賴氨酰氧化酶在肺動脈高壓中的相關性研究

文浩 成孟瑜

PH是指由多種異源性疾病(病因)和不同發病機制所致肺血管結構或功能改變,引起肺血管阻力和肺動脈壓力升高的臨床和病理生理綜合征,繼而發展成右心衰竭甚至死亡,是一種嚴重的心血管疾病,目前診斷主要依賴超聲心動圖篩查,但受超聲診斷醫師經驗影響,右心導管檢查作為金標準因其有創性未能廣泛應用。有相關研究證實,賴氨酰氧化酶蛋白家族與PH的發生、發展有密切關系,本文旨在綜述近年來有關LOS在PH中的相關研究進展,以期為該病的預后評估和治療提供新思路和目標。

一、賴氨酰氧化酶蛋白家族

LOS在許多生理和病理過程中發揮著重要作用,其活性導致細胞外蛋白質的共價交聯,增加抗拉伸強度和抵抗蛋白質水解。LOS在細胞粘附和運動、形態發生、結構完整性維護、組織修復、新血管生成和血管重構、上皮-間質轉化和內皮-間質轉化中發揮著重要的生理功能[1]。在正常發育過程中表達受到嚴格的調節,異常的表達和活性在多種病理性纖維化疾病中發揮作用[2],如肝硬化、肺纖維化和心力衰竭、肺血管系統增生性和閉塞性重構、多種癌癥有關。

基于賴氨酰氧化酶基因結構上的同源和相似性,該家族分為賴氨酰氧化酶(Lysyl Oxidase,LOX)、賴氨酰氧化酶樣蛋白1(Lysyl Oxidase Like1, LOXL1)、賴氨酰氧化酶樣蛋白2(Lysyl Oxidase Like 2,LOXL2)、賴氨酰氧化酶樣蛋白3(Lysyl Oxidase Like 3,LOXL3)、賴氨酰氧化酶樣蛋白4(Lysyl Oxidase Like 4,LOXL4)。LOS在蛋白C端均具有高度保守的催化結構域,包含有賴氨酸酪氨酰醌(Lysyl-tyrosyl-quinone,LTQ)輔因子、銅結合位點及細胞因子受體樣結構域(cytokine receptor-like domain,CRL),這是蛋白質構象和催化活性所必須的。又根據可變的蛋白N末端將LOS分為LOX、LOXL1與LOXL2-4兩組。LOXL2-4在其N端有一個共同的結構,包括四個串聯重復的清除率-受體-富半胱氨酸域(scavenger receptor cysteine-rich ,SRCR),該結構域包含蛋白質-蛋白質相互作用位點。而LOX和LOXL1缺乏SRCR結構域,但在N端有一個前肽序列,該序列經過細胞外基質(extracellular matrix,ECM)中骨形態發生蛋白-1 (Bone Morphogenetic Protein-1,BMP-1)或去整合素和金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs,ADAMTS)蛋白的蛋白裂解,進而產生有活性的LOX及LOXL1[3]。LOS結構(見圖1)。

圖1 賴氨氧化酶家族結構模式圖: LOS共有一個高度保守的C端結構域,包括一個銅結合位點、LTQ和CRL,這是蛋白質構象和活性所必需的。LOX和LOXL1含有前序列,它們在分泌到細胞外基質之前被骨形態發生蛋白1切制。LOXL2-4N端均有四個串聯重復的清除率-受體-富半晚氨酸域,被認為介導細胞粘附和蛋白質相互作用

二、肺動脈高壓

PH是一種危險的心血管疾病[4],其主要特征是肺動脈的內膜增殖伴炎癥反應、內皮間質化,甚至形成向心性或偏心性改變;中膜肥厚及持續的收縮、外膜纖維化、基質重塑以及肺小血管周圍炎癥浸潤而導致其增厚、滋養血管屈曲增生形成叢狀病變;還可見病變遠端擴張和原位血栓形成,從而導致肺動脈管腔進行性狹窄、閉塞。PH發病機制復雜,是多因素、多環節共同作用的結果;包括外因(低氧、煙草、粉塵、其他理化因素)、內因(遺傳、發育、結構、疾病等)及交互因素(微生態、感染、免疫、藥物等),其發生發展涉及多種血管活性分子、多種離子通道及多條信號通路。目前的研究表明,PH的發病機制與LOS的表達和調節密切相關。本文就LOS在PH中的相關研究進行綜述,指出LOS可能是PH預后不良的生物標志物。

