鹽酸安羅替尼聯合多西他賽對肺癌大鼠血小板凝聚、EGFR-STAT3信號通路及抑瘤作用研究

楊菊菊 詹莉瓊 崔偉建 任中海

肺癌近年來患病率居高不下,疾病期腫瘤細胞此時可釋放凝血酶增強血小板聚集功能[1]。而STATs家族在細胞生長、凋亡過程中具有調控作用,其中信號轉導與轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)與肺癌間關系密切,可通過表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)-STAT3信號轉導機制發揮作用。對于晚期的患者而言臨床主要采用化療治療[2]。多西他賽為一種半合成衍生物和抗微管藥物,可參與腫瘤DNA、RNA及蛋白合成調控,還在微管調節中維持機體穩定性[3]。安羅替尼屬多靶點酪氨酸激酶抑制劑,可在調控表皮生長因子受體及其他相關因子的同時阻止腫瘤細胞惡性增殖,且在結直腸癌、胃癌、肺癌等疾病治療中具有良好效果[4-6]。由此,本文展開對鹽酸安羅替尼與多西他賽聯合應用于肺癌中的治療作用。

資料與方法

一、實驗對象

1. 實驗大鼠

選取清潔級Wistar大鼠雄性50只,體重120～160g,4～6月齡,均由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供,動物合格證號:SCXK(黑)2008004,動物常規飼養于我院實驗動物中心,適應性喂養1周后進行實驗。

2. 儀器與試劑

多西他賽(江蘇恒瑞 醫 藥 股 份有限公司,批準文號:國藥準字H20163032;鹽酸安羅替尼(正大天晴藥業集團股份有限公司,規格:12mg,國藥準字:H20180004);ADP腺苷二磷酸(批號:STY5020223);全自動生化分析儀(上海聚慕醫療器械有限公司,貨號Atellica CH930);電子天平(北京賽多斯儀器系統有限公司,型號:BS-124s );正置型金相顯微鏡(上海光學儀器廠,型號:SG-51);放射免疫分析測定盒(上海信裕生物科技有限公司,貨號:xY-10094);電泳儀(武漢純度生物科技有限公司,貨號:CD-11255-ML);流式細胞儀(杭州昊鑫生物科技股份有限公司,貨號:HY-15941);熒光定量PCR試劑盒(上海撫生實業有限公司,貨號FS01P1361)。

二、方法

1. 肺癌大鼠模型建立

除健康組10只外其余均建立肺癌大鼠模型。造模前3d為防止大鼠的肺組織發生炎癥及感染現象均適當給予青霉素和鏈霉素進行干預。將大鼠麻醉處理后,用橡皮筋固定四肢于實驗板上,自劍突下沿腹正中剪去體毛,逐層開腹暴露大鼠腹腔在肺部注射0.5mL的1×107個/ mL A549細胞,待腫瘤直徑長約1cm為建模成功,造模后1周開始后續實驗。

2. 分組與給藥

將50只大鼠隨機分為健康組、模型組、鹽酸安羅替尼組、多西他賽組、聯合組,平均10只/組,建模后,健康組與模型組大鼠采用等量生理鹽水灌胃干預;多西他賽組采用在大鼠靜脈注射多西他賽0.3mg/kg(按體表面積折算約為臨床推薦劑量的1/50);鹽酸安羅替尼組依據體表面積進行換算,采用鹽酸安羅替尼1.2 mg/kg灌胃治療;聯合組予以鹽酸安羅替尼聯合多西他賽聯合干預治療,在靜脈注射0.3mg/kg多西他賽注射液的同時予以鹽酸安羅替尼1.2 mg/kg灌胃治療,均1次/d,連續干預30d。

三、檢測指標

1. 血小板凝聚檢測

取5mL抗凝血液樣本1000 r/min離心15 min,取上層液得到富血小板血漿予以試驗。將吸取富血小板血漿后剩余血液繼以3000 r/min 離心10 min,取上清液,將血小板計數為(10～100)×1010個/L,分別精密吸取各組每只大鼠血漿和富血小板血漿各300 μL 加入測試容器內,將血漿透光率調至100%,將富血小板血漿37 ℃溫育 1min ,加入0.155 μmol/L濃度的誘導劑ADP溶液10 μL,在分析儀中依據試劑盒說明對血小板聚集率進行分析檢測。

2. 腫瘤體積變化

取出大鼠肺組織上的腫瘤并對瘤體體積進行測量,計算公式為瘤體體積(cm3)=(長度×寬度)2/2,統計腫瘤數量,對腫瘤進行拍照。

3. HE染色

腹腔麻醉處死大鼠,并取大鼠肺組織標本,采用100 g /L中性甲醛固定后,石蠟包理,5μm厚連續切片,進行常規HE染色,以觀察肺組織病理改變。

4. 免疫印跡檢測表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、信號轉導與轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)蛋白

