吡格列酮調節AMPK/mTOR信號通路對肺癌A549細胞順鉑耐藥的影響

張一思 孫靜 張凡 李莉蓉 劉秀麗

肺癌是世界癌癥相關死亡的重要原因之一,其中約80%為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)[1-2]。肺腺癌屬于NSCLC,由于發病較隱匿,大多數患者確診時已發展至中晚期[3]?；陧樸K(cisplatin,CDDP)的化療方案是晚期NSCLC的標準治療策略。但CDDP耐藥嚴重影響患者生存率[4]。吡格列酮(pioglitazone,PIO)是一種胰島素增敏劑,常用于治療2型糖尿病[5]。研究發現,PIO具有抗癌癥潛力[6],且已被建議作為肺癌的化學預防藥物[7-8];但PIO對肺癌細胞化療敏感性的影響鮮有報道。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路是調節肺癌細胞CDDP敏感性的重要通路,激活此通路促進肺腺癌對順鉑治療的抵抗[9-10]。本研究將以肺癌CDDP耐藥細胞株A549/CDDP為研究對象,創新性探討PIO對肺癌細胞化療敏感性的影響,為降低肺癌化療耐藥性提供參考。

資料與方法

一、細胞

人NSCLC耐順鉑細胞株A549/CDDP購自上?？茖W院細胞庫。

二、主要試劑與儀器

吡格列酮(純度≥98%,貨號:CDS021593)購自Sigma-Aldrich公司[將PIO溶解在無菌二甲基亞砜(DMSO)中,并將儲備溶液(10 mmol/L)等分儲存在-20℃冰箱內,每次實驗前在培養基中稀釋成實驗所需濃度];AMPK激活劑-AICAR(貨號:ab120358)購自英國Abcam公司;RPMI-1640培養基、胰蛋白酶、胎牛血清購自美國Gibco公司;CCK-8試劑盒購自江蘇弘麒生物科技有限公司;Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司;Transwell小室購自Corning公司;BCA蛋白定量檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司;Bcl-2、Bax、Caspase-3、p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR一抗和相應二抗購自美國Santa Cruz公司。酶標儀(Labserv K3)購自上海沃元科技有限公司;凝膠電泳儀(DYCZ-24EN)購自北京六一生物科技有限公司。

三、細胞培養

A549/CDDP細胞培養在含體積分數為10%的胎牛血清、2 μg/mL順鉑的RPMI-1640培養基中,在37℃、5%CO2的培養箱中進行常規培養。每2-3天更換一次新鮮培養基。取生長狀態良好的對數生長期細胞用于后續實驗。

四、細胞分組與處理

將對數生長期A549/CDDP細胞以1×104個/孔的密度接種于96孔板中,待細胞貼壁后將其隨機分為對照組(Control組)、CDDP組(10 μg/mL CDDP處理24 h[11])、PIO組(10 μmol/L PIO[8])、CDDP+低濃度PIO組(CDDP+L-PIO組,10 μg/mL CDDP+5 μmol/L PIO)、CDDP+高濃度PIO組(CDDP+H-PIO組,10 μg/mL CDDP+10 μmol/L PIO)和CDDP+高濃度PIO組+AMPK激活劑AICAR組(CDDP+H-PIO+AICAR組,10 μg/mL CDDP+10 μmol/L PIO+20 mmol/L AICAR[12])。分組后進行相應處理。

五、CCK-8法測定細胞增殖能力

取按方法四處理后的A549/CDDP細胞,繼續置于細胞培養箱中培養24 h、48 h、72 h,在各時間點分別加入CCK-8試劑10 μL,繼續孵育2 h,用酶標儀檢測各組細胞在450 nm下的吸光度值(OD450)。

六、劃痕實驗檢測細胞遷移能力

取對數生長期的A549/CDDP細胞以5×105個/孔的密度接種于6孔板中,并按細胞分組與處理方法進行處理。待細胞約生長至80%,用20 μL無菌移液槍槍頭垂直畫出一道劃痕,之后用PBS洗滌細胞,加入新鮮培養基繼續培養48 h,用倒置顯微鏡觀察0 h和48 h時細胞的遷移情況,并使用Image J軟件分析計算細胞遷移率。遷移率=(0 h寬度-48 h的寬度)/0 h的寬度×100%。

七、Transwell實驗檢測細胞侵襲

在Transwell小室的底膜包被Matrigel基質膠,收集經細胞分組與處理過的A549/CDDP細胞并調整為濃度為5×105個/mL的單細胞懸液,取200 μL接種在Transwell小室中,并在下室中加入600 μL含有胎牛血清的培養基,培養24h取出小室,放置在4%多聚甲醛中固定30min,用棉簽輕輕擦去上層細胞,加入0.1%結晶紫染色20 min。利用倒置光學顯微鏡觀察穿過膜的細胞,每個小室隨機選取6個視野進行拍照,并進行細胞計數。

