基于網絡和組學方法的產電微生物胞外電子傳遞研究進展

丁德武, 張 鵾, 何小青, 謝建明

(1. 宜春學院數學與計算機科學學院, 宜春 336000;2. 池州學院材料與環境工程學院, 池州 247000;3. 東南大學生物科學與醫學工程學院, 南京 210096;4. 東南大學生物電子學國家重點實驗室, 南京 210096)

厭氧條件下,某些微生物能夠將它們細胞內新陳代謝過程中產生的電子傳遞到細胞外,還原胞外電子被稱為受體并產生能量維持其自身生長。通常,這一過程被稱為胞外電子傳遞(extracellular electron transfer,EET);這些微生物被稱為產電微生物[1]。一般認為,產電微生物的EET過程對地球環境中碳、氮、硫、鐵、錳等元素的循環產生重要影響[2]。EET能力也使產電微生物成為生物電化學系統的重要研究對象,在能源生產、廢水處理、生物修復與化學合成等眾多領域有著廣泛應用[3]。例如,在能源生產方面,產電微生物可以通過與電極相互作用,把電子傳遞到電極上,從而產生電流輸出,即微生物燃料電池(microbial fuel cells,MFC)。Logan等[4]關于同步微生物產電和污水處理的研究實現了清潔電能生產和有機廢棄物處理,使MFC技術成為能源與環境領域的研究熱點。在化學合成領域,Tefft等[5]構造了氫化酶缺失型希瓦氏菌ShewanellaoneidensisMR-1,并利用其天然的Mtr蛋白和外源性光驅動質子泵積累NADH(還原型輔酶I),能夠由丙酮合成極具應用價值的2,3-丁二醇。

然而,產電微生物的EET效率通常較低,這已經成為限制產電微生物應用技術研究和發展的瓶頸[6-7]。當前,研究人員已經從遺傳學、電化學、生理生態學和基因組學等方面深入解析了希瓦氏菌和地桿菌兩個菌屬的產電微生物與電子傳遞相關的基礎理論問題[8-9]。隨著越來越多的產電微生物被發現,從生物信息學角度開展產電微生物EET機制的理論研究,揭示產電微生物的EET過程及其調控機制,已經成為研究和發展產電微生物應用技術的一個關鍵環節[10]。

1 生物網絡

一般認為,生物體內的各種生物分子(如:基因、蛋白、代謝物)通過它們之間的相互作用(如:轉錄調控、蛋白互作、代謝反應)完成各種生物學功能。這些相互作用的總體構成各類生物網絡,如:調控網絡、蛋白網絡、代謝網絡等[11]。目前,研究人員已經通過蛋白網絡、調控網絡與整合網絡等多種生物網絡模型對產電微生物的EET過程開展了系列研究。

1.1 多樣化的電子傳遞分子

研究表明,多種分子參與產電微生物的EET過程。從內膜通過周質、外膜到細胞外部空間,產電微生物可以通過細胞色素c和外膜的孔蛋白等多種蛋白質形成EET途徑完成EET過程[圖1 (a)][12-13]。除了使用“孔蛋白-細胞色素c”形成主干EET途徑,產電微生物還會使用其他細胞色素c與電子傳遞蛋白輔助這些EET途徑。Edwards等[14]通過中子小角散射實驗研究希瓦氏菌S.oneidensisMR-1中跨膜復合物MtrCAB的分子結構,發現MtrCAB與細胞周質的細胞色素cSTC之間的直接相互作用,揭示STC可以作為氧化還原伴侶來輔助MtrCAB途徑的周質電子傳遞過程。Malvankar等[15]使用靜電力顯微鏡觀察到地桿菌導電性菌毛中的電荷傳遞,Wegener等[16]報道硫酸鹽還原菌HotSeep-1在與厭氧甲烷氧化古菌ANME-1共培養時也會產生類似的導電性菌毛。研究人員發現多種微生物都具有這樣的導電性菌毛[17]。Wang等[18]建立分辨率為0.37 nm的“納米導線”原子模型,他們發現細胞色素c廣泛分布在其中起到關鍵的電子傳遞作用[圖1 (b)] 。多種電子介體均可參與介導細胞表面的電子傳遞過程[圖1 (c)][19]。Light等[20]發現一個胞外還原酶家族蛋白,論證它能夠通過一個保守的黃素化序列模體介導外膜與胞外電子介體之間的電子傳遞過程。

產電微生物首先通過EET途徑將細胞質內產生的電子傳遞到細胞的外膜表面,然后電子進一步從外膜的細胞色素c傳遞到胞外電子受體。(a)外膜細胞色素c的直接接觸[12-13];(b)細胞外膜和周質的延伸(原先的“納米導線”)[15-18];(c)兩種電子介體相關的機制:黃素-細胞色素復合物和電子穿梭體[19]。 MtrA:周質細胞色素c;MtrB:外膜孔蛋白;MtrC和OmcA:外膜細胞色素c。圖1 幾種典型的電子傳遞機制Figure 1 Several typical electron transfer mechanisms

