基于網絡藥理學和分子對接探討黃花柳抗氧化作用機制研究

熱吾扎·木哈買提，努爾阿米乃·麥麥提

（新疆師范大學 生命科學學院 新疆特殊環境物種保護與調控生物實驗室 新疆特殊環境物種多樣性應用與調控重點實驗室 干旱區植物逆境生物學實驗室，新疆 烏魯木齊 830017）

自由基是機體氧化反應的產物，具有強氧化性，可損害機體的組織和細胞，進而引起慢性疾病及衰老效應。在正常情況下，生物體的抗氧化系統會保持自由基的動態平衡。然而，一旦平衡被打破，過量積累的自由基就會攻擊身體的正常細胞，導致氧化應激［1］。氧化應激與一些人類疾病有密切的關系，例如癌癥、自身免疫性疾病、年齡相關疾病、白內障、類風濕性關節炎、心血管和神經退行性疾病等［2］。研究表明，抗氧化劑可以減輕氧化應激造成的傷害，其中天然抗氧化劑因其無毒副作用而深受青睞。近年來，在藥用植物中不斷發現具有較強抗氧化活性的組分和單體，其在防治氧化應激相關疾病中發揮著重要作用［3-5］。

黃花柳（Salixcaprea）別名為山羊柳、絨絮柳、歐洲絨絮柳、大黃華柳。在黃花柳化學成分的研究中分離得到了多種化合物，以黃酮類化合物為主，還包括萜類化合物、甾體類化合物、鞣質類化合物、酚苷類化合物等黃花柳的根、皮、葉和花，這些在新疆很早就被當作藥材使用?，F如今采其花、葉做藥用，黃花柳花作為新疆特有的中藥材，具有消熱、消腫止痛、抗菌、補腦補心等功效以及較強的抗腫瘤作用［6-7］，但相關的作用機制需要進一步探討。

中藥網絡藥理學是將中藥和網絡藥理學相結合的一個新興方法，是基于網絡構建、網絡分析和網絡驗證來揭示中藥在分子水平上的作用機理［8］，為疾病的藥物治療提供了新的研究策略和方法。本研究采用網絡藥理學與分子對接技術，揭示了黃花柳抗氧化作用機制，為黃花柳臨床應用及深入研究其藥理作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 黃花柳活性成分的收集

在PubMed、中國知網、維普以及萬方數據服務平臺等數據庫，收集黃花柳中已發現的化合物。通過PubChem［9］查找已發現成分的二維化學結構數據，保存為sdf 格式。PubChem 未收錄結構的化合物，根據文獻報道的結構式用ChemDraw Professional 15.0畫出2D結構，也保存為sdf 格式。

1.2 黃花柳潛在作用靶點的預測與篩選

將活性成分以sdf 格式文件導入SwissTargetPrediction［10-11］數據庫進行分析，得到化合物靶點信息。將得到的化合物靶點信息導入UniProt數據庫中，選擇物種為“Homo sapiens”，對其進行批量標準化，并下載基因。

通過在GeneCards［12］和OMIM［13］數據庫中輸入“anti-oxidant”搜索已報道與抗氧化相關的基因，刪去重復基因，與上述潛在作用靶點進行匹配分析，使用Venny 2.1 繪圖軟件將預測的疾病靶點與藥物靶點進行映射，獲得活性成分抗氧化的潛在作用靶點。再將獲得的黃花柳活性成分與靶點信息通過Cytoscape 3.9.1［14］軟件構建黃花柳抗氧化成分的靶點網絡。

1.3 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡的構建

為了研究黃花柳抗氧化靶蛋白之間的相互作用關系，將所得到的交集靶點導入在線STRING11.5［15］，物種設定為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設為“high confidence（0.7）”，其他條件保持默認設置進行操作，并構建PPI 網絡模型。將相關數據輸入到Cytoscape3.9.1 軟件，構建黃花柳抗氧化作用靶點蛋白-蛋白相互作用網絡。

1.4 GO功能富集分析與KEGG信號通路富集分析

作用靶點導入DAVID［16］數據庫，Select Identifier 設置為official gene symbol，List Type 設置為gene list，物種、背景均限定為人，對作用靶點進行GO 和KEGG 通路分析，設定閾值P＜0.05，保存結果。根據P 值大小，篩選排名靠前的生物過程或通路。使用Cytoscape 3.9.1 構建“活性成分-靶點-通路”網絡圖并進行拓撲分析，篩選出黃花柳的核心成分及核心靶點。

