儲藏對稻谷代謝產物的影響研究

程曉雨, 盛亞男, 馮玉超, 王長遠,2

(黑龍江八一農墾大學食品學院1,大慶 163319) (國家雜糧工程技術研究中心2,大慶 163319)

稻谷作物是中國乃至全世界種植廣泛的主要谷物之一,是目前全世界一半以上人口消費的主食。稻谷的品質除自身的遺傳因素影響外,其生長、生產以及流通過程也會對其造成影響。盡管少部分稻谷作物被用作食品原料和飼料成分,但大部分仍用作米飯食用,這種使用方式導致需要對稻谷在不同時期內進行儲藏。而在市場流通中,新米因其優良的營養品質和味道,深受消費者喜愛,而新米從稻谷收割到加工成為大米在市場流通之前,要對收割的稻谷進行儲藏,這個過程中稻谷的代謝活動仍在進行,因此稻谷會發生陳化[1],儲藏時間越長,陳化現象越嚴重,所以新米會變成陳米,相應地其品質也會不可避免地發生劣變[2]。稻谷中含有豐富的淀粉[3]、氨基酸[4]和蛋白質[5-7]等營養物質,而儲藏過程中,稻谷中的淀粉、脂肪及蛋白質會發生分解、氧化等物理、化學變化,從而影響大米的食味品質[8-10]。Bolting等[11]發現陳化米的蛋白含量要低于新米,與此同時新米的米飯口感優于陳米,通過研究蛋白質的一級結構在儲存期間的變化,推測儲藏期間起到作用的物質之一是米粒外面的蛋白質。研究指出稻米的米糠外層在儲存過程中直接暴露在外部環境中,則儲藏過程中敏感脂質會發生變化[12]。代謝產物是植物應對外界環境變化產生應答的終端產物,環境不同,代謝途徑及產物也不盡相同[13,14]。儲藏過程中稻谷籽粒內的代謝仍然持續進行,儲藏環境與生長環境存在很大差異,故生長過程中形成的優良品質在儲藏過程中將會隨著稻谷籽粒代謝的變化而發生一定的改變,從而影響其品質。

代謝組學是對生物樣品中所有低分子質量分子(代謝物)進行定性和定量研究的學科,包括氨基酸、脂肪酸、碳水化合物、維生素和脂類等[15,16]。代謝組學近年迅速發展,在生物技術和農業以及營養食品科學[17,18]等多個研究領域已經變得越來越重要[19]。目前,對于稻谷儲藏的研究主要有兩大方向,一是研究儲藏對稻米中蛋白質、脂肪酸等大類成分含量的變化探究儲藏對品質的影響[20,21],二是調節儲藏條件盡可能延緩稻米品質劣變[22-25]。除此外還有對儲藏過程中稻米揮發物變化研究的報道[26]。但目前利用代謝組學的手段對儲藏后稻谷代謝產物變化的研究較少,通過對儲藏前后代謝產物的定性定量,不僅可以將稻谷籽粒各類物質的變化具體化,還可以篩選出儲藏影響的關鍵代謝通路及關鍵物質,反映出機體代謝的動態變化,將有助于新米變陳米過程中稻米品質變化的機理研究。

故本研究基于GC-MS[27]的代謝組學平臺,對查哈陽地區2021年稻谷樣本以及儲藏1年后的2021年稻谷樣本進行代謝組學分析,對代謝物進行定性和定量,并從內源代謝物的角度分析儲藏期內稻谷代謝產物的變化情況,應用PCA、OPLS-DA等多元統計分析方法,結合層次聚類分析以及代謝通路分析方法,探討儲藏引起的稻谷品質變化的內在機理,以便于對稻谷在儲藏過程中產生的品質變化進行可視化監控,保證其營養價值,同時可為稻谷的儲藏與品質監測以及優化稻谷儲藏條件、延長稻谷儲藏期提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

