miR-26b-5p靶向VEGF抑制非小細胞肺癌A549細胞增殖、遷移和侵襲的機制研究

柳鑫 姜曉麗 馬雪梅

肺癌作為最常見的惡性腫瘤,是導致全世界癌癥患者死亡的主要病因[1]。由于癌癥轉移以及術后復發等因素的存在,肺癌的臨床綜合療效仍不理想,晚期患者的病死率依然很高。隨著高通量測序技術的發展,越來越多的證據顯示微小RNA(microRNA,miRNA)可作為抑癌或者致癌因子參與肺癌的生物學進程的調控[2,3]。近年來,miR-26b-5p在多個癌種中被報道表達下調,并且miR-26b-5p的低表達與癌癥的增殖、分化以及上皮間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)等過程關系密切[4,5],然而其在非小細胞肺癌中的作用尚不明確。本研究通過生物信息學預測miR-26b-5p可能存在靶向結合關系的基因,過表達miR-26b-5p并分析其對NSCLC細胞生長、遷移和侵襲能力的影響,以期為非小細胞肺癌的診治提供新思路。

資料與方法

一、實驗材料與試劑

人正常肺上皮細胞BEAS-2B和非小細胞肺癌細胞A549,購于武漢普諾賽生命科技有限公司。DMEM培養基購于美國Gibco公司,胎牛血清購于美國Hyclone公司,RNAiMAX轉染試劑購于美國Invitrogen公司,Matrigel膠購于美國Corning公司,RNAiMAX轉染試劑購于美國Invitrogen公司,CCK-8試劑盒和EDU試劑盒購于北京索萊寶公司,一抗購于美國Santa Cruz公司及CST公司,二抗購于美國CST公司。

二、實驗方法

1. 細胞培養及轉染 BEAS-2B和A549細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基,37℃,5%CO2生化培養箱中傳代培養,細胞融合度達85%時,30%胰蛋白酶消化傳代。取對數生長期的細胞進行后續實驗。轉染前一天將細胞消化后鋪入六孔板中,24h后待細胞融合度達到60%左右時即可開始轉染,分為NC- mimic組和miR-26b-5p- mimic組,按照RNAiMAX轉染試劑說明書進行轉染。

2. qRT-PCR檢測 收集各組細胞,總RNA提取采用Trizol法,于-80℃保存。按照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄,然后以cDNA為模板進行PCR擴增。引物序列如下:miR-26b-5p:上游引物TATCTAGACATCTGCTACCTCCTCCC,下游引物ATGCGGCCGCGATTCAACAAGGACAA;U6:上游引物 TCACTTCCTATCGGATCGGC,下游引物 CTGTACCGACAAAAACACAAGC;GAPDH:上游引物TGTGGGCATCAATGGATTTGG,下游引物ACACCATGTATTCCGGGTCAAT;VEGF:上游引物GCAGAAGGAGGAGGGCAGAATC,下游引物ACACTCCAGGCCCTCGTCATT。

3. Western Blot實驗 收集各組細胞,總蛋白提取采用RIPA裂解法,蛋白濃度檢測采用BCA法,檢測后加入5×loading buffer進行蛋白變性。變性后蛋白進行SDS-PAGE電泳、轉膜、5%脫脂牛奶封閉、 孵育一抗、孵育二抗、顯影。采用image J軟件對蛋白條帶進行灰度分析,目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。

4. CCK8實驗 在96孔板中接種各組細胞,接種密度為每孔2000個細胞,加入培養液100uL/孔。將96孔板放置在37℃的細胞培養箱中,在細胞培養的不同時間點(1d、2d、3d),每孔分別加入10μL的CCK8試劑,孵育2h后,讀取各組細胞在波長450nm處的吸光度(OD值)。記錄數值并重復三次,以時間為橫坐標,OD值為縱坐標繪制曲線,觀察細胞增殖能力的改變。

5.EDU實驗:提前將細胞爬片放置于24孔板中,每孔接種3×104個細胞,培養24h;將試劑盒中的EDU工作液與完全培養基按照1 ∶1000的比例混合,每孔中加入400μL混合液,置于CO2恒溫培養箱中靜置2h;棄去混合液,將細胞室溫下固定,每孔加入400μL 4%多聚甲醛,固定15min;棄去多聚甲醛,每孔加入400μL BSA,每次洗滌3min,共3次;棄去BSA,每孔加入400μL 0.3% Triton X-100,孵育15min;棄去0.3% Triton X-100,每孔加入400μL 3%BSA,每次洗滌3分鐘,共2次;EDU檢測:去除上一步的3%BSA,每孔加入已配制好的EDU檢測液200μL (按照碧云天試劑盒進行配置),避光條件下孵育30min;棄去EDU檢測液,每孔加入400μL 3%BSA,每次洗滌5min,共3次;細胞核染色:棄去3%BSA,每孔加入200μL 1×Hoechst染色液,避光染色10min;棄去Hoechst,每孔加入400μL 3%BSA進行洗滌,每次洗滌3分鐘,共3次,取出細胞爬片,抗熒光淬滅劑封片后進行熒光拍照。