1.5 分子對接

對選取度（Degree）值排名靠前的核心靶點和成分進行分子對接。從PubChem 和RCSB PDB［17］數據庫分別獲取小分子和大分子的pdp 格式，并應用AutoDock Tools 1.5.7［18］軟件轉換為pdbqt 格式后進行分子對接。通過Pymol 2.2.6［19］軟件針對對接得分較高的靶蛋白與化合物進行分子對接可視化分析。

2 結果

2.1 黃花柳活性成分的篩選

本研究通過文獻檢索，共收集到黃花柳21種活性成分（表1），分別為香草酸、對羥基內桂醇、芥子醇、柚皮素、二氫楊梅素、紫元英苷、異鼠李素、香葉木素等21種活性成分［20-22］，結構如圖1所示。

圖1 黃花柳21種活性成分化學結構圖

表1 黃花柳活性成分

2.2 黃花柳活性成分-抗氧化作用靶點預測

將SwissTarget Prediction 數據庫得到的所有靶點中刪除重復并無法獲取基因名的蛋白，整合后得到21種活性成分靶點320個，由GeneCards、OMIN 數據庫檢索整合得到抗氧化靶點1056個，將活性成分對應靶點與抗氧化相關靶點取交集得到活性成分-疾病靶點118個（圖2）。

圖2 黃花柳活性成分抗氧化靶點韋恩圖

2.3 活性成分-作用靶點網絡構建

采用Cytoscape 3.9.1 構建成分-靶點網絡，其中不同形狀的節點分別代表活性成分和抗氧化相關靶點，邊代表活性成分和作用靶點相互作用關系，整個網絡中有21個成分，118個靶點，共141個節點，節點之間形成368條邊（圖3）。AKR1B1、NOX4、ALOX5、XDH、NQO2、SRC、PTGS2、CD38等可能是黃花柳作用的重要靶蛋白。

圖3 活性成分-抗氧化靶點網絡圖

2.4 PPI網絡構建與分析

利用STRING 數據庫和Cytoscape 軟件得到靶點相互作用網絡圖（圖4）。圖中包括266 條邊線、41 個節點。節點越大表示該靶點選取度越大，說明該節點在網絡中具有重要的作用。在該網絡中排前十位的核心基因依次為AKT1、SRC、EGFR、MAPK3、VEGFA等靶蛋白，且與其他蛋白關系密切。

圖4 活性成分作用靶點PPI網絡圖

2.5 GO功能富集分析

利用DAVID 數據庫對篩選得到的關鍵靶點進行GO 功能富集分析，設置閾值P＜0.05.研究相關靶點的生物學過程（BP）、細胞組成（CC）和分子功能（MF），根據P 值大小選出前10個條目作圖（圖5）。富集度較高的生物學過程主要涉及凋亡過程的負調節、基因表達的負調節、對乙醇的反應、對藥物的反應、對RNA 聚合酶II 啟動子轉錄的正調節、對異生素刺激的反應等。細胞組成中富集度較高的條目主要包括細胞質、大分子復合體、膜筏等。同時黃花柳抗氧化作用與RNA 聚合酶II 轉錄因子活性、酶結、3 鋅離子結合、內肽酶活性、序列特異性DNA 結合、氧化還原酶活性等分子功能密切相關。上述結果表明黃花柳化合物可通過調控多種生物學途徑發揮抗氧化作用。

圖5 GO功能富集分析

2.6 KEGG信號通路富集分析

將篩選得到的63個抗氧化靶點輸入到DAVID 數據庫中，設置P＜0.05，這些靶點可富集到146條信號通路中，其中跟抗氧化密切相關的前20條信號通路如圖6所示。主要包括癌癥通路、內分泌耐藥、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號通路、催乳素信號通路、FoxO 信號通路、松弛素信號通路、HIF-1信號通路、IL-17信號通路、PI3K-Akt 信號通路、VEGF 信號通路等。結果表明，黃花柳發揮抗氧化作用的靶點分布在多條通路中。