稻谷樣本來源于黑龍江省查哈陽地理標志稻米保護區,依據五點采樣法在保護范圍內進行隨機采集,樣本數為30個,稻谷品種主要為龍粳26、龍粳29、龍粳31、綏粳4、松粳9。將收集到的稻谷樣本清洗干凈,并風干至水分質量分數14%～15%,在稻穗頂部相同位置將稻谷脫粒,后置于尼龍網袋中,儲藏在陰涼通風溫度在18 ℃左右的儲存室中,每10 d翻動1次,查看籽粒是否發生霉變。樣本共分為2組,一組為2021年的稻谷樣本(簡稱2021年樣本),另一組為儲藏1年后的2021年稻谷樣本(簡稱儲藏樣本)。

甲醇(色譜純)、吡啶(純度≥99.9%);N,O-雙(三甲基硅)三氟乙酰胺[N,O-bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide,BSTFA,含1%三甲基氯硅烷]、甲氧基胺鹽酸鹽(純度98%)。

1.2 儀器與設備

7890A/5975C GC-MS,色譜柱HP-5 ms(30 m×0.25 mm,0.25 μm),DHG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱,恒溫箱,TGL-16B臺式離心機。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

為確保實驗結果的準確性,在相同時間和條件下檢測了2021年樣本和儲藏樣本。將2021年樣本用液氮淬滅以終止代謝活動,并于-80 ℃下儲存,1年后與儲藏樣本一起分析。樣本制備參考Feng等[28]的方法進行:將稻谷籽粒用液氮研磨后稱取粉末50 mg,加入800 μL甲醇,并加入10 μL內標(2.9 mg/mL二氯苯丙氨酸),渦旋混勻30 s,而后置于4 ℃離心機中,12 000 r/min離心15 min,吸取200 μL上清液,轉入進樣小瓶中氮氣吹干。衍生化:稱取20 mg甲氧胺鹽酸鹽溶于1 mL吡啶,取30 μL甲氧氨鹽酸吡啶溶液至濃縮后的樣品中,并渦旋混勻至完全溶解,置于37 ℃恒溫箱90 min,取出后加入30 μL BSTFA,置于70 ℃烘箱60 min,取出后待檢測。

1.3.2 GC-MS條件

色譜柱:Agilent J&W Scientific HP-5ms(30 m×0.25 mm,0.25 μm);升溫程序:初始溫度80 ℃,維持2 min,以10 ℃/min升溫至320 ℃,并維持6 min;高純氦氣(純度大于99.999%)作為載氣,不分流進樣,進樣量1.0 μL。進樣口溫度280 ℃,電子電離源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃。采用全掃描模式,檢測范圍50～550m/z。

1.3.3 代謝物的定性

根據保留時間及質核比(m/z)在Fiehn數據庫中查找與其匹配的物質,獲得定性物質原始數據。定性物質與標準數據庫物質之間的匹配程度被用作相似性的指標,最佳分數是1 000分,分數越接近1 000表示定性物質更準確。

1.3.4 數據分析

通過G1701MSD ChemStation軟件(E.02.00.493)將定性獲得的原始數據轉換成netCDF格式,利用R(v3.3.2)軟件提取特征峰并進行預處理,得到具有質核比、保留時間、峰面積等信息的數據矩陣和總峰面積歸一化處理,保證不同量級的數據能夠進行有效比較;通過SIMCA軟件(V14.1)進行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)及置換檢驗等多元統計分析。

通過層次聚類分析對數據集進行縮放,同時對樣本和代謝物進行雙向聚類。差異代謝物篩選以學生t檢驗的P值小于0.05,同時OPLS-DA 模型以VIP >1為標準。差異代謝物層次聚類分析對分析得到的差異代謝物進行定量值計算歐式距離矩陣,以完全連鎖方法對差異代謝物進行聚類,并以熱力圖進行差異可視化展示。