1. LOS在特發性肺動脈高壓中的相關性研究

Nave等[5]通過評估在特發性肺動脈高壓(idiopathic pulmonary artery hypertension, IPAH)與人表面健康的肺供體移植肺組織中LOS的mRNA及蛋白水平,發現相較于健康對照組,IPAH肺組織中的LOX、LOXL1、LOXL2、LOXL4 mRNA表達分別相對增加約9.2倍、3.9倍、2.8倍、2.2倍,LOX和LOXL2蛋白表達增加,而未觀察到LOXL3基因或蛋白表達的變化。進一步將肺血管分離,蛋白染色顯示肺血管可見5種LOS分布,IPAH肺血管中動脈平滑肌細胞增多、內彈性板破壞,LOXL2和LOXL3基因表達水平升高,LOX表達水平也有升高的趨勢,血管中未檢測出LOXL4,表明LOS的表達在IPAH肺組織以及重塑血管中是失調的。在21%氧氣濃度或10%低氧條件下培養肺動脈平滑肌細胞和外膜成纖維細胞,24小時后篩選LOX基因表達。發現在外膜成纖維細胞中,IPAH組LOX的缺氧反應比供體肺組更明顯,LOXL1、 LOXL2也有缺氧反應。肺動脈平滑肌細胞中,兩組LOX基線表達水平最高,IPAH組基線LOXL4水平升高。這些數據表明,LOS在肺血管系統的組成血管細胞類型中表達,且可以被低氧張力所調節。

內皮素-1在肺動脈高壓中的作用已被廣泛表明[6],其可通過與肺血管平滑肌細胞中的內皮素受體A和B結合,引起血管收縮,促進有絲分裂進而促進血管重塑。Maruyama等[7]通過收集7例IPAH患者移植肺中的肺動脈作為實驗組,12例術前經TTE除外PH的局限性肺癌患者的局灶肺葉切除肺中的肺動脈作為對照組進行體外培養。研究發現經內皮素-1刺激兩組肺動脈平滑肌細胞,實時熒光PCR檢測出兩組LOX表達水平均增高,但IPAH組肺動脈平滑肌細胞LOX升高水平更顯著;而經過前列環素或曲匹地爾作用后,發現實驗組升高的LOX可恢復到基線水平,而不影響對照組LOX的表達。曲匹地爾及前列環素均能通過激活PKA作用于血管平滑肌細胞發揮其作用,活化的PKA磷酸化使cAMP反應元件結合蛋白(CREB)進入細胞核。CREB通過招募幾個轉錄共激活因子增強其轉錄活性,從而控制靶基因的表達。IPAH組肺動脈平滑肌細胞對內皮素-1和曲匹地爾或前列環素反應中LOX獨特的表達模式表明IPAH中可能存在PKA-CREB通路受損。這種差異及其在PKA-CREB通路中的分子有待進一步研究。

2. LOS在系統性硬化癥相關性肺動脈高壓中的相關性研究

系統性硬化癥相關性肺動脈高壓(systemic sclerosis-associated pulmonary arterial hypertension,SSC-PH)屬于結締組織病合并的肺動脈高壓,是第一類肺動脈高壓。系統性硬化癥患者合并PH的發病率在30.51%[8],對于SSC-PH的具體機制,目前并不明確。Vadasz等[9]進行的一項多中心研究發現SSC患者血清LOX水平升高,且LOX水平和DLCO之間呈負相關,其中又根據經胸超聲心動圖篩查發現肺動脈收縮壓>40mmHg及經右心導管檢查發現合并PH的患者血清LOX水平明顯高于無PH的系統性硬化癥患者,經過3-5年隨訪發現這些LOX水平更高的患者往往死亡率或肺移植率更高。該研究從肺活檢中發現重建的肺血管的內皮細胞是其LOX的主要來源之一,且免疫熒光顯示SSC-PH組與IPAH組、對照組相比,免疫染色更強。該研究確定了LOX是SSc-PH患者嚴重程度的一個生物標志物,且與不良預后相關,這與Yoneda K的研究一致[10]。