圖6 KEGG信號通路富集分析

2.7 黃花柳“活性成分-靶點-通路”網絡圖構建

將關鍵靶點及其相關的活性成分與前20 條通路及其相關靶點導入Cytoscape 3.9.1 軟件，得到“活性成分-關鍵靶點-通路”網絡圖（圖7）。該網絡圖中有96個節點（包括21個成分、55個靶點、20條通路）和487條邊，其中V 形節點代表通路，長邊形代表靶點，圓形代表黃花柳活性成分。選取度值較高的核心靶點為AKT1、MAPK3、PIK3CA、HRAS、EGFR、TNF 等。選取度較高的關鍵成分為柚皮素、9，10-裂-9，19-環羊毛甾烷三萜、香葉木素、二氫楊梅素、槲皮素等。這些靶點和成分是黃花柳發揮抗氧化作用的關鍵靶點和成分。

圖7 “活性成分-靶點-通路”網絡圖

2.8 分子對接結果

驗證預測靶點的可靠性，采用分子對接技術驗證了排名前五的柚皮素、9，10-裂-9，19-環羊毛甾烷三萜、二氫楊梅素、香葉木素、槲皮素與6個富集于抗氧化相關的信號通路中核心基因（AKT1、EGFR、PIK3CA、MAPK3、HRAS、TNF）之間的相互作用（表2）。一般認為結合自由能越小，配體與受體結合越穩定。絕對值＞4.25表示小分子具有一定的結合活性，絕對值＞5.0表示具有較好的結合活性，絕對值＞7.0表示具有強烈的結合活性［20］。因此，選取結合效果最好的六組對接結果進行Pymol可視化處理，結果如圖8所示。

圖8 主要活性成分與核心靶點分子對接模式圖

表2 黃花柳主要活性成分與核心靶點結合能

3 討論

細胞無法充分消除氧化反應產生的過量自由基時，就會產生氧化應激。這種有害過程會嚴重改變細胞膜和其他結構，如蛋白質、脂質、脂蛋白和脫氧核糖核酸（DNA）［24］。因此，通過抗氧化途徑減輕自由基帶來的氧化損傷，是抗氧化藥物的重要作用機制。

文章通過網絡藥理學方法預測黃花柳活性成分靶點，并得到與抗氧化相關靶點的交集靶點，并構建活性成分-疾病靶點網絡，通過蛋白之間相互作用的分析，篩選得到核心靶點。通過GO 分析和KEGG 分析找出涉及抗氧化的主要通路，并構建成分-靶點-通路網絡，最終將抗氧化的6個靶點蛋白與核心成分進行分子對接分析，從而得到黃花柳抗氧化的主要通路、核心成分和核心靶點。

本次研究結果表明，黃花柳抗氧化作用的主要成分可能為柚皮素、9，10-裂-9，19-環羊毛甾烷三萜、二氫楊梅素、香葉木素、槲皮素。柚皮素是二氫黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、免疫調節、抗腫瘤等多種藥理作用。它具有清除自由基，抑制煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶、環氧合酶、脂氧合酶、黃嘌呤氧化酶和金屬離子螯合等促氧化酶活性的作用［25］。9，10-裂-9，19-環羊毛甾烷三萜是Tantry 等人［21］在黃花柳花提取物的氯仿部位獲取得到的新化合物，其藥理作用需要進一步研究。二氫楊梅素是黃酮類化合物，具有解酒保肝、抗病原微生物、抗氧化、抗炎、調血脂及抗腫瘤等多方面的藥理作用［26］。二氫楊梅素有助于減少體力疲勞小鼠的代謝物積累，可能通過激活肌肉AMPK 能量信號通路和肝臟Nrf2、PPARα 相關抗氧化通路發揮抗疲勞作用［27］。香葉木素是黃酮類化合物，具有抗氧化作用。實驗驗證發現，香葉木素能夠干預對乙酰氨基酚誘導的C57BL/6J 小鼠急性肝臟損傷以及人非腫瘤性肝細胞，進而激活Nrf2 信號通路，引起下游相關基因SOD2、G6pdx、NQO1顯著上升，同時LO2細胞活力恢復且GSH含量增加，表明香葉木素的抗氧化作用跟Nrf2/抗氧化反應元件信號通路的活化有關［28］。槲皮素是類黃酮化合物，具有預防癌變、延緩衰老、保護心血管和神經系統等作用，與其較強的抗氧化功能密不可分。槲皮素通過維持氧化平衡表達其抗氧化活性，主要表現為清除氧自由基、整合金屬離子、抑制ox-LDL 引起的氧化損傷及提高抗氧化酶活性，通過調節信號通路和影響基因表達過程，在細胞和動物模型以及人體中發揮抗氧化作用［29］。