KEGG注釋以及代謝通路分析將差異代謝物在Pathway數據庫進行檢索,找到所有差異代謝物參與的通路后,通過差異代謝物對 KEGG、PubChem 等權威代謝物數據庫進行映射,在取得差異代謝物的匹配信息后,對對應物種Oryzasativajaponica的通路數據庫進行搜索和代謝通路分析,從而找到與代謝物差異相關性最高的關鍵通路。

2 結果與分析

2.1 代謝產物定性結果

對GC-MS原始數據進行處理,在2021年樣本(2021CHY)和儲藏樣本(ZCCHY)中分別檢測出318和332個峰。從圖1a和圖1b的2組稻谷樣本的典型離子流色譜圖中可以看出,與2021年樣本相比,儲藏樣本在12.5～17.5 min時峰數明顯增多,7.5～10.0 min、20.0～22.5 min的峰值明顯增加。

利用Fiehn數據庫對代謝物進行定性,2021年樣本與儲藏樣本分別定性出147和148個的代謝產物,2組樣本共定性到174個代謝產物。代謝物詳細情況見表1。

由表1可知,2組樣本同時存在的代謝物121個,在2021年樣本中沒有而在儲藏樣本中存在的代謝物有27個,在2021年樣本中存在而儲藏樣本中不存在的代謝物有26個。雖然2組樣本定性到的代謝物數量相差不大,但各組分代謝物有所改變并且所占比例存在一定差異。在儲藏后糖類及其衍生物在全部代謝物的占比由27.21%減少至27.03%,脂肪酸及其衍生物占比由22.45%減少至20.27%,醇類物質由10.20%減少至9.46%,氨基酸及其衍生物由7.48%減少至7.43%,醛類物質由3.40%減少至2.70%,胺類物質由2.72%增加至3.38%,酚類物質由6.12%增加至8.78%,其他物質(酸、吡啶、嘌呤、腈、酮、烷烴、未知物)由20.41%增加至20.95%。有研究表明,氨基酸大致可分為苦味氨基酸、鮮味氨基酸和甜味氨基酸,天冬氨酸屬鮮味氨基酸在儲藏后產生,蘇氨酸屬甜味氨基酸并在儲藏后消失,儲藏前后2種氨基酸種類的變化可能會導致稻米的滋氣味發生改變[29]。儲藏后脂肪酸及其衍生物的數量減少,可能是儲藏過程中脂肪酸出現代謝轉化情況,花生四烯酸是人體的一種必需脂肪酸,可從2種途徑進行補充,一種是通過亞油酸轉化而獲得,另一種是通過食物來獲得[30,31],在儲藏后未檢測到該物質。糖類是谷物重要的營養成分之一[32],對稻米的食味品質也具有一定影響,儲藏后該類物質數量占比稍微減少,說明儲藏過程中糖類物質也發生了代謝。脂肪酸是谷物品質好壞的重要指標[33,34],長時間的儲藏會使脂肪酸發生氧化,從而產生酚類、酮類、醇類和酸類等物質,造成口感以及氣味上的劣變,使稻谷的品質降低[35]。儲藏后稻谷的脂肪酸類物質數量減少較多,而酚類、胺類以及其他物質增加較多,說明脂肪酸類物質可能發生了氧化、分解等過程。醛類物質數量上減少較多,醛類對稻谷滋氣味也具有較大影響,說明儲藏后稻谷的滋氣味發生了改變。

圖1 典型樣本離子流色譜圖

表1 查哈陽地區代謝物定性結果

2.2 多元統計分析

圖2 21CHY與ZCCHY對比的PCA模型得分散點圖

圖3 21CHY與ZCCHY對比的OPLS-DA模型得分散點圖

圖4 21CHY與ZCCHY對比的OPLS-DA模型的置換檢驗結果

2.3 差異代謝物的篩選和聚類分析

采用OPLS-DA模型的VIP值(閾值>1)與學生氏t檢驗的P值(閾值≤0.05)相結合的方式來篩選差異代謝物。通過保留時間等條件與Fiehn數據庫中的物質進行匹配,從而進行物質差異性代謝物的定性,差異代謝物定性結果如表2所示,共篩選出39個差異代謝物。