3. LOS在先天性疾病中的相關性研究

先天性膈疝(congenital diaphragmatic hernia,CDH)是一種由于膈肌不能正常形成,腹腔臟器經缺損出疝入胸腔,造成解剖關系異常,引起一系列病理、生理變化的先天性疾病,肺血管往往合并嚴重的肺動脈高壓,總生存率為70%[11]。Monroe等[12]通過量化先天性膈疝合并肺動脈高壓(congenital diaphragmatic hernia -associated pulmonary hypertension,CDH-PH)的肺動脈主干細胞外基質的結構、成分和機械變化,發現肺動脈主干的血管厚度增加,LOX表達增加,極限抗拉強度與健康對照組25.1 MPa相比降低了13.6 MPa,表明CDH-PH組肺動脈主干ECM結構發生紊亂。LOX活性的上調會導致纖維膠原和彈性蛋白交聯活性的增加,減低LOX水平后ECM結構紊亂在一定程度上得到了減輕。

4. LOS在低氧性肺動脈高壓中的相關性研究

慢性缺氧在低氧性肺動脈高壓中起關鍵的作用,其誘導大量細胞因子釋放導致肺動脈壓升高,而升高的肺動脈壓反過來誘導細胞因子,建立了一個惡性循環,加劇了其發病和進展。此外,低氧性肺動脈高壓往往由于肺血管的代償作用,不易被早期發現,死亡率較高[13]。有生物信息研究在微陣列數據集中驗證得出LOX在缺氧觸發的血管生成中通過上調血管內皮生長因子來間接發揮作用[1]。

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種常見的導致低氧性肺動脈高壓的呼吸道疾病,發病率越來越高,約30%～70%的COPD患者合并有PH,平均肺動脈壓>25mmHg者,5年生存率由62.2%下降到36.3%[15]。Migulina Nataliya等[16]發現吸煙患者及COPD患者小氣道中LOS家族有不同的表達,LOX、LOXL1、LOXL2的表達增加能夠促進小氣道膠原蛋白的交聯以及異常沉積,最終導致氣道重塑。而Besiktepe等發現通過提高LOX、LOXL1、LOXL2蛋白水平的方法可以減少COPD患者的不良肺氣腫改變[17]。

陳偉謙等[18]通過大鼠模型研究缺氧和/或高碳酸血癥時LOX以及細胞外基質膠原蛋白的交聯變化,發現缺氧條件下大鼠平均肺動脈壓、右心室/(左心室+室間隔)重量比、肺動脈血管壁面積、血管總面積均明顯高于常氧組,且肺組織LOX酶活性、mRNA及蛋白水平在肺中小動脈平滑肌肺泡上皮細胞表達均顯著高于常氧組。缺氧上調LOX表達,由此促進膠原交聯顯著增加,誘使肺動脈高壓的形成和血管結構重建。Xia Xiaodong、彭燕平也有相同的發現,除此之外研究表明,TGF-β1參與了LOX的調節,且高碳酸血癥可以抑制TGF-β1信號通路下調缺氧誘導的LOX的表達[19, 20]。低氧大鼠肺動脈LOX表達和膠原交聯呈PI3K/AKT依賴性,而LOXL1-4與該信號通路無關[21]。

低氧性肺動脈高壓小鼠在慢性缺氧條件下,除了LOX表達水平增高,肺組織及肺動脈中銅轉運蛋白CTR1、銅伴侶蛋白SOD、ATOX1的表達也增加,進而細胞內銅攝取增加,通過依賴HIF-1α機制又將導致銅轉運蛋白、銅伴侶蛋白、LOX表達增加,形成一個惡性循環[22]。

5. LOS在實驗性肺動脈高壓中的相關性研究

Nave[5]在21%氧氣濃度或10%低氧條件下分別培養小鼠,發現缺氧小鼠在低氧后3h內LOX和LOXL2的表達迅速增加且持續增加24h,(同IPAH患者肺組織中LOX及LOXL2表達增加),LOX表達在低氧暴露整個時間內持續增加,表明LOX可能在PH的發展中發揮因果作用。而通過使用LOX廣譜抑制劑β-氨基丙腈發現其減輕了低氧誘導的肺動脈高壓、肺血管重塑,減輕了對膠原蛋白的交聯及沉積,肺血流動力學改善和右室肥厚減弱。