八、流式細胞術檢測細胞凋亡

將A549/CDDP細胞以5×104個/孔的密度接種于6孔板中,培養24 h后按細胞分組與處理方法對細胞進行相應處理。繼續培養24 h后,加入胰蛋白酶消化收集細胞,用預冷的PBS洗滌2次。加入500 μL的Binding Buffer重懸細胞,加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI于室溫下避光反應15 min。采用流式細胞儀測定細胞凋亡率。

九、Western Blot檢測細胞AMPK/mTOR信號通路和凋亡相關蛋白的表達

取對數生長期的A549/CDDP細胞將細胞分組與處理。處理24 h后,加入胰蛋白酶離心收集細胞,加入RIPA裂解液提取細胞總蛋白。根據BCA蛋白定量試劑盒操作說明對總蛋白濃度進行定量。之后經10% SDS-PAGE凝膠電泳,轉膜,加入脫脂奶粉于4℃進行封閉2 h。加入Bcl-2(1 ∶1000)、Bax(1 ∶1000)、Caspase-3(1 ∶1000)、AMPK(1 ∶1000)、p-AMPK(1 ∶1000)、mTOR(1 ∶1000)、p-mTOR(1 ∶1000)一抗于4℃下孵育過夜。次日,洗膜后加入相應二抗(1:5000)于室溫下孵育2 h,加入ECL試劑進行顯色,以GAPDH作為內參。在凝膠成像儀下進行曝光,利用Image Lab軟件對目標蛋白的灰度值進行計算分析。

十、數據統計與分析

本研究所有實驗數據采用Graph Pad Prism7.0軟件進行統計分析。實驗數據采用均數±標準差表示。多組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05認為數據差異具有統計學意義。

結 果

一、PIO抑制A549/CDDP細胞的增殖能力

如(表1)所示,與Control組相比,PIO組細胞OD450值(48 h、72 h)顯著下降(P<0.05),CDDP組無顯著性差異(P>0.05);與CDDP組相比,CDDP+L-PIO組、CDDP+H-PIO組細胞OD450值(48 h、72 h)顯著下降(P<0.05)。與CDDP+H-PIO組相比,CDDP+H-PIO+AICAR組和CDDP+L-PIO組細胞OD450值(48 h、72 h)顯著上升(P<0.05)。

表1 各組細胞增殖能力(OD450)比較(n=6)

二、PIO抑制A549/CDDP細胞的遷移能力

如(圖1)所示,與Control組相比,PIO組細胞遷移率顯著下降(P<0.05),CDDP組無顯著性差異(P>0.05)。與CDDP組相比,CDDP+L-PIO組、CDDP+H-PIO組細胞遷移率顯著下降(P<0.05)。與CDDP+H-PIO組相比,CDDP+H-PIO+AICAR組和CDDP+L-PIO組細胞遷移率顯著上升(P<0.05)。

圖1 劃痕實驗檢測細胞遷移

三、PIO抑制A549/CDDP細胞的侵襲能力

如(圖2)所示,與Control組相比,PIO組細胞侵襲數目顯著下降(P<0.05),CDDP組無顯著性差異(P>0.05)。與CDDP組相比,CDDP+L-PIO組、CDDP+H-PIO組細胞侵襲數目顯著下降(P<0.05)。與CDDP+H-PIO組相比,CDDP+H-PIO+AICAR組和CDDP+L-PIO組細胞侵襲數目顯著上升(P<0.05)。

圖2 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力(結晶紫染色,×400)

四、PIO促進A549/CDDP細胞凋亡

如(圖3)所示,與Control組相比,PIO組細胞凋亡率顯著上升(P<0.05),CDDP組無顯著性差異(P>0.05)。與CDDP組相比,CDDP+L-PIO組、CDDP+H-PIO組細胞凋亡率顯著上升(P<0.05)。與CDDP+H-PIO組相比,CDDP+H-PIO+AICAR組和CDDP+L-PIO組細胞凋亡率顯著下降(P<0.05)。

圖3 流式細胞術檢測細胞凋亡率

五、PIO抑制A549/CDDP細胞中AMPK磷酸化并促進凋亡相關蛋白的表達和mTOR的磷酸化

如(表2和圖4)所示,與Control組相比,PIO組細胞AMPK磷酸化水平、Bcl-2蛋白表達顯著下降(P<0.05),mTOR磷酸化水平、Bax、Caspase-3蛋白表達顯著升高(P<0.05),CDDP組無顯著性差異(P>0.05)。與CDDP組相比,CDDP+L-PIO組、CDDP+H-PIO組細胞AMPK磷酸化水平、Bcl-2蛋白表達顯著下降(P<0.05),mTOR磷酸化水平、Bax、Caspase-3蛋白表達顯著升高(P<0.05)。與CDDP+H-PIO組相比,CDDP+H-PIO+AICAR組和CDDP+L-PIO組細胞AMPK磷酸化水平、Bcl-2蛋白表達顯著升高(P<0.05),mTOR磷酸化水平、Bax、Caspase-3蛋白表達顯著下降(P<0.05)。