差異代謝物是指2021年樣本和儲藏樣本中同時存在,但是含量上存在較大差異的代謝物。由表2可知,2021年樣本與儲藏樣本相比,差異代謝物含量下降的有30個,含量上升的有9個。差異代謝物含量相對下降的代謝物中脂肪酸及其衍生物4個,糖類及其衍生物3個,其他類物質2個。差異代謝物含量相對上升的代謝物中脂肪酸及其衍生物5個,糖類及其衍生物4個,氨基酸及其衍生物3個,醇類及其衍生物3個,胺類物質2個,酚類物質2個,其他類物質11個(酸類物質2個)。數據表明,儲藏過程中各類代謝物的含量都會發生顯著變化。脂肪對于提升稻米食味品質具有積極影響,較高脂肪含量的稻米蒸煮后,各項食味評價指標表現均較佳[36]。但在稻米的儲藏過程中,脂肪在環境作用及相關酶的影響下,會發生酸變,最終導致稻米陳化,品質下降[37]。趙卿宇等[38]研究發現,葡萄糖和果糖等單糖與味感得分呈強負相關,在差異代謝物中發現葡萄糖在儲藏后顯著增加,這可能是稻谷在儲藏后口感變差的原因之一;氨基酸的含量不同,會導致大米味感和品質存在差異,而大米味感特征是多種呈味物質綜合反映的結果,這些物質之間存在協同性與制約性,一種物質的增多或減少會引起其他物質味感特征強度的變化。脂肪酸在自動氧化時會產生多種氧化產物,例如酚類、酮類、醇類和酸類等,這些氧化產物會產生特殊的氣味,導致食物品質發生劣變[39],在油脂酸敗后,醛類物質是特殊氣味的主要成分[38]。外觀品質是稻米商業價值的重要參考之一,是指糙米或者精米的外表物理特性,包含堊白、透明度、粒形等評價指標[40]目前發現脂肪含量高的稻米表現出油質鮮明的特征[41]且脂肪含量與稻米粒長、粒寬、長寬比呈顯著的正相關關系[42]。在儲藏后脂類氧化物的含量顯著增加,這可能與稻谷品質的劣變有關。儲藏可使得稻米中代謝產物含量發生顯著變化,且不同種類代謝產物含量的變化與品質的劣變具有顯著的相關性。

表2 2021年樣本與儲藏樣本的差異代謝物列表

差異代謝物之間可能在代謝通路中受到同一個代謝通路的正、負調控,從而在2組樣本中表達出相同或者相反的特征。層次聚類分析可以將具有相同特征的代謝物進行歸類,進而發現2組樣本間含量變化情況。

圖5為2021年查哈陽樣本與儲藏樣本的層次聚類分析熱圖。共有60個樣本,2021年樣本和儲藏樣本各30個,分別位于圖5的左側和右側?？梢钥闯?2021年樣本和儲藏樣本兩區域均可以分成4個部分,一部分為各樣本的前9個差異代謝物,下面30個差異代謝物在各樣本區域可分成左中右3個部分。在前9個差異代謝物中,2021年樣本在儲藏后其區域顏色由低表達變成高表達。下面30個代謝物分成的區域中,2021年樣本的左側和右側區域在儲藏后其區域顏色均由高表達變成低表達,而中間區域在儲藏后無明顯的變化。從整體上來看,代謝物的高、低表達區域發生對調,即儲藏后稻谷的代謝物含量發生逆向的轉變。代謝物含量的變化,可能與稻谷品質相關。未知物85、未知物87和未知物117相鄰,聚類到甘油、松柏醇和環己胺,說明這3個未知物可能屬于中間衍生物類物質。未知物441處于二十四烷左右,說明未知物441可能為烷烴類物質。