6. 細胞劃痕實驗 提前在6孔板背面用marker筆畫線標記,當細胞長滿時,用1mL無菌槍頭劃線,于0h和24h進行拍照并測量劃痕距離。

7. Transwell小室實驗 用無血清DMEM按照1 ∶9比例稀釋Matrigel基質膠,取50μL加入Transwell小室內,37℃孵育2h。Transwell小室加入500μL 10%DMEM,上室加入100μL無血清的細胞懸液。培養24h后,4% 多聚甲醛固定30min,0.5%結晶紫染色15min,PBS沖洗3次,用棉簽將Transwell上室細胞擦除,顯微鏡下觀察細胞并計數。

三、統計學分析

本次研究采用SPSS 20.0統計軟件對所得數據進行分析;定量資料用均數±標準差表示,兩組間比較采用t檢驗。所有實驗至少獨立重復三次,P<0.05為有統計學意義。

結 果

一、 miR-26b-5p 和VEGF mRNA在BEAS-2B細胞和A549細胞中的表達情況

采用qRT-PCR檢測人正常肺上皮細胞BEAS-2B細胞和人非小細胞肺癌細胞系A549細胞中miR-26b-5p和VEGF mRNA的表達水平。分析結果顯示,miR-26b-5p表達水平在A549細胞中顯著低于BEAS-2B細胞(t=22.08,P<0.05)(見圖1A),VEGF的mRNA表達水平在A549細胞中顯著高于BEAS-2B細胞(t=9.550,P<0.05)(見圖1B)。

圖1 miR-26b-5p 和VEGF mRNA在BEAS-2B細胞和A549細胞中的表達水平

二、 E-cadherin、Vimentin和VEGF蛋白在BEAS-2B細胞和A549細胞中的表達情況

采用Western Blot檢測人正常肺上皮細胞BEAS-2B細胞和人非小細胞肺癌細胞系A549 VEGF細胞中E-cadherin、Vimentin蛋白表達水平。分析結果顯示,E-cadherin蛋白的表達水平在A549細胞中顯著低于BEAS-2B細胞(t=4.434,P<0.05),而Vimentin蛋白表達水平和VEGF的蛋白表達水平在A549細胞中顯著高于BEAS-2B細胞(t=3.744,P<0.05;t=3.744,P<0.05)(見圖2)。

圖2 E-cadherin、Vimentin和VEGF蛋白在BEAS-2B細胞和A549細胞中的表達水平

三、VEGF為miR-26b-5p的預測靶點

通過生物信息學預測平臺RNAInter預測并發現VEGF與miR-26b-5p可能存在靶向結合關系,且結合評分很高(Confidence Score=0.8808)(如圖3所示)。

圖3 miR-26b-5p/VEGF靶向預測結合位點及評分(RNAInter)

四、構建miR-26b-5p過表達細胞模型

用NC-mimic 和miR-26b-5p-mimic轉染A549細胞48h,用qPCR驗證轉染效率。結果顯示,miR-26b-5p-mimic組中miR-26b-5p表達水平顯著高于NC-mimic組(t=12.24,P<0.05)(如圖4所示)。結果證明miR-26b-5p過表達細胞模型構建成功。

圖4 qPCR檢測A549細胞miR-26b-5p的過表達效率

五、miR-26b-5p對A549細胞的增殖活力的影響

CCK-8結果顯示,在24h、48h以及72h時,miR-26b-5p-mimic組吸光值顯著低于NC- mimic組(t=4.491,P<0.05;t=3.802,P<0.05;t=6.737,P<0.05)(如圖5所示)。提示miR-26b-5p可有效抑制A549細胞的增殖活力。

圖5 CCK8檢測過表達miR-26b-5p對A549細胞增殖活力的影響

六、miR-26b-5p對A549細胞的DNA合成能力的影響

EDU結果顯示,miR-26b-5p-mimic組細胞核中綠色熒光明顯少于NC- mimic組,表明miR-26b-5p-mimic組的DNA合成能力低于NC- mimic組(如圖6所示)。

圖6 EDU檢測過表達miR-26b-5p對A549細胞DNA合成能力的影響(×100)

七、miR-26b-5p對A549細胞的遷移能力的影響

劃痕實驗結果顯示,miR-26b-5p-mimic組在24h劃痕距離顯著高于NC-mimic組(t=10.00,P<0.05)(如圖7所示),提示A549細胞遷移能力受到抑制。

圖7 劃痕實驗檢測過表達miR-26b-5p對A549細胞遷移能力的影響

八、miR-26b-5p可有效抑制A549細胞的侵襲能力

Transwell侵襲實驗結果顯示, miR-26b-5p-mimic組侵襲細胞數(200±18.4)顯著低于NC-mimic組(323.7±50)(P<0.05)(如圖8)所示,提示A549細胞的侵襲能力受到抑制。