在黃花柳抗氧化作用靶點網絡中，AKT1、MAPK3、PIK3CA、HRAS、EGFR、TNF 等6 個靶點的連接度較高，屬于該網絡的核心節點，是黃花柳抗氧化作用的關鍵靶點。AKT1 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是細胞生長和存活過程的關鍵介質，包括葡萄糖代謝、凋亡、轉錄、細胞增殖和遷移［30］。MAPK3 是細胞外蛋白調節激酶（Extracellular Regulated protein Kinases，ERK）的一種亞基，又稱ERK 1，屬于一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞內外信息傳遞的重要使者之一。細胞外的刺激信號，如生長因子、細胞因子、G 蛋白偶聯受體或機體缺血缺氧等，均可激活MAPK3，促使MAPK3 磷酸化并向細胞內轉移，同時激活下游信號通路，將信號從細胞膜表面傳導至細胞核［31］。PIK3CA 是一個關鍵原癌基因，它位于3號染色體上，共有20個外顯子。從信號通路來看，PIK3CA 基因屬于PI3K-Akt信號通路，它的主要職責是編碼p110α蛋白。PIK3CA 基因突變，會使PI3K 酶處于持續激活狀態，增強細胞內信號的傳導，導致所有通路的紊亂，引起一系列疾病，包括自身免疫性疾病、癌癥、造血型疾病和神經病變等［32］。作為RAS 基因家族成員之一的HRAS，負責其突變后蛋白過度活化，調控細胞的生長和分裂，導致Ras/MAPK 通路發生異常，細胞生長、增殖或細胞死亡失控［33］。EGFR 是HER 家族的成員之一，是一種具有酪氨酸激酶活性的跨細胞膜受體糖蛋白。EGFR 廣泛存在于體內多種組織中，以胃腸道、上皮為多，它有利于燒傷后受損的皮膚和胃腸道黏膜屏障的修復［34］。TNF 是一種既能通過激活免疫系統發揮抗腫瘤作用，又能直接殺死腫瘤細胞的細胞因子?？梢砸种颇[瘤細胞的營養供給而使其壞死［35］。

由KEGG富集分析可知，抗氧化靶點主要富集于癌癥通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號通路、催乳素信號通路、FoxO 信號通路、松弛素信號通路、HIF-1 信號通路、IL-17 信號通路、PI3K-Akt 信號通路等。其中FoxO 信號通路參與多種代謝過程，包括能量代謝、細胞凋亡、DNA 修復和氧化應激等。FoxO 信號通路可以改善由多種刺激產生的氧化應激，包括氧化劑、炎性細胞因子和紫外線［36］。HIF-1是細胞適應低氧環境的重要調節因子。HIF-1 是低氧環境下的氧調節型α 亞基與組成型β 亞基形成的穩定的異二聚體，其促進腫瘤血管生成、上調并激活基質金屬蛋白酶及賴氨酸氧化酶等細胞因子及信號通路、誘導特異性微RNA 生成，參與多種惡性腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移等相關生物學行為［37］。PI3K-Akt信號通路是機體抵抗氧化應激的通路之一。PI3K-Akt 信號通路作用于核因子紅細胞相關因子2（Nrf2）能夠使細胞免受氧化應激和炎癥反應的損害。

本研究使用網絡藥理學方法預測了黃花柳發揮抗氧化作用的可能藥物成分、靶點以及通路，并通過分子對接驗證了活性成分與抗氧化核心靶點的對接活性，驗證了黃花柳通過“多成分-多靶點-多通路”的作用方式抗氧化。但受限于數據庫的完整性、時效性等條件，本研究還需要進行進一步的實驗驗證，為臨床開發新的藥物提供更為充分的理論依據和指導。