注:圖中橫坐標代表不同實驗分組,縱坐標代表該組對比的差異代謝物,不同位置的色塊代表對應位置代謝物的相對表達量,紅色表示該物質在所在組含量高表達,藍色表示該物質在所在組含量低表達。A為3-(4-羥基苯基)丙酸鄰苯甲酸。圖5 21CHY與ZCCHY對比的層次聚類分析熱力圖

2.4 差異代謝物的代謝通路分析

通過KEGG檢索后,篩選出差異代謝物參與的代謝通路共15條,分別為稻谷代謝途徑(Refseq),脂肪酸生物合成、ABC轉運蛋白、戊糖和葡萄糖醛酸交換、半乳糖代謝、嘌呤代謝、嘧啶代謝、單抗生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、苯丙氨酸代謝、β-丙氨酸代謝、甘油脂代謝、泛酸和輔酶A生物合成、硫代謝和次生代謝產物的生物合成。通過對應物種Oryzasativajaponica的通路數據庫進行搜索和代謝通路分析,最終篩選出與代謝物差異相關性最高的8條通路,分別是脂肪酸生物合成、硫代謝、β-丙氨酸代謝、甘油酯代謝、泛酸鹽和輔酶A生物合成、半乳糖代謝、嘧啶代謝和嘌呤代謝,并有5個代謝物命中這8條代謝通路,分別為棕櫚油酸、月桂酸、硫酸鹽、脲基丙酸和甘油。詳細信息見表3。

氣泡的顏色代表富集分析的P值(取負常用對數),顏色越深P值越小,富集程度越顯著,即氣泡顏色越深說明對兩組稻谷樣本有越大的影響。由圖6可知,脂肪酸生物合成的氣泡顏色最深,硫代謝、β-丙氨酸代謝、甘油酯代謝以及泛酸鹽和輔酶A生物合成的氣泡次之,半乳糖代謝、嘧啶代謝和嘌呤代謝顏色相對較淺。與這8個途徑相關的5個代謝物中,棕櫚油酸、脲基丙酸和月桂酸都是脂肪酸,甘油和硫酸鹽是中間衍生物,并且棕櫚油酸、脲基丙酸、月桂酸和甘油均屬于脂類,說明儲藏對稻谷脂類物質有重要影響。

表3 2021年樣本與儲藏樣本的差異代謝物列表

圖6 通路分析氣泡圖

脂肪酸生物合成途徑會消耗ATP,合成超長鏈脂肪酸而存在某些種子油中或位于種子表面,從而保護種子防止食草性昆蟲侵蝕以及抵御環境破壞(霜凍、紫外線迫害、干旱)等方面發揮重要作用[43]。在此途徑中棕櫚油酸作為一種抗低溫脂肪酸,在溫度變低的情況下其含量會有所增加[44],稻谷生長溫度大致25 ℃左右,而儲藏室溫度為18 ℃。這與本實驗檢測的結果一致。綜合看來,脂肪酸在稻谷儲藏過程中受到的影響最大,即脂肪酸代謝與儲藏中稻谷品質變化的影響具有較大的相關性。

3 結論

基于GC-MS代謝平臺對儲藏前后的稻谷樣本進行研究,可從內源代謝產物的角度分析儲藏對稻谷代謝及其品質的影響。研究發現,儲藏對代謝物的數量影響不大,但對代謝物種類比例具有較大影響。在含量上,儲藏對稻谷代謝產物的影響很大,其中對脂類物質影響最大,棕櫚油酸、脲基丙酸、月桂酸、甘油和硫酸鹽這5個代謝產物是導致稻谷品質劣變的重要代謝產物,可作為進一步靶標代謝組學的主要目標物。層次聚類分析表明,儲藏后稻谷樣本代謝物含量會發生反向變化,即高變低、低變高。代謝通路分析結果顯示,儲藏對脂類物質的代謝的影響最顯著。因此,儲藏會使代謝物的數量、代謝物的含量以及各類代謝物所占比重發生變化,這些變化與稻谷品質劣變有較大相關性。