采用RIPA裂解液提取肺組織蛋白質,BCA法對蛋白定量處理,上樣-電泳-轉膜后采用脫脂牛奶進行封閉處理,加兔抗大鼠 EGFR(1 ∶700)、兔抗大鼠STAT3 ( 1 ∶1000 )、兔抗大鼠β-actin (1 ∶2000),4℃孵育過夜,將膜洗滌,加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1 ∶2000),37℃孵育1h,采用化學發光法顯色后于暗室內曝光,經圖像分析軟件掃描取得目標蛋白吸光度值,以β-actin為內參。

5. qRT-PCR檢測EGFR、STAT3 mRNA表達

采用 TRIzol 試劑提取肺組織總RNA,溶解于無RNase水后,使用紫外分光光度計檢測樣本總RNA,根據逆轉錄試劑盒說明的方法對cDNA進行合成。序列由上海生工生物工程公司合成。取10 μL逆轉錄產物,于熒光實時定量儀上進行循環反應,用2-△△Ct值法,以β-actin作為內參照定量EGFR、STAT3 mRNA 水平(見表1)。

表1 引物序列

四、統計學分析

采用Graphpad Prism8軟件對本次研究結果進行統計學分析,實驗數據符合正態分布,采用均值±標準差表示,多組間比較采用方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、各組大鼠血小板凝聚情況比較

與健康組比較,模型組大鼠的血小板聚集率顯著升高(P<0.05);與模型組比較,鹽酸安羅替尼組和多西他賽組大鼠的血小板聚集率顯著降低(P<0.05);與鹽酸安羅替尼組和多西他賽組比較,聯合組大鼠的血小板聚集率顯著降低(P<0.05)(見表2)。

表2 各組大鼠血小板凝聚情況比較

二、各組腫瘤體積變化

模型組大鼠的腫瘤體積較高,與模型組比較,鹽酸安羅替尼組和多西他賽組大鼠的腫瘤體積顯著降低(P<0.05);與鹽酸安羅替尼組和多西他賽組比較,聯合組大鼠的腫瘤體積顯著降低(P<0.05)(見表3,圖1)。

圖1 腫瘤體積變化

表3 各組大鼠腫瘤體積表達

三、HE染色

健康組大鼠肺組織生長良好,無明顯損傷及病變反應,無上皮細胞脫落;模型組大鼠肺組織肺部病變明顯,滲出減少,肺泡間隔水腫增寬,癌細胞擴張及小血管充血擴張明顯,局部分布大量條索狀、旋渦狀病灶;鹽酸安羅替尼組及多西他賽組大鼠肺組織仍可見部分纖維素樣滲出同時伴隨局部肺泡塌陷;聯合組大鼠肺間質水腫明顯改變,癌細胞明顯減少,病變明顯改變,僅存在少量小血管擴張充血及局部充血擴張改變(見圖2)。

圖2 肺組織 HE染色結果(×200,標尺=50μm)

四、各組大鼠肺組織中EGFR、STAT3蛋白比較

與健康組比較,模型組大鼠肺組織中EGFR、STAT3蛋白顯著升高(P<0.05);與模型組比較,鹽酸安羅替尼組和多西他賽組大鼠肺組織中EGFR、STAT3蛋白顯著降低(P<0.05);與鹽酸安羅替尼組和多西他賽組比較,聯合組大鼠肺組織中EGFR、STAT3蛋白顯著降低(P<0.05)(見表4,圖3)。

圖3 肺組織蛋白檢測

表4 各組大鼠肺組織中EGFR、STAT3蛋白比較(n=10)

五、各組大鼠肺組織中EGFR、STAT3 mRNA比較

與健康組比較,模型組大鼠肺組織中EGFR、STAT3 mRNA顯著升高(P<0.05);與模型組比較,鹽酸安羅替尼組和多西他賽組大鼠肺組織中EGFR、STAT3 mRNA顯著降低(P<0.05);與鹽酸安羅替尼組和多西他賽組比較,聯合組大鼠肺組織中EGFR、STAT3 mRNA顯著降低(P<0.05)(見表5)。

表5 各組大鼠肺組織中EGFR、STAT3 mRNA比較(n=5)

討 論

肺癌發病率居于全球惡性腫瘤的前列,對人類健康造成較大威脅[7-9]。多數患者在發現時已處于晚期階段,以鉑類雙藥聯合干預的化療方案通常為該類型疾病治療的優選方案,同時在以多西他賽、鹽酸安羅替尼為主的二線化療方案也正在逐步應用于臨床的治療當中。但相關研究提示,在臨床治療上單一使用多西他賽臨床效果并不顯著,患者的遠期生存情況也不甚理想[10]。因此,如何優化和提升二線化療方案的治療效力、增強治療效果,以及提高晚期肺癌患者的預后,是現階段關注的熱點問題,并且也正在成為當前臨床研究的主要方向。