Ariel[23]通過在定制的等雙軸拉伸器水凝膠上培養肺動脈外膜成纖維細胞進行體外實驗發現,與正常0.5kPa韌度的基質上相比,LOXL1和α-平滑肌肌動蛋白信使RNA的表達僅在3kPa韌度基質時隨著拉伸和底物硬度的增加顯著上調,而在10kPa韌度的基質上未見顯著上調。不管體內外實驗,動物或臨床實驗中,LOS的表達均證明與肺動脈壓力相關。

6. LOS在其他肺動脈高壓中的相關性研究

基質硬化與進行性肺纖維化密切相關,在特發性肺纖維化相關肺動脈高壓中LOS也存在失調,Mark G. Jones[24]發現LOS抑制劑可減少病理性的吡啶啉交聯,使膠原蛋白形態正?；?降低組織硬度并改善肺功能。而Tong X.[25]和Bei Liu等[26]在肺纖維化體外模型發現阿奇霉素、羅漢果有類似的效果,并可能通過部分抑制JNK/c-Jun和TGF-β1/Smad信號通路減少LOX、LOXL2的產生。

關于慢性血栓栓塞性肺動脈高壓(chronic thromboembolic pulmonary hypertension,CTEPH)或其他肺動脈阻塞性病變所致肺動脈高壓的相關研究報道較少,但Nave等學者研究已證實相較于健康人供體肺組織,在患者慢性血栓栓塞性肺動脈高壓肺組織中LOS表達均異常,有待進一步研究。

毛細血管前肺動脈高壓是骨髓增殖性腫瘤(myelodysplastic syndromes,MPN)包括真性紅細胞增多癥(polycythemia vera,PV)、特發性血小板增多癥(essential thrombocythemia,ET)和原發性骨髓纖維化(myelofibrosis,MF)的一種罕見且常常未被認可的并發癥,往往危及生命[27]。研究證明,LOX在MPN進展及血栓形成中發揮一定的作用[28]。MPN中腫瘤巨核細胞通過分泌TGF-β和LOX,促進骨髓纖維化。LOX氧化基質細胞和巨核細胞表面的血小板衍生生長因子受體,增強配體與受體的親和力,促進腫瘤巨核細胞的增殖。LOX增加血小板的活化和對膠原的粘附,促進血栓形成。法國PH登記處研究隨訪90名MPN患者(42例PV,35例ET,13例原發性MF),均表現為嚴重的毛細血管前肺動脈高壓PH,中位平均肺動脈壓和肺血管阻力分別為42 mmHg和6.7 WU,臨床狀況受損,71%的患者處于NYHA功能分級Ⅲ/Ⅳ級,并且中位6分鐘步行距離為310米。一半的患者被診斷為CTEPH,另一半被認為是第5類PH。MF與第5類PH的關聯性較強,而在沒有MF的PV和ET患者中通常與CTEPH相關。一半的CTEPH患者被診斷為近端病變。在18名高風險患者中進行了血栓內膜切除術,其中5人死亡。第5類PH的1、3和5年總生存率分別為67%、50%和34%,CTEPH的總生存率分別為81%、66%和42%,生存率整體不容樂觀[28]。

三、總結與展望

LOS在臨床和實驗性肺動脈高壓中均表達異常,水平直接關系到彈性蛋白和膠原的交聯以及彈性蛋白和膠原纖維的結構和穩定性,且可能作為與PH嚴重程度相關的生物標志物,有望為PH的治療提供新的思路和理論依據。關于LOS在肺動脈高壓中的作用仍需要更深入的研究,可以進一步探索LOX和LOXL的信號通路、作用機制和對肺動脈平滑肌細胞以及內皮細胞的具體作用;開發針對LOX和LOXL的新型藥物并通過建立動物體內肺動脈高壓的模型,驗證LOX和LOXL在治療中的效果等等。此外,目前現有研究中大都是對于各型肺動脈高壓在組織中的LOS表達,且以LOX居多,對于血清學中LOS表達水平仍沒有過多研究,可以進一步測定各型肺動脈高壓中LOS血清學濃度,進而分析LOS是否可以早期識別PH并且與預后相關聯。