產電微生物中的某些EET分子還具有豐富的基因多樣性。例如:希瓦氏菌S.oneidensisMR-1中僅細胞色素c基因就有41個,地桿菌GeobactersulfurreducensPCA則達到110多個[21]。這意味著產電微生物可能會在不同的環境下表達不同的細胞色素c基因,構成不同的EET途徑。鑒于細胞內的生物分子需要通過與分子的相互作用來執行它們的功能,分子網絡研究往往有助于從整體上理解基因和蛋白的功能;此類研究可用于識別重要基因、預測蛋白功能、挖掘與特定生物學途徑相關的功能模塊等[22]。因而,可以通過生物網絡模型的構建和分析來研究EET過程。目前國內外關于EET分子網絡的研究已有一些階段性的成果。

1.2 蛋白網絡

Zhang等[23]報道了一個包含18個蛋白的小尺度網絡,研究OmcA和MtrC等重要EET蛋白之間的相互作用。Sturm等[24]描繪了一個動態的周質電子傳遞網絡,發現某些周質細胞色素c可以通過高頻率的瞬時蛋白相互作用促進電子傳遞;他們還發現周質的電子傳遞過程涉及為特定的電子受體分配特異的EET蛋白。Alves等[25]通過對多種細胞色素相互作用網絡的分析,發現小四倍體細胞色素STC在S.oneidensisMR-1的厭氧呼吸代謝中起核心作用,對維持S.oneidensisMR-1多功能厭氧代謝的周質氧化還原網絡有較大幫助。Li等[26]研究了不同電位對地桿菌G.sulfurreducens新陳代謝和胞外呼吸的影響,發現它們也是通過多種EET蛋白的差異表達來調整不同條件下的EET過程。Ding等[27-28]構建了產電微生物希瓦氏菌S.oneidensisMR-1的基因組尺度細胞色素c相互作用網絡,不僅通過網絡中心化分析識別一些關鍵的細胞色素c,還結合網絡模塊分析與亞細胞定位信息推斷出潛在EET途徑,并使用基因表達數據進行確認。隨后,進一步擴展了上述細胞色素c網絡,構建了一個電子傳遞網絡并探討了它的形成及其中蘊含的EET機制,也從網絡中識別出一些可以用來促進細胞周質電子傳遞過程的細胞色素c。它們大多具有較多的無序蛋白區域,容易形成高頻的瞬時相互作用來促進細胞周質的電子傳遞過程。此外,Ding等[29]還通過對“活躍”蛋白質網絡的分析,識別了產電微生物S.oneidensisMR-1中兩個與電子傳遞相關的重要功能模塊:一個多血紅素細胞色素c模塊和一個信號處理模塊,并討論了其中的關鍵蛋白以及它們在EET過程中發揮的作用。

綜上,研究表明產電微生物能夠通過電子傳遞蛋白構成的網絡維持其自身的EET過程,網絡的核心與外圍分別負責不同的電子傳遞功能。

1.3 調控網絡

生物體內所有轉錄調控關系的總體構成調控網絡[11]。Leang等[30]研究了硫還原地桿菌G.sulfurreducens中RNA聚合酶σ因子RpoN在基因表達調控中的作用,建立RpoN調控模塊。Luo等[31]在綠膿桿菌P.aeruginosaPAO1中引入外源性全局調控因子IrrE,發現新菌株的功率密度比對照株高出71%,論證以細胞調控網絡為靶點可以有效提高產電微生物的EET效率。Li等[32]設計一個基于群感效應的種群狀態決策系統,對幾條EET途徑分別重編程后,菌株的電流輸出和污染物處理能力均有所提升;同時重編程由其中3條途徑組成的“小型EET網絡”則能達到更好的效果。Ding等[33]也通過對希瓦氏菌中與EET途徑相關轉錄調控模塊的構建與分析,識別出一些在EET基因的轉錄調控過程中發揮重要作用的信號蛋白質,并通過對這些信號蛋白以及它們作用伴侶的深入分析,研究信號蛋白在轉錄調控模塊中發揮的作用以及它們對EET過程的影響。