肺癌的產生和轉移均與血栓形成具有重要聯系。血小板聚集功能通常代表著血小板之間的相互聚集能力,血小板根據這種性能不僅可進一步發揮其在機體中的凝血和止血功能,同時也會導致血栓形成[11]。本文研究結果顯示,肺癌大鼠的血小板聚集率相對較高,在經藥物干預后血小板聚集率均有所降低,其中以鹽酸安羅替尼聯合多西他賽治療后血小板聚集率降低的最為顯著。由于已經形成的腫瘤血栓因子在把腫瘤細胞包圍后大大削弱了細胞因子的免疫活性,并在一定程度上避免了血液流量對其的清除效力。而當癌栓因子進入小血管后便可進一步產生轉移效應,而分析其產生的關鍵使動因素則是血小板的黏附功能。鹽酸安羅替尼通常與部分血管因子受體進行特異性結合進而抑制腫瘤新生血管的不斷生成并降低其密度。而采用多西他賽與安羅替尼二者聯合使用能夠通過抑制機體內血小板的大量粘附,使胞中的內容物不再匱乏,進而削弱血小板的聚集、粘附狀態,并通過釋放部分內容物改善疾病引起的機體疲軟狀態。且有學者在研究中指出,多西他賽聯合安羅替尼在晚期非小細胞肺癌的治療中不僅對于延長患者生存壽命效果理想,還對抑制腫瘤疾病的惡性發展具有重要意義[12]。同時,另有研究表示,使用多西他賽聯合其他藥物用于晚期肺癌患者的治療,不僅能夠明顯提高患者的遠期治療效果,還在改善患者的預后生存方面作用良好,且臨床安全性也較高[13]。

肺癌產生時由于肺部常會生成大量的炎癥因子及相關生長因子,引起成纖維細胞增生與轉化,刺激腫瘤的惡性生長。本文結果顯示,經藥物干預后肺癌大鼠的腫瘤體積減小,其中以鹽酸安羅替尼聯合多西他賽組腫瘤體積減小的最為顯著。安羅替尼不僅吸收能力迅速還能強化抑制腫瘤細胞增殖的相關酶活性,阻斷部分下游信號異常傳導。而多西他賽可與微管特異性結合維持微管雙聚體裝配穩定,阻礙微管網狀結構重組,阻滯腫瘤細胞不斷裂解[14]。但也有報道指出,單一使用多西他賽對疾病緩解效力仍有限,且長期用藥也會伴隨毒副作用[15]。而鹽酸安羅替尼聯合多西他賽可在協同作用基礎上相互補充,有效抑制腫瘤血管惡性增長。有研究發現,安羅替尼聯合多西他賽在晚期非小細胞肺癌治療中作用良好,對延長患者預后生存具有重要意義[16]。以往研究表示,腫瘤細胞分化、增殖過程與信號傳導通路相關,因此,對促進腫瘤生長的相關信號通路采取一定干擾、阻斷措施可在一定程度上發揮良好的抗腫瘤作用[17]。EGFR作為表皮生長因子受體家族中一員,當與表皮生長因子或轉化生長因子-α等配體相結合后會發生部分改變,使同源/異源二聚體形成。同時由于磷酸化C端的氨基酸殘基的影響,進一步激活了EGFR的活性以及細胞內PI3K-AKT、JAK-STAT等多種下游信號參與腫瘤細胞的增殖過程當中[18]。本文研究結果顯示,肺癌大鼠肺組織中EGFR、STAT3蛋白及mRNA均較高,經藥物干預后,各組的EGFR、STAT3蛋白及mRNA均有所降低,其中以鹽酸安羅替尼聯合多西他賽組降低的最為顯著。臨床中多西他賽能發揮對癌細胞微管蛋白的聚集/解聚反應調節,并形成相對平穩的非功能微管蛋白束,達到抑制癌細胞生成目的。以往研究表明,多西他賽在多類晚期腫瘤中是較有效的支持性藥物,可延長患者生存期[19-20]。二者協同作用可能通過下調STAT3及抑制EGFR阻斷下游相關信號異常激活,起到抑制疾病發展的目的。由此可見,二者聯合應用可發揮協同效應,即聯合下調EGFR及STAT3,逆轉癌細胞耐藥機制。但對二者完全阻斷的具體機制還需進一步研究。

綜上所述,鹽酸安羅替尼聯合多西他賽對于改善肺癌時期的血小板凝聚功能、下調EGFR-STAT3信號通路以及抑制腫瘤生長等方面均具有一定的效用,可在一定程度上提升治療效果。