圖4 Western Blot檢測細胞AMPK/mTOR信號通路和凋亡相關蛋白的表達

表2 各組細胞AMPK/mTOR信號通路和凋亡相關蛋白的表達比較(n=6)

討 論

肺癌作為常見的惡性腫瘤之一,NSCLC是常見的肺癌類型,也是肺癌治療的重點[13]。CDDP是治療多種人類癌癥(包括NSCLC在內)的關鍵藥物,是細胞周期非特異性細胞毒藥物,其抗腫瘤作用機制主要為通過破壞DNA和誘導細胞凋亡起作用。然而,在一段時間的治療后獲得性耐藥不可避免地發展,是臨床應用的主要限制[14]。目前CDDP的耐藥機制較為復雜,研究者們主要認為可能與DNA修復損傷異常、細胞凋亡途徑的激活等有關[15]。藥物的協同組合可提高治療效果,通常用于克服耐藥性[16]。因此,提高NSCLC細胞對CDDP敏感性的新型安全組合對于成功治療至關重要。本研究以CDDP耐藥NSCLC細胞株A549/CDDP為研究對象,探究PIO對腫瘤細胞CDDP耐藥性的影響。

PIO是一種過氧化物酶增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)激動劑,已經發現PPAR-γ激活通過增加細胞凋亡來抑制肺癌細胞系的生長[17],并與NSCLC的化學耐藥性相關[18]。Kiran等[19]研究發現PIO與塞來昔布聯用能夠顯著抑制尼古丁衍生的亞硝胺酮誘導的NSCLC腫瘤細胞的生長,表明PIO聯合塞來昔布可能是有效治療NSCLC的藥物。Seabloom等[20]研究發現固定劑量的PIO與二甲雙胍聯合可以預防肺癌的發生。本研究結果顯示,與Control組相比,PIO組A549/CDDP細胞OD450值(48 h、72 h)、細胞遷移率、細胞侵襲數目、Bcl-2蛋白表達下降,細胞凋亡率、Bax、Caspase-3蛋白表達升高,且相比PIO、CDDP單獨處理,PIO與CDDP聯合應用后可進一步降低A549/CDDP細胞增殖、遷移和侵襲能力,誘導細胞凋亡。這些結果說明PIO與CDDP聯用能夠顯著提高CDDP耐藥A549細胞對CDDP的敏感性。

AMPK/mTOR信號通路在多種疾病中均發揮著重要的調節作用。AMPK是一種異源三聚體蛋白,由α催化亞基和β、γ調節亞基組成,能調控細胞的能量代謝,mTOR是AMPK的下游效應子,AMPK的磷酸化可通過抑制mTOR活化來調控細胞的增殖、凋亡[21]。Zhu等[22]研究發現致癌基因-泛素偶聯酶E2T可通過激活AMPK/mTOR信號通路誘導自噬,增加肺腺癌A549細胞的CDDP耐藥性;Wu等[10]發現順鉑可增加A549細胞中的AMPK磷酸化,伴隨著mTOR磷酸化的降低,AMPK/mTOR信號通路是參與CDDP誘導的A549和A549/CDDP細胞自噬反應的重要調節因子;以上研究表明AMPK/mTOR信號通路是調節A549/CDDP細胞CDDP耐藥的重要靶點。在本研究中,PIO可降低A549/CDDP細胞中AMPK的磷酸化水平,升高mTOR磷酸化水平,且與CDDP聯用后,AMPK的磷酸化水平進一步降低,mTOR磷酸化水平進一步升高,表明PIO能夠抑制AMPK的活化,激活mTOR;推測PIO對A549/CDDP細胞CDDP敏感性的增強作用可能與AMPK/mTOR信號通路有關。通過用AMPK激活劑AICAR來干預CDDP與PIO共同處理的A549/CDDP細胞,結果發現,AICAR減弱了PIO對A549/CDDP細胞CDDP敏感性的增強作用;提示PIO可能通過抑制AMPK的活化,激活mTOR,進而增強A549/CDDP細胞對CDDP的敏感性。

綜上所述,PIO可能通過調節AMPK/mTOR信號通路,減弱肺癌細胞的CDDP耐藥性。本研究為臨床治療中降低NSCLC患者的CDDP耐藥性提供了科學依據和參考。但本研究是在細胞水平上進行的研究,未探索其在體內的影響與機制,還需選擇其他肺癌細胞系并進一步進行相關動物試驗來驗證PIO的抗肺癌作用。