿羊作為供體,分別于卵泡刺激素(FSH)注射前(1st)和人工授精前(2nd)采集血液。外源FSH注射前,卵泡優勢化成熟尚未啟動,此時應全部為小卵泡。人工授精前,此時已確認供體發情,卵泡已成熟,卵母細胞進入成熟階段。采用LC-MS/MS進行非靶向代謝組學分析,研究超數排卵時血清代謝物與胚胎產生的關系,可以為胚胎生產中提供飼喂方面的理論依據,也為卵子體外成熟培養體系的優化提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗地點與供體母羊管理

供體母羊飼養于內蒙古烏蘭察布市豐東知盈牧業科技有限公司。本研究選用的超數排卵供體為1～3歲身體健康、體重65～70 kg的經產東佛里生綿羊。以母羊的營養需求為基礎,在畜舍飼養中統一管理。飼料配比:13.60%苜蓿干草、27.30%羊草、4.60%玉米草、15.20%全株玉米青貯、15.20%玉米粒、24.10%母羊精料,粗精比為70∶30。

1.2 方法

1.2.1 超數排卵方法

試驗開始前首先進行發情檢測,選取未發情供體同期發情及超數排卵流程如下:隨機一天將CIDR(Zoetis, New Zealand)插入未發情期母羊陰道內,記為D0;在第10～12天,共250 μg FSH(Stimufol?,Belgium)以10%的遞減劑量注射6次;第一次注射FSH時,同步注射250 IU PMSG(Reprobiol,New Zealand);第5次FSH注射時,同步注射PG(Reprobiol,New Zealand)150 μg;最后一次注射FSH時去除CIDR;第13天,檢測發情,若母羊已發情,則人工授精2次(間隔12 h);第一次人工授精注射100 IU LH (Reprobiol,New Zealand);第19天,用鹽酸利多卡因麻醉后,通過手術沖洗子宮收集胚胎(圖1)。

圖1 綿羊超數排卵示意圖Figure 1 Schedule of ovine superovulation

1.2.2 血液樣品采集

卵泡刺激素(FSH)注射前(1st,D10)和人工授精前(2nd,D13)采血,保存在真空采血管中。然后12 000 r/min離心10 min,獲得血清。所有血清樣本均保存在液氮中,并立即運送到實驗室進行進一步分析。

1.2.3 代謝物的提取

首先,將樣品和預冷的甲醇通過渦旋混合?；旌虾蟮臉悠吩诒戏趸? min,然后在15000 r/min,4 ℃下離心20 min。用LC-MS級別的水將部分上清液稀釋到含有53%甲醇的最終濃度。然后將樣品轉移到一個帶有0.22 μm過濾器的新離心管中,在15000 r/min、4 ℃下離心20 min。最后,將濾液注入LC-MS/MS系統處理。

1.2.4 LC-MS/MS分析

液相色譜-質譜聯用儀(Liquid Chromatograph Mass Spectrometer,LC-MS/MS)分析由諾禾致源公司處理。

LC-MS/MS分析使用Vanquish UHPLC系統(ThermoFisher)和Orbitrap Q Exactive系列質譜儀(ThermoFishe)進行。樣品被注入Hyperil Gold柱(100×2.1 mm,1.9 μm),使用17 min的線性梯度,流速為0.2 mL/min。正極性模式的洗脫液為洗脫液A(水中0.1%FA)和洗脫液B(甲醇)。負極性模式的洗脫液為洗脫液A(5 mmol/L乙酸銨,pH 9.0)和洗脫液B(甲醇)。溶劑梯度設置:2%B,1.5 min;2%～85%B,3 min;100%B,10 min;100%～2%B,10 min;2%B,12 min。Q Exactive質譜儀在正/負極性模式下運行,噴霧電壓為3.5 kV,毛細管溫度為320 ℃,鞘內氣體流速為35 arb,輔助氣體流速為10 arb。

1.2.5 原始數據分析

使用Compound Discoverer 3.1(CD3.1,Thermo Fisher)對LC-MS/MS產生的原始數據文件進行處理。將峰與mzCloud(https:∥www.mzcloud.org/)和ChemSpider(http:∥www.chemspider.com/)數據庫進行匹配。使用統計軟件R(R-3.4.3版本)、Python(Python 2.7.6版本)和CentOS(CentOS 6.6版本)進行統計分析。

1.2.6 代謝物數據分析

使用HMDB(人類代謝組數據庫,http:∥www.hmdb.ca/)、KEGG(京都基因與基因組百科全書,http:∥www.genome.jp/kegg/)和Lipidmaps(脂質代謝途徑研究計劃,https:∥lipidmaps.org/)數據庫對代謝物進行注釋。利用metaX進行主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)和偏最小二乘法判別分析(Partial Least Squares Discriminant Analysis,PLS-DA),單變量分析(t檢驗)來計算統計學意義(P值)。根據VIP(Variable important in projection,一般變量權重值)>1且P值<0.05,FC(Fold Change,差異倍數)>1.2或FC<0.83條件篩選出的代謝物被認為是差異代謝物。

2 結果與分析

2.1 超數排卵供體黃體及胚胎形態觀察

超數排卵后第19天供體黃體形態如圖2(a)所示,為紅體狀態。E6.5胚胎大部分為桑葚胚,如圖2(b)所示。

(a)超數排卵后第19天供體黃體形態;(b)E6.5胚胎。圖2 超數排卵供體黃體及胚胎形態Figure 2 Donor corpus luteum and embryonic morphology in sheep during multiple ovulation

2.2 代謝物總覽

研究共發現1 158種代謝物,其中,正離子模式下發現721種,負離子模式下437種。使用HMDB和KEGG對其進行注釋分析,共有617種被注釋,其中,正離子模式下350種,負離子模式下267種。正離子模式注釋顯示,代謝種類最多的是脂類和脂類分子(91個代謝物),其次是有機酸及其衍生物(63個代謝物)和有機雜環化合物(22個代謝物)。負離子模式注釋顯示,代謝種類最多的是脂類和脂類分子(81種),其次是有機酸及其衍生物(41種)和苯類(21種)。

2.3 多元統計分析

本研究應用主成分分析(PCA)來確定綿羊超數排卵過程中血清代謝物之間的樣品分離和聚集程度。聚集的點表示觀察到的變量高度相似,離散的點代表觀察到的變量的顯著差異。結果顯示,在正離子模式下,PC1、PC2分別為20.55%和14.04%[圖3(a)];在負離子模式下,PC1、PC2分別為24.02%和16.09%[圖3(b)]。結果表明,綿羊超數排卵前后血清代謝物有明顯的分離,具有不同的代謝物特征。

(a)正離子模式;(b)負離子模式。圖3 綿羊超數排卵中血清代謝物主成分分析(PCA)Figure 3 Principal component analysis of the metabolites in sheep during multiple ovulation

研究采用偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)來確定各組之間的具體差異。在綿羊超數排卵前后血清代謝物的比較中,正離子模式下PLS-DA模型的R2Y為0.94,Q2Y為0.68[圖4(a)];負離子模式下PLS-DA模型的R2Y為0.92,Q2Y為0.70[圖4(b)]。這些結果表明,后續分析可信。

(a)正離子模式;(b)負離子模式。圖4 綿羊超數排卵中血清代謝物偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)Figure 4 PLS-DA score map of the metabolites in sheep duringmultiple ovulation

2.4 差異代謝物分析

根據VIP>1和FC>1.2或FC<0.83和P<0.05篩選,在兩次分析中鑒定出295個差異代謝物(175個為正離子模式,120個為負離子模式)。與1st相比,2nd上調代謝物186種(其中,正離子模式85種,負離子模式101種),下調代謝物共109種(其中,正離子模式90種,負離子模式19種)(圖5)。

(a)正離子模式;(b)負離子模式。圖5 綿羊超數排卵中血清代謝物熱圖Figure 5 Volcano plot results of the metabolites in sheep during multiple ovulation

第一次分析中優勢代謝物含量最高的10種代謝物是2-Oxindole、Dihydroroseoside、4′-(Imidazol-1-yl)acetophenone、Ethyl-D-glucuronide、HQH、Progesterone、N-{4-[(2R,3R)-3-(Hydroxymethyl)-5-oxo-2-morpholinyl]phenyl}acetamide、DNH、2-Furoylglycine和4-decyl-3-hydroxy-5-oxooxolane-2,3-dicarboxylic acid(表1);第二次分析中優勢代謝物含量最高的10種代謝物是11,12-Epoxy-(5Z,8Z,11Z)-icosatrienoic acid、11-Deoxy prostaglandin F2、2-methoxy-3,5-dimethyl-6-[(E)-3-methylundec-2-enyl]pyran-4-one、2-hydroxy-6-[(8Z,11Z)-pentadeca-8,11,14-trien-1-yl]benzoic acid、Eicosapentaenoic acid、SKK、Anacardic acid、FAHFA (17:0/19:2)、FAHFA (17:0/20:3)和16(R)-HETE(表2)。

表1 綿羊超數排卵中外源FSH注射前的血清前10優勢代謝物Table 1 Top 10 dominant metabolites before FSH injection in sheep during multiple ovulation

表2 綿羊超數排卵中人工輸精前的血清前10優勢代謝物Table 2 Top 10 dominant metabolites before artificial insemination in sheep during multiple ovulation

2.5 差異代謝物功能富集分析

KEGG途徑富集顯示,綿羊超數排卵過程中的優勢代謝物分別在正負離子模式下富集到39和49條功能通路(圖6)。正離子模式下富集的途徑包括類固醇激素生物合成、花生四烯酸代謝、膽汁分泌、皮質醇合成和分泌等。負離子模式下的富集途徑包括不飽和脂肪酸生物合成、卟啉和葉綠素代謝、花生四烯酸代謝、脂肪酸生物合成等。

(a)正離子模式;(b)負離子模式。圖6 綿羊超數排卵中血清代謝物富集 KEGG pathwayFigure 6 Metabolites enriched KEGG pathway in sheep during multiple ovulation

3 討論

除生殖激素外,血液中的一些代謝物也與超數排卵過程中卵泡發育和卵子成熟有關。本研究通過FSH注射前與人工授精前的血清代謝組比較,發現295種代謝物在超數排卵過程中發生變化。對其進行功能分析表明,一些代謝物與卵泡成熟相關,具有明顯的生物學功能。

3.1 促進卵泡發育的代謝物

一些代謝物在人工授精前含量較高,可能有助于卵泡的成熟,如類固醇類脫氧皮質酮(Deoxycorticosterone)和皮甾酮(Cortodoxone);磷脂酰膽堿類PC (16∶1E/10∶0)和PC(19∶2/18∶4);不飽和脂肪酸類硬脂炔酸(Octadec-9-ynoic acid)、十八碳烯酸(反-6)(trans-Petroselinic acid)和花生四烯酸(Arachidonic acid)。脫氧皮質酮和皮甾酮主要參與甾體激素的生物合成和皮質醇的合成及分泌。脫氧皮質酮既是一種有效的礦物皮質激素,也是一種糖皮質激素。它能刺激某些魚類[6]和母雞[7]的卵母細胞成熟。對獼猴的研究也發現,在排卵刺激前和受精后6 h,脫氧皮質酮的含量存在差異[8]。而且,顆粒細胞可能在體內從含膽固醇的脂質合成21-羥化酶衍生的礦物皮質激素,通過礦物皮質激素受體介導的事件促進排卵后黃體的形成[9]。在受精時添加脫氧皮質酮或皮甾酮會改變皮質類固醇受體的調節,并加快孵化[10]。與其他研究相似,本研究表明血清中脫氧皮質酮和皮甾酮可能有助于綿羊超數排卵中卵泡的發育。

磷脂酰膽堿(PC)是兩性分子,是生物膜的重要組成部分,在細胞膜的通透性、物質交換、信號傳遞等功能中起重要作用。磷脂酰膽堿的內穩態對細胞的生存和生長很重要。研究發現,細胞內磷脂酰膽堿總量與細胞生長和凋亡相關,與生長呈正相關,與凋亡呈負相關[11]。在磷脂酶的作用下,磷脂酰膽堿可以增加亞油酸的產生。亞油酸氧化代謝產生13-過氧羥基-9,11-十八碳二烯酸(13-HPODE)(13-Hydroperoxy-9,11-octadecadienoic acid),通過參與EGF受體去磷酸化增強表皮生長因子信號轉導[12]。EGF是一種表皮細胞生長因子,可誘導哺乳動物卵巢積云的擴大[13]。此外,復發性流產患者卵泡液中油酸水平降低。油酸可減輕飽和脂肪酸對卵母細胞發育的不良影響[14]。它不僅能調節脂肪酸代謝和細胞內信號,還能降低氧化應激,從而促進卵母細胞和著床前胚胎的發育[15]。硬脂炔酸和十八碳烯酸(反-6)是油酸的重要異構體[16-17]。超數排卵時血清磷脂酰膽堿含量和亞油酸合成增加,提示在此過程中脂質代謝增強。因此,可以利用磷脂酰膽堿、硬脂炔酸和十八碳烯酸(反-6)作為綿羊超數排卵卵泡成熟的血清標志代謝物。