1.4 整合網絡

Raanan等[34]通過對氧化還原酶的結構相似性分析,確定一組基本的電子轉移單元,主要包括:細菌鐵氧還蛋白、細胞色素c、異丙菊酯和質體藍蛋白型的折疊單元,構建由這些基本電子轉移單元組成的空間鄰接網絡(SPAN),進而從SPAN的角度探討電子傳遞鏈的拓撲結構以及它們的形成與演化;這種整合蛋白結構信息的網絡模型為研究EET途徑提供獨特見解。Ding等[35]也通過對13種希瓦氏菌的整合轉錄調控和蛋白交互網絡的構建與分析,識別了整合生物網絡中的保守混合網絡模體,發現了一種稱為“共調控PPI”的高保守網絡模體,建立它們和蛋白質的“提前準備”合成模式之間的關聯,用于識別細胞為迅速響應環境的變化而需要提前合成的重要蛋白質。

2 組學方法

高通量技術的發展和越來越多產電微生物組學數據的出現使得人們可以從多個不同的層面來研究產電微生物的EET過程。通過對各種組學數據的分析,可以篩選在不同條件下顯著差異表達的基因,進而挖掘與產電功能密切相關的EET基因。目前,研究人員已經從基因組、轉錄組、蛋白組等各種組學數據的角度對此類問題開展了大量研究。

2.1 基因組學

Kracher等[36]分析了97個真菌基因組,通過結合基因組數據和生物化學方法,闡明了3種與纖維素降解相關的EET系統的相對重要性以及它們與真菌生活方式之間的關系。采用比較基因組學的方法,Butler等[37]分析了Geobacter屬的不同菌種在胞外電子傳遞過程中的差異。結果表明,KN400株中電子轉移速率的增加和EET性能的改善是因為氧化途徑中碳通量的變化和ATP代謝的變化,兩種情況都會影響細胞色素c的折疊、定位和氧化還原電位。Leyn等[38]也通過比較基因組學方法識別了大腸桿菌和希瓦氏菌中的21個代謝相關的轉錄因子,根據代謝功能對它們進行了分類,并具體討論了ArgR、TyrR、TrpR、HutC和HypR等轉錄因子。最近,Chadwick等[39]比較了39個厭氧甲烷氧化菌基因組,識別了保守的多血紅素細胞色素c和生物能復合物,發現由MHC-A、MHC-B、MHC-C、HdrABC和MvhADG等蛋白質及其復合物參與的電子分岔途徑。

2.2 轉錄組學

Embree等[40]利用野生型和fur突變株在不同鐵濃度下的基因表達水平,研究G.sulfurreducens的轉錄因子Fur在協調Fe(II)氧化和Fe(III)還原過程中的調節作用,結果發現不同鐵濃度下細胞色素c基因的表達水平有很大的差異。當鐵濃度較高時,OmcZ這類多血紅素細胞色素c發揮重要作用;而當鐵濃度降低時,GSU3274等少血紅素細胞色素c則變得重要起來。Barchinger等[41]使用RNA-Seq數據,分析希瓦氏菌S.oneidensisMR-1在厭氧條件下的差異表達,并從中識別促進EET過程的基因集。黃建福[42]分析不同培養環境下S.oneidensisMR-1的轉錄組數據,發現在鐵硫環境下該菌鐵還原代謝通路上的基因表達水平有所提升,得出鐵硫環境能提高EET效率的結論。

2.3 蛋白組學

Yun等[43]使用凝膠分離和質譜分析等蛋白組學技術,識別了在鈾生物修復過程中發揮重要作用的細胞色素c(GscA),其功能與硫還原地桿菌G.sulfurreducens中的OmcS類似,即通過與導電性菌毛協調作用促進電子的傳遞。Kavanagh等[44]則采用比較蛋白質組學分析了G.sulfurreducens在電子受體改變時的主要生理變化,論證幾類分泌系統在長程電子傳遞過程中發揮的作用。Grobbler等[45]使用定量蛋白質組學對細胞變化進行分析,發現S.oneidensisMR-1電子傳遞蛋白的豐度隨電極電位的不同而不同。在前述活躍蛋白質網絡的分析中,我們也使用蛋白質組數據,分析了希瓦氏菌S.oneidensisMR-1在不同條件下的差異表達,進而從中識別一些可以促進EET過程的蛋白質[29]。

2.4 整合多組學

生命體是一個多層次、多功能的復雜結構體。多種組學數據間既相互關聯又各有側重,例如:轉錄組數據主要提供細胞中基因轉錄的情況及轉錄調控規律,蛋白組數據能夠用于理解細胞的翻譯調控策略。因而,聯合多組學數據分析能夠提供更全面的信息。Taylor等[46]通過組合轉錄組和蛋白組數據,研究了希瓦氏菌S.oneidensisMR-1在不同氧氣情況下各基因的mRNA與相應蛋白質的表達水平,討論了蛋白質翻譯效率的變化情況及其對調節細菌蛋白質表達水平的影響。Qiu等[47]通過整合多組學數據構建了硫還原地桿菌的σ因子調控網絡,揭示了模塊化調控單元之間的多層次相互作用及其對能量代謝與EET過程的協調調控。