圖8 Transwell侵襲實驗檢測過表達miR-26b-5p對A549細胞侵襲能力的影響

九、miR-26b-5p對靶向VEGF對上皮間充質轉化相關蛋白的影響

WB結果顯示,miR-26b-5p-mimic組E-cadherin蛋白表達顯著高于NC-mimic組(t=3.640,P<0.05),而Vimentin蛋白和VEGF蛋白的表達顯著低于NC-mimic組(t=6.545,P<0.05;t=18.45,P<0.05)(如圖9所示)。

圖9 Western Blot實驗檢測過表達miR-26b-5p對E-cadherin、Vimentin和VEGF蛋白表達水平的影響

討 論

2020年世衛組織公布的全球癌癥統計分析數據顯示,肺癌以11.4%的確診率位列新發癌癥的第二位,以18%的死亡率成為癌癥患者最主要死因[6]。肺癌根據組織病理學可分為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和小細胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC),其中NSCLC的患者占比高達85%[7]?，F階段對于NSCLC的研究已經取得了一定的進展,但鑒于癌癥轉移以及術后復發等因素的存在,NSCLC的臨床綜合療效仍不理想,晚期患者的病死率依然很高。因此深入研究NSCLC的發病機制,在分子水平上探索敏感且特異的有助于NSCLC早期診斷、治療以及評估預后的生物標志物迫在眉睫。

miRNA是長度在20-24個核苷酸非編碼單鏈小分子RNA,其在細胞增殖、分化以及凋亡等多個進程中發揮著重要的調節作用[8-10]。越來越多的研究表明,miRNA的異常表達與NSCLC的發生發展密切相關。近年來,miR-26b-5p在結直腸癌[11]、甲狀腺癌[12]、膀胱癌[13]、肝細胞癌[14]等多個癌種中被報道表達下調,并且miR-26b-5p的低表達與癌癥的增殖、分化以及EMT等過程關系密切。例如,miR-26b-5p在多發性骨髓瘤中通過抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡發揮抑瘤作用[15]。也有報道稱,miR-26b-5p對肺腺癌細胞的細胞增殖具有抑制作用[16]。我們的研究表明,miR-26b-5p表達水平在NSCLC細胞系A549細胞中低表達。進一步生物學功能的實驗表明miR-26b-5p能夠抑制A549細胞的生長、遷移和侵襲,與以往的研究結論相一致。

癌細胞的增殖和轉移是導致肺癌治療失敗的主要因素[17]。與肺癌增殖轉移的相關的分子包括轉化生長因子-β(TGF-β)、microRNA-126和VEGF等,它們都可以進入血液系統參與調控癌細胞的增殖轉移[18]。VEGF是促進血管新生的主要因子,可以通過阻斷VEGF信號通路來抑制腫瘤生長[19]。Grun等[20]人成功分離出表皮腫瘤干細胞,其具有生長速度快、侵襲性高以及血管化高等特性,VEGF是其維持這種表型的關鍵因子,應用VEGF抑制劑或者沉默VEGF的表達都可以抑制其特性。還有研究顯示蜂毒素能夠通過調控VEGF信號通路下調組織蛋白酶-S來發揮抑制人肝癌細胞系MHCC97-H的細胞增殖、侵襲以及血管生成能力[21]。VEGF在多種腫瘤細胞中表達上調,預示其過表達與腫瘤進展有關,并且VEGF高表達已經確定為肺癌患者預后不良的獨立危險因素[22]。研究顯示,E-cadherin是一種細胞黏附分子,在細胞間連接和腫瘤細胞轉移過程中發揮關鍵作用[23],下調E-cadherin的表達會打破細胞間的連接,增加腫瘤細胞的侵襲和轉移能力[24]。Vimentin是上皮-間質轉化的標志性蛋白,其上調參與了腫瘤的浸潤和轉移[25]。我們的研究表明,在NSCLC細胞系A549細胞中,miR-26b-5p和VEGF存在靶向關系,其能夠負向調控VEGF的表達,進一步研究發現miR-26b-5p可以通過靶向VEGF抑制細胞的遷移和侵襲,并且降低Vimentin蛋白的表達。

綜上所述,miR-26b-5p在NSCLC細胞系A549細胞中低表達,miR-26b-5p 可通過靶向調控VEGF的表達抑制NSCLC腫瘤細胞的生長、遷移和侵襲,從而參與NSCLC的發生、發展。既往研究發現VEGF已有靶向藥物應用,如貝伐珠單抗,本研究證明了miR-26b-5p與VEGF的靶向關系以及其在NSCLC中的作用,提示miR-26b-5p也有望成為NSCLC治療的潛在靶點,這有助于評估NSCLC患者的治療反應和預后,也為NSCLC的個體化靶向治療提供新的思路。但今后還需要擴大樣本量,深入研究miR-26b-5p與VEGF信號通路的作用機制,以及miR-26b-5p自身的上游調控因子,為開發miR-26b-5p、VEGF相關的NSCLC新靶向治療提供更多實驗依據。