目前已有大量體外實驗表明,不飽和脂肪酸的含量會影響哺乳動物的生殖性狀。飼喂不飽和脂肪酸(油酸和亞油酸)比例較高的飼糧,圍產期奶牛卵泡平均直徑增大;排卵前卵泡內雌激素、雄激素等甾體激素濃度升高[18]。Robinson等[19]發現,當飼喂富含亞油酸(C18:2,ω-6 PUFA)或亞麻酸(C18:3,ω-3 PUFA)的飼糧時,卵巢中卵泡的數量增加。因此,飼糧中添加不飽和脂肪酸[如硬脂炔酸和十八碳烯酸(反-6)]可提高綿羊的超數排卵水平,這可能是提高綿羊繁殖力的一種潛在策略。

花生四烯酸是一種長鏈多不飽和脂肪酸,通過影響類固醇激素和前列腺素的生物合成來調節動物生殖過程[20]?；ㄉ南┧峒捌浯x物是類固醇激素生產調節的限速步驟[21]。膽固醇通過類固醇激素合成的急性調節蛋白(StAR)從線粒體外膜運輸到內膜[22],進一步對StAR啟動子DNA序列的研究表明,5-HPETE增強了StAR啟動子的活性,促進了StAR蛋白的表達,增加了類固醇合成的量[23]。此外,花生四烯酸在一系列酶的作用下可合成多種具有生物活性的PGH 2[22]。這些合成的前列腺素作為內部分泌物從細胞中釋放,并與分布在鄰近靶細胞上的g蛋白偶聯受體結合,以調節基本的生殖過程,包括排卵、卵泡發育、葉黃素溶解和分娩[24-25]。因此,本研究結果提示花生四烯酸和8(R) -羥基二十碳四烯酸[8(R) -hydroxy-eicosatetraenoic acid]是預測卵泡成熟的潛在標志代謝物。

3.2 抑制卵泡發育的代謝物

本研究結果表明,黃體酮在超數排卵中下調。黃體酮在綿羊未成熟卵泡中含量較高,可作為綿羊未成熟卵泡的標記代謝物。黃體酮的主要生理作用是由孕激素受體(PGR)介導的。研究結果表明,黃體酮抑制卵泡生長,至少部分作用是在卵巢內發揮的。卵巢黃體可提高大鼠、猴子[26]和人[1]體內黃體酮的循環水平,進而抑制大卵泡的生長發育。在大鼠中,黃體酮通過抑制垂體分泌的促性腺激素而起作用,促性腺激素是卵泡生長所必需的。在人類和猴子的卵巢中,黃體酮的部分抑制作用可能直接在卵巢內發揮。當黃體酮水平很低且穩定時,黃體生成素的積累和孕激素受體變得敏感。因此,黃體化前黃體酮增加可引起LH和FSH含量迅速增加,繼而排卵[27-28]。相反,如果黃體酮活性持續高于生理觸發水平,則會導致促性腺激素釋放激素受體脫敏,進一步使促性腺激素無法積聚或激增,從而阻礙排卵[29]。此外,黃體酮還能抑制卵巢顆粒細胞有絲分裂和卵巢顆粒細胞的凋亡[30]。這表明黃體酮在維持卵泡數量平衡中起著重要作用,可能會抑制卵泡成熟。

4 結論

研究通過LC-MS/MS非靶向代謝組技術對綿羊超數排卵中血清代謝物進行全面對比分析,結果表明血清中高含量的脫氧皮質酮、磷脂酰膽堿和花生四烯酸可能有助于綿羊超數排卵卵泡的發育。研究結果為超數排卵中卵泡發育調控機制解析提供一定幫助,為超數排卵過程中的營養調控和供體選擇提供參考。