2.5 宏組學

通過組合EET活性微生物群落對不同電子受體和電子供體條件下的代謝和轉錄響應,Ishii等[48]識別了Geobacter/Pelobacter中的關鍵代謝基因,附屬物/轉運蛋白基因和多血紅素的細胞色素c基因等。Ni等[49]通過宏轉錄組測序分析了用于硫氰酸鹽降解的微生物燃料電池中陽極的微生物群落,結果表明硫氰酸鹽的降解主要是通過氰酸鹽降解途徑完成的,為硫氰酸鹽降解與EET過程的耦合提供了證據。Meier等[50]也通過宏基因組學和宏蛋白組學技術分析了微生物對金屬硫化物的氧化作用,硫還原硝化螺旋菌門Nitrospirae和硫氧化的伽馬變形菌綱Gammaprotebacteria等細菌分支的潛在生活方式。他們的宏蛋白組數據分析結果表明這些細菌主要是通過EET過程來促進金屬硫化物的溶解。楊洋[51]結合宏基因組學、單細胞基因組學和宏蛋白組學方法,發現了在低溫下生物膜的基礎代謝依舊保持活躍,但在次優條件下氧化代謝反應受到抑制并會影響EET速率。

3 整合組學數據到生物網絡

如前所述,國內外已有一些利用各種網絡方法和組學數據研究產電微生物EET過程的工作,但大多主要關注某一類網絡模型,或者一兩種組學數據,很少將網絡模型與組學數據結合起來。目前,生物網絡和多組學數據的整合分析已在醫藥疾病等多個領域取得了重要進展[52-53]。受此啟發,我們也初步嘗試了將組學數據整合到生物網絡中研究產電微生物的EET過程。

首先,通過對全基因組共適應度數據和蛋白網絡的整合分析,識別了產電微生物S.oneidensisMR-1中可用于響應多種不同環境條件的一些重要EET基因,如:ScyA (SO0264)、PetC(SO0610)、CcoP (SO2361)、CcoO (SO2363)和CytcB (SO4666)等。對現有文獻中較少報道的CytcB,通過對其三維結構、亞細胞定位和無序區域的分析,預測了它能夠用于介導細胞周質的電子傳遞過程[54]。此外,確定了不同細胞色素c的高共適應基因,發現其中富集了大量的信號轉導蛋白,論證了不同細胞色素c的協調利用以及信號蛋白質與細胞色素c之間的合作,并識別了一個參與對CymA調控的信號蛋白質[55]。

其次,整合了S.oneidensisMR-1的轉錄組、蛋白組和蛋白網絡等數據,分析了EET過程激活前后蛋白質翻譯效率的變化,發現差異翻譯的蛋白質往往具有較高的網絡連接度。進而,構建了差異翻譯蛋白形成的子網絡,分析了其中的功能模塊和調控單元,討論了差異翻譯對EET過程的影響。還發現位于同一個操縱子上基因的翻譯效率往往不會全部上調或全部下調。在此基礎上,識別了參與EET過程的關鍵基因(如:尿卟啉原脫羧酶HemE)與基因簇(如:argBFGH、lldEFG、mtrCAB、thrABC、csgEFG等),并從蛋白翻譯效率的角度探討了EET過程相關轉錄調控和蛋白互作的協調作用[56]。

4 總結與展望

當前,研究人員已經通過網絡方法與組學方法開展了產電微生物EET過程的系列研究,在基因功能分析、關鍵分子識別、網絡模塊挖掘與生物學途徑推斷等方面均取得了一定的成績。這些理論研究也具有非常重要的實際應用價值,例如:可以通過EET機制的研究鑒定關鍵的EET分子,進而通過基因工程技術改造產電微生物,提高它們的電子傳遞效率,優化生物電化學裝置(如MFC)的性能與效率。文章從生物信息學角度,系統總結使用網絡方法與組學方法研究產電微生物的胞外電子傳遞等相關方面的工作,表1簡要分類概括了本文介紹的相關工作。

表1 產電微生物胞外電子傳遞研究的網絡與組學研究工作Table 1 Network and omics works on studying extracellular electron transfer in electricigens

然而,當前的整合研究尚未完全建立不同類型的分子特征和網絡中對應元素類型之間的直接聯系。以轉錄網絡為例,靶基因的表達(mRNA水平)會受到轉錄因子的調控,而轉錄因子活性又受到與它相互作用的蛋白質的影響;因而,網絡中的轉錄因子及其靶基因需要分別和蛋白質豐度與mRNA水平關聯起來。因此,未來需要整合多種生物網絡和多種組學數據一起開展產電微生物EET過程的理論研究工作,進一步為相關的實驗研究提